Abstract
Trex (transkripsjon /eksport) er en multiprotein kompleks som spiller en nøkkelrolle i transkripsjonen forlengelse og transport av mRNA fra kjernen til cytoplasma . Vi har tidligere rapportert rensing av den menneskelige Trex protein og fant at uttrykk for et medlem av dette komplekse, p84N5 (referert til som hTREX84 eller hHPR1), en RB bindende protein, korrelert med brysttumorstørrelse og metastasering. Her kan vi undersøke mekanismer for avvikende uttrykk for hTREX84 i bryst- og eggstokk-kreft celler og vurdere sin rolle i tumorigenesis. Vi viser at ovarietumorceller over-uttrykke hTREX84 4-gangers og 10 gangers sammenlignet med udødelige, ikke-tumorigene og primære ovarie overflate epitelceller, henholdsvis. Reduksjon av hTREX84 nivåer av små interfererende RNA føre til hemming av celleproliferasjon og G
2 /M arrest. Selv om vi observert at hTREX84 ekspresjon ble indusert ved behandling med en demetylering middel, 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC), natriumbisulfitt DNA-sekvensering og metylering spesifikk PCR fant ingen tegn på endringer i DNA-metylering i CpG øyer i regulator regionen
hTREX84
. Vi deretter identifisere flere transkripsjonsfaktorer, blant annet NF-kB bindingssteder i
hTREX84
genet promoter og demonstrere ved kromatin immunoprecipation (chip) og seterettet mutagenese som RELA /p65 binder NF-kB bindingsseter og induserer
hTREX84
uttrykk. Til slutt viser vi ved immunhistokjemi (IHC) som RELA /p65 er rikelig uttrykt i ondartede celler som abnormt uttrykker hTREX84 indikerer at RELA /p65 kan spille en sentral rolle i regulering hTREX84 uttrykk i kreft. Våre resultater tyder på at overekspresjon av
hTREX84
er assosiert med kreftcelletransformasjon, proliferasjon og kan reguleres ved forhold /p65
relasjon:. Guo S, Liu M, Godwin AK (2012) Transkripsjonell regulering av hTREX84 i humane kreftceller. PLoS ONE 7 (8): e43610. doi: 10,1371 /journal.pone.0043610
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA
mottatt: 12. juni 2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 27 august 2012
Copyright: © Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health, R01 CA140323 og 5U01CA113916, Department of Defense Breast Cancer Research Program av US Army Medical Research, DAMD17-03-1-0312, og Ovarian Cancer Research Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Trex (transkripsjon /eksport) kompleks spiller en nøkkelrolle i transkripsjonen forlengelse og transport av mRNA fra kjernen til cytoplasma [1]. Dette komplekset er konservert fra gjær til menneske. I gjær, er TREX kompleks sammensatt av THO komplekset og mRNA eksport faktorer SUB2 og Yra1 [2], [3], [4], [5]. THO Komplekset inneholder heterotetrameric subenheter, ThO2, Hpr1, Mft1 og THP2 [6], [7]. I tillegg Tex1, et protein med ukjent funksjon, ble funnet å co-rense med THO-komplekset, om enn i støkiometriske mengder [3], [5]. Trex komplekse komponenter er også assosiert med GBP2 og Hrb1 [5], [8]. Disse to proteinene er kjennetegnene på serin-arginin-rik familie av skjøte faktorer og rekrutteres til begynnende mRNA gjennom en fysisk interaksjon med Trex kompleks under transkripsjon forlengelse [9]. Funksjonelt, spiller THO-komplekset en rolle i transkripsjonsavhengige rekombinasjon og transkripsjon [6]. Det er blitt vist at THO komplekset er rekruttert til aktivt transkriberte gener [5] og som er nødvendig for effektiv transkripsjon forlengelse [4]. Null mutasjoner i hver av de genene som koder for subenheter av THO komplekse føre til en mRNA eksport feil [5], [10].
Nylig
Drosophila Hotell og menneskelige Trex komplekser ble karakterisert av flere grupper inkludert vår [5], [11], [12], [13]. Menneskelig Trex Komplekset inneholder ThO2 (gjær komponent ThO2), HPR1 (gjær Hpr1), UAP56 (gjær SUB2) og ALY (gjær Yra1). I tillegg inneholder det humane TREX komplekset andre komponenter, TREX90 (fSAP79), TREX40 (fSAP35) og TREX30 (fSAP24), som har motstykker i
Drosophila plakater (THOC5, 6 og 7, henholdsvis), men ikke i gjær [1], [11], [14]. Både
Drosophila Hotell og menneske Trex kompleks mangel homologer av Mft1 eller THP2. Likevel,
Drosophila Hotell og menneskelige RNA interferens studier av ThO2 og /eller Hpr1 indikerer at metazoan og menneskelig THO kompleks, som sin gjær motstykke, funksjoner i mRNA eksport [11], [13]. TREX84 /HPR1 forbinder med forlengelse RNA polymerase II, noe som indikerer menneskelig THO kompleks fungerer også i transkripsjonen forlengelse [12].
Våre interesser i menneskelig HPR1 resulterte fra vår observasjon at p84N5 ble abnormt uttrykt i menneskelig brystkreft [15] . p84N5 ble oppdaget som en bindende protein som forbinder med retinoblastom tumor suppressor protein (RB) [16]. I lang tid, det fungerte som en kjernefysisk protein markør [17], [18]. Overraskende gjenkjennes vi at p84N5 er human Hpr1, en gjær motstykke, i TREX komplekset [11]. Denne iakttakelse ble ytterligere bekreftet av andre grupper uavhengig [12], [14], og blir referert til som hTREX84 /HPR1.
Mekanismen for regulering av den menneskelige TREX kompleks, inkludert hTREX84 i normale og transformerte celler er ikke godt studert. Vi rapporterer at hTREX84 er abnormt uttrykt i både brystkreft og eggstokkreft og dens uttrykk er regulert delvis av RELA /p65.
Resultater
Over-uttrykk for hTREX84 i Human eggstokkreft celler
Tidligere rapporterte vi at uttrykket av hTREX84 i brystsvulster er omvendt relatert til hormonreseptor status [11]. Dessuten, når vi sammenlignet hTREX84 mRNA uttrykk i 6 representant reduksjon mammoplasty eksemplarer inkludert tre førstegangsgravide premenopausale og 3 parous premenopausale kvinner,
hTREX84
mRNA uttrykk ble signifikant forhøyet i de førstegangsfødende prøvene [11] [data ikke vist]. Disse resultater indikerer at hTREX84 ikke bare er deregulert i brystsvulster, men også svært regulert under normal human bryst lobulær differensiering og kan bli modifisert ved visse hormoner, så som humant choriongonadotropin (hCG). Derfor spurte vi om hTREX84 er også abnormt uttrykt i andre hormonavhengige tumorer, slik som kreft i eggstokkene. Vi observerte at hTREX84 ble sterkt uttrykt i alle 30 tilfeller av eggstokkreft epithelial karsinom (data ikke vist). Videre bestemmes vi hTREX84 uttrykk (hTREX84 /beta-aktin forhold) i primær menneskelig eggstokkreft overflaten epithelial (slange) cellekulturer (n = 10), SV40 Tag udødelige, ikke-tumorigene HOSE cellelinjer (n = 10) og eggstokkreft tumor celle linjer (n = 11) ved western-blotting-analyse. Vi fant at hTREX84 uttrykk er signifikant forhøyet i udødelige cellelinjer (gjennomsnittlig verdi, 0,51) sammenlignet med primære epitelceller (middelverdi, 0,125; p = 0,00024) og når sitt høyeste nivå i kreftcellelinjer (middelverdi, 2,10; p = 0,0022) (Figur 1a, b).
A, etter hTREX84 protein uttrykk i representative eggstokkreft cellelinjer (OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289), udøde epiteliale cellelinjer (HIO- 118, HIO-102, HIO-104, HIO-113), primære epitelceller (ROE). Proteinprøver ble separert på en SDS-polyakrylamidgel immunblottet under anvendelse av anti-hTREX84 eller SS-aktin monoklonale antistoffer.
B, etter hTREX84 /ß-aktin forhold i grunnskolen eggstokkene epiteliale cellekulturer (epitel), udøde epiteliale cellelinjer (HiO) og kreft cellelinjer (kreft).
For ytterligere belyse den biologiske betydningen av hTREX84 i eggstokkreft celler ble siRNA mot
hTREX84
transfektert inn i en OVCAR10 celler. RT-PCR-analyse ved anvendelse av oligonukleotidprimere som er spesifikke for den
hTREX84
genet viste at ekspresjonsnivået av hTREX84 transkriptet avtar ~70 til 80% fra transfeksjon av siRNA inn i OVCAR10 celler når sammenlignet med den for kontrollcellene . Under disse betingelser, de konstante uttrykk nivåene av glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) genet ble oppnådd i begge celler (figur 2a). hTREX84 målrettede sirnas effektivt redusert nivåene av hTREX84, men ikke påvirke nivåene av ikke-målrettede transkripsjoner som β-aktin (figur 2b). Immunfarging bekreftet at hTREX84 protein ble drastisk redusert i et flertall av de behandlede celler (Figur 2c). De totale antall celler sunket betraktelig etter behandling med hTREX84-sirnas sammenlignet med celler behandlet med transfeksjon reagens eller kontroll-siRNA (figur 2d). Det ble observert at cellevekst ble redusert i kulturer behandlet med hTREX84-siRNA sammenlignet med kontroll (figur 2e). Guava nexin analyser viste at det var også en reduksjon av Annexin V-PE og 7-AAD-positive celler i celler behandlet med hTREX84-sirnas sammenlignet med kontroller, og forskjellene var også ikke signifikant (p 0,05) (data ikke vist). For å se på mekanismen av hTREX84 siRNA handling, vi nærmere bestemt cellesyklusfordelingen ved strømningscytometri og funnet at celletallene i G2-M-fase ble redusert og celletall i G1 fase ble øket i OVCAR10 behandlet med hTREX84 siRNA så sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA, hvilket indikerer at hTREX84 kan være nødvendig for oppføring i G2-M-fasen (figur 2f). Disse resultater indikerer at avvikende ekspresjon av hTREX84 kan bidra til eggstokkreft ved å fremme celleproliferasjon. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av flere tumorcellelinjer [data ikke vist].
A, etter analyse av hTREX84 og GAPDH mRNA-nivåer etter behandling av celler med siRNA mot hTREX84 eller kontroll siRNA.
B, etter analyse av hTREX84 og p-aktin protein nivåer etter behandling av celler med siRNA mot hTREX84 eller kontroll siRNA.
C, etter analyse av hTREX84 uttrykket etter siRNA behandling i 72 timer ved immunofluoresence flekker i cellene (
igjen,
celler transfektert med kontroll siRNA;
høyre; Eksporter celler behandlet med hTREX84-siRNA).
D; Eksporter Mikrofotografier viser morfologi følgende utarming av hTREX84 (
igjen,
tumorceller transfektert med kontroll siRNA;
høyre,
celler behandlet med hTREX84-siRNA).
E, etter Celleproliferering analyse av tumorceller følgende utarming av
hTREX84
. Celleproliferasjon og apoptose (data ikke vist) ble undersøkt ved bruk av henholdsvis Guava ViaCount og nexin analyser. Antall levedyktige celler (x10
4) er plottet mot behandlingsvarighet på 24, 48 og 72 timer etter behandling med kontroll siRNA eller med hTREX84-siRNA. Vist er resultater av tre uavhengige eksperimenter. Forskjellen er statistisk signifikant. *, P 0,05; **, P 0,01.
F
. FACS-analyse av cellene følgende nedregulering av hTREX84 nivåer. Vist er prosentandelen av celler i G1, S, G2-M etter 72 timers behandling med enten siRNA (venstre panel) eller hTREX84-siRNA (høyre panel).
Økt hTREX84 Expression av 5- aza-st i Eggstokk Immortal Cells
i en tidligere studie rapporterte vi at
hTREX84
mRNA ble abnormt uttrykt i de aller fleste av høy klasse og invasive duktale karsinomer i bryst [11]. Dessuten
hTREX84
mRNA-nivåer ble forhøyet i ondartede epitelceller sammenlignet med normale mammary ductal epitelceller, som demonstrert ved laser fanges mikro-disseksjon og qPCR-analyse. Derfor spekulere vi at deregulering av transkripsjon av
hTREX84
mRNA kan være en av mekanismen for hTREX84 protein over-ekspresjon i kreftceller. For å bidra til å belyse de molekylære mekanismer som ligger til grunn for den unormale transkripsjon av
hTREX84
i tumorgenese, en udødelig, ikke-tumorigen ovarie overflate epitelcellelinje, HIO-107 ble behandlet med en demethylating middel, 5-aza-dC ved konsentrasjoner av 1, 5, 10 eller 50 uM i 5 dager. Total RNA ble isolert og RT-PCR med spesifikke primere til hTREX84 cDNA eller β-actin cDNA ble utført. Resultatene viste at intensitetene til RT-PCR-produkt av
hTREX84
ble økt med 5-aza-dC behandling på en doseavhengig måte (figur 3). I motsetning til dette, ble produktene fra β-actin jevnt amplifisert fra alle prøvene, som viser at ekspresjonen av β-actin ikke ble endret av 5-aza-dC behandling (figur 3a, c). hTREX84 protein ble også funnet å øke på samme måte ved hjelp av western-blotting-analyse (Figur 3b, d). Lignende resultater ble oppnådd når vi brukte en ovarial cancer cellelinje, OVCAR2, som oppviser lav ekspresjon av endogene hTREX84 (data ikke vist).
A,
HIO-107-celler ble behandlet med 5 -aza-dC ved konsentrasjoner på 1, 5, 10, 50 uM henholdsvis i 5 dager. RT-PCR-show
hTREX84
mRNA uttrykk og
B
, western blot analyse viser hTREX84 protein nivåer.
C, D, etter Kvantitativ mRNA og Western blot data ble beregnet fra densitometrisk analyse av band med NIH ImageJ programvare, henholdsvis. Verdiene ble normalisert til p-aktin som intern kontroll.
Sodium Bisulfite DNA Sekvensering av arrangøren og Exon1 av hTREX84 Gene
Vi identifiserte i GenBank ™ et humant genomisk klon (RP11 -70501) avledet fra kromosom 18p inneholdende den humane TREX84 cDNA sekvensen rapportert først ved Durfee et al [16] (DDBJ /GenBank ™ /EMBL dataene Bank, tilgangsnummer AAA53571), så vel som andre grupper [5], [19] , [20] (Accession nummer NM_005131). Justeringen av den menneskelige
TREX84
cDNA og genomisk klon i GenBank ™ tillatt oss å bestemme exon-intron organiseringen av genet. Genomisk DNA ble deretter isolert fra disse 5-aza-dC behandlede celler og natriumbisulfitt DNA-sekvensering ble utført. Overraskende, resultatene viste at alle CpG dinukleotider finne på hTREX84 promoter og ekson 1 regionene fra behandlet og ubehandlet HIO107 og OVCAR2 celler ble alt demetylert, noe som indikerer at endringer i promoter metylering ikke er assosiert med økende uttrykk for
hTREX84
mRNA og protein etter 5-aza-dC behandling.
for ytterligere korrelere metylering status for
hTREX84
promoter og ekson en region og hTREX84 uttrykk, analyserte vi 15 tilfeller av brystkreft og eggstokkreft cellelinjer, 10 tilfeller av brystkreft og eggstokkreft udødelige cellelinjer, 6 tilfeller av invasiv brystkreft ductal carcinoma, 13 tilfeller av ovarietumorer, samt deres sammenkoblede normale vev ved natriumbisulfitt DNA-sekvensering. Resultatene viste at
hTREX84
promoter og ekson 1 regioner i nesten alle cellelinjer ble demetylert (figur 4a, b).
hTREX84
promoter og ekson 1 regionene i de fleste normale vev ble også demetylert. Det var sporadiske denaturert CpG steder i normalt vev (figur 4c); imidlertid avvikende arrangøren metylering av
hTREX84
ikke ut til å være den viktigste epigenetisk mekanisme forbundet med unormal uttrykk for hTREX84 i bryst- og eggstokk-tumorer og tumorcellelinjer.
A
, DNA sekvens av
hTREX84
regulator regioner. CpG nettsteder er vist i grønn farge. Nukleotidene er nummerert på høyre fra den august oversettelsesstartkoden som er understreket.
B
, Natriumbisulfitt sekvensering av DNA isolert fra ubehandlet (I) og (II) behandlet celler. Stjernene viser CpG nettsteder.
C
. Natriumbisulfitt sekvensering av DNA fra et normalt brystvev (N) og en invasiv duktalt karsinom (T). Stjernene viser CpG nettsider.
Identifikasjon av transkripsjonsfaktorer Bundet til hTREX84 Gene Arrangøren
For å gi en bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for hTREX84 over-uttrykk i bryst- og eggstokkreft evaluert vi transkripsjonsfaktor bindingsseter i
hTREX84
regulator regioner [21] med AliBaba2 (https://wwwiti.cs.uni-magdeburg.de/grabe/alibaba2). Ni SP1, 7 NF1, 4 AP1, to NF-kB, sammen med andre transkripsjonsfaktorer bindingsseter ble spådd av dette programmet. Vi i utgangspunktet fokusert på to NF-kB bindingssteder i transkripsjonsregulering av
hTREX84
. Først utnyttet vi kromatin immunoprecipitation (chip) analyse for å avgjøre statusen til RELA /p65, en av subenheter av NF-kB, på arrangøren av
hTREX84
. Etter chip-protokollen,
hTREX84
genet promoter regioner ble forsterket og analysert ved semikvantitativ PCR hjelp av bestemte primerpar rundt NF-kB bindende regioner på arrangøren av
hTREX84 plakater (figur 5a). En bryst (MDA-MB-231) og to på eggstokkene (OVCAR10, OVCAR5) tumorcellelinjer ble dyrket utsatt for brikke med et antistoff (Ab) til RELA /p65. Anriking av spesifikke DNA-sekvenser i kromatin immunpresipitatene, noe som indikerer en sammenslutning av RELA /p65 med DNA-trådene innenfor intakt kromatin, ble visualisert ved PCR forsterkning. Ingen binding ble sett på immunoutfellingsstudier prøver uten RELA /p65 antistoff (figur 5b). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet når vi transient transfektert Rela /p65 ekspresjonsplasmider inn i en ikke-tumorigen bryst epitelial cellelinje MCF-10F og stimulert hTREX84 proteinekspresjon (figur 5c). Dessuten, når vi slått ned RELA /p65 uttrykk ved hjelp av siRNA rettet mot RELA /p65, de hTREX84 protein nivåer var i sin tur redusert (figur 5d).
En
, Skjematisk fremstilling av hTREX84 promoter indikerer konservert NF-kB DNA bindende motiv.
B
, ChIP analysen av RELA /p65 binding til
hTREX84
genet promoter i MDA-MB-231 (spor 1, 2); OVCAR5 (felt 3, 4); OVCAR 10 (felt 5, 6). Celler ble dyrket i 48 timer. Chip-analyser ble deretter utført med anti-RELA /p65 antistoff. PCR-analyse ble utført på immunoutfellingsstudier prøver uten antistoff (felt 1, 3, 5), med forhold /p65-antistoff (felt 2, 4, 6).
C
, MCF-10F-celler ble transient transfektert med en styrevektor (spor 1) eller et rela /p65 cDNA uttrykk konstruere i 48 timer. Western blot-analyse for rela /p65, hTREX84 og β-aktin.
D
, Western blot analyse av RELA /p65, hTREX84 og β-aktin protein nivåer etter behandling av MDA-MB-231 celler med kontroll siRNA (kolonne 1) og siRNA mot RELA /p65 (spor 2) for 72 timer.
For å kunne fastslå om NF-kB regulerer hTREX84 promoter aktivitet direkte gjennom disse to NF-kB bindingsseter, vi utførte transient transfeksjon analysen i MCF-10F celler med hTREX84 /pGL3 journalister. Rapportør konstrukter inneholdende muterte NF-kB-bindingsseter (figur 6a, b), som ble generert ved PCR-rettet mutagenese, ble sammenlignet med villtype-sekvensen i nærvær av forhold /p65. Resultatene viste alle journalistene som inneholder NF-kB muterte bindingssted (er) har redusert promoter aktivitet (figur 6c).
A, etter DNA-sekvens av NF-κB1M viser at den første NF-kB bindingssetet er mutert fra 5′-GGAAACTCCC-3 «til 5» CCAAACTCCC-3 «.
B, etter DNA-sekvens av NF-κB2M, som viser at den andre NF-kB bindingssetet er mutert fra 5′-AGGTAATCCA-3 «til 5» ACCTAATCCA-3 «. N5-κB1 /2M representerte begge de to NF-kB bindingsseter i hTREX84 promoter-regionen ble mutert som beskrevet ovenfor (sekvens ikke vist).
C
, arrangøren aktiviteter blant de tre journalister konstruksjoner som inneholder enten en enkelt muterte NF-kB bindingssteder eller begge deler (NF-κB1 /2M) som bestemmes av en luciferase assay. 1) Wild typen NF-kB bindingssteder; 2) NF-κB1M; og 3) NF-κB2M; og 4) NF-κB1 /2M.
Siden våre tidligere studier har funnet at hTREX84 ble sterkt uttrykt i cellekjernen, spesielt i dårlig differensierte og mer aggressiv menneskelige brystkreft [11], vi spurte om rela /p65 kan også uttrykkes på lignende måte. Vi undersøkte protein ekspresjon av Rela /p65 ved immunohistokjemisk analyse i 89 tilfeller av human brystkreft, samt 5 normale brystvev (tabell 1). Dette svulst panel inneholder 22, 33 og 34 tilfeller av godt, moderat og dårlig differensierte svulster, henholdsvis. Rela /p65 var svakt (0 /+ 1) detektert i normale bryst epitelceller (4 av 5) og proteinfarging indikert cellecytoplasmaet lokalisering (figur 7a). Farging for Rela /p65 ble også observert i hovedsak i cytoplasma i godt differensierte tumorer (figur 7b). Utpreget granulær farging med et økt antall positivt fargede kjerner ble observert i dårlig differensierte tumorprøver (+ 2 /+ 3, 31 av 34) (fig. 7c). Begge Rela /p65 og hTREX84 er høyt uttrykt i mer aggressiv kreft som indikerer at RELA /p65 og /eller hTREX84 kan ha en rolle i tumorprogresjon og metastasering.
A
, rela /p65 ble svakt detektert i normale bryst epitelceller og positive produkter ble plassert i cellecytoplasmaet.
B
, Farging for RELA /p65 ble påvist hovedsakelig i cytoplasma i høye differensierte svulster.
C
, Intense og tydelig kornete farging for RELA /p65 ble påvist i farget kjerner av lave differensierte vevsprøver.
D
, Tumor seksjon evaluert uten det primære antistoff for å tjene som en negativ kontroll. Forstørrelse 200x.
Diskusjoner
I denne rapporten, utvidet vi vår tidligere observasjon at over-uttrykk for hTREX84 er ikke bare forbundet med aggressiv brystkreft, men er også assosiert med avvikende celle spredning i eggstokkreft. Nukleære lokaliserings hTREX84 i eggstokk-kreft, så vel som i andre krefttyper, for eksempel bryst [11], lungecancer [22] er funnet å være lokalisert i atommassen og RNA prosesseringssenter. hTREX84 regulerer transkripsjon forlengelsen av en undergruppe av gener ved å delta i den TREX proteinkomplekset [11], [12], som er konservert fra gjær til menneske. I tillegg er hTREX84 også involvert i transkripsjon forlengelse, pre-RNA-spleising, og mRNA eksport. Vi utforsket de molekylære mekanismene som styrer over-uttrykk for hTREX84 i kreftceller. Siden
hTREX84
mRNA nivåene er signifikant forhøyet i brystsvulster og tumorcellelinjer, spekulerte vi at epigenetiske mekanismer kan bidra til dette fenotype. Det er velkjent at metylering av DNA ved CpG-dinukleotider er en viktig mekanisme for regulering av gen-ekspresjon i pattedyrceller [21], [23]. Metylering av cytosines i CpG sekvens ligger i regulator regioner av noen gener er tenkt å sikre stanse av visse vevs-spesifikke gener i nonexpressing celler. Avvikende metylering er nå ansett som en viktig epigenetisk endring som forekommer i human kreft [24], [25]. Hypermethylation av normalt unmethylated tumorsuppressorgener korrelerer med et tap på uttrykk i kreftcellelinjer og primære svulster [26], [27], [28]. På den annen side, for å svikt undertrykke gener hensiktsmessig ved unormal demetylering av vev-begrenset gener eller ved hypometylering av proto-onkogener kan resultere i tap av vev-spesifisitet og kan fremme kreft formasjon [29], [30], [31]. I tidligere studier har vi vist at γ-synuclein promoter, som har et lignende mønster av CpG områder som
hTREX84
er hypomethylated i mange humane solide svulster som abnormt uttrykker dette protein [32], [33]. Vi antok at
hTREX84
kan være regulert av en samme mekanismen. Faktisk er 5-aza-dC indusert hTREX84 i alle celler behandlet, men indirekte, som vist ved mangel på metylering endringer på CPG-områder, noe som indikerer at hypometylering ikke er direkte forbundet med økt ekspresjon av
hTREX84
mRNA og protein. Disse resultat ble ytterligere bekreftet da vi analyserte en rekke brystkreft og eggstokkreft svulster og tumorcellelinjer og normalt vev for tegn på avvikende metylering av natriumbisulfitt DNA-sekvensering. CPG steder i
hTREX84
promoter og ekson 1 regionene ble universelt demetylert uavhengig av nivået på
hTREX84
uttrykk. Resultatene tyder på at unormal hTREX84 metylering ikke er assosiert med forhøyet hTREX84 uttrykk i bryst og ovarietumorer og kan reguleres av andre epigenetiske mekanismer.
Det er flere muligheter som kan forklare hvorfor 5-aza-dC ikke induserer hTREX84 uttrykk direkte gjennom hTREX84 genet metylering status. For eksempel kan 5-aza-dC har dramatiske effekter på kromosomer, noe som fører til decondensation av kromatinstruktur, og dermed forsterke spesifikk genekspresjon [34], [35]. En annen mulighet er at 5-aza-dC kan påvirke noen transkripsjonsfaktorer som senere påvirker hTREX84 uttrykk.
For å gi en bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for hTREX84 over-uttrykk i celle immortalization og tumorigenesis identifiserte vi transkripsjonsfaktor bindingsseter i
p84N5
promoter. Vi fokuserer på kjernefaktor kB (NF-kB) og validere det av flere grunner. NF-kB er ikke et enkelt protein, men en liten gruppe nært beslektede protein dimerer som bindes til en felles sekvensmotiv kalt kB området [36]. Ifølge Hanahan og Weinberg, krever tumorigenesis seks viktige endringer i normal cellefysiologi: selvforsyning i vekstsignaler; ufølsomhet for veksthemming; unndragelse av apoptose; immortalization; vedvarende angiogenese; og vev invasjon og metastasering [37]. NF-kB er i stand til å indusere flere av disse cellulære endringer [38], og det har vist seg å være konstitutivt aktivert i visse typer kreftceller, inkludert brystkreft. Tidligere studier har dokumentert forhøyet eller konstitutiv NF-kB-DNA-bindende aktivitet både in mammary carcinoma cellelinjer og i primærbrystkreftceller av human opprinnelse og gnager [39], [40], [41]. Dette kan være forbundet med økt nivå av epidermal vekstfaktor familien reseptorer (EGFR) [42]. Ved hjelp av en kromatin immunoutfelling [43], [44] og funksjonelle analyser vi tydelig vist at forhold /p65, en av underenhetene av NF-kB, bindes til promoteren til
hTREX84
og påvirket
hTREX84
mRNA uttrykk. Dessuten, når spesifikt oppbrukt av siRNA tilnærminger, tap av RELA /p65 blokkert hTREX84 uttrykk. For ytterligere å avgjøre om NF-kB direkte regulerer
hTREX84
promoter aktivitet via NF-kB bindingsseter, utførte vi en luciferase promoter analyse hvor de NF-kB bindingsseter ble mutert individuelt eller i kombinasjon. Resultatene viste at NF-kB-bindingsseter var avgjørende for maksimal promoter-aktivitet. Vi videre undersøkt protein uttrykk for Rela /p65 ved IHC i menneskelige brystkreftprøver og viste et konsistent mønster av over-uttrykk i mer aggressive, dårlig differensierte svulster. Derfor er forhold /p65 uttrykt på en måte som ligner på hTREX84 [11], noe som indikerer at disse to proteinene kan samvirkende bidra til tumorprogresjon og metastase.
NF-kB og dens forhold /p65 subenheten spesielt kan fremme tumorigenesis gjennom sin evne til å indusere ekspresjon av anti-apoptotiske gener som
BCL
-xL,
XIAP Hotell og
IB
-1L [45], [46]. NF-kB kan også stimulere tumor proliferasjon gjennom inducing visse onkogener slik som cyklin D1 [47] og c-MYC [48]. Ytterligere NF-kB målgener som bidrar tumorcellemigrering og /eller metastase omfatter cellulær adhesjon molekyl, slik som ICAM-1 og VCAM-1 [49]; matriks-metalloproteinaser, slik som MMP-9; kjemokin reseptorer, så som CXCR4 og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [50]. I en nylig rapport, ble NF-kB er vist å regulere et stort nettverk av gener, mye mer enn opprinnelig antatt [51]. Betydningen av
hTREX84
som en roman rela /p65 målet bør ikke bli oversett så enkelt annet NF-kB regulert gen, siden den gang. hTREX84 er avgjørende for transkripsjonen forlengelse og mRNA eksport [11]. Derfor er det interessant å spekulere i at NF-kB kan direkte megle mRNA metabolisme gjennom regulering av
hTREX84
i kreftceller. NF-kB er også kjent for å indusere ekspresjon av enkelte cytokiner og kjemokiner og, i sin tur, er indusert av dem [48], [52]. Denne positive tilbakemeldinger mechanismis vanligvis holdes i sjakk for å produsere en kronisk eller overdreven reaksjon forbundet med visse sykdommer når NF-kB blir abnormt aktiv [52]. hTREX84 og den forhold /p65-subenheten av NF-kB kan også aktiveres innbyrdes i aggressiv brystkreft. I tidligere studier hTREX84 stimulert transkripsjon av RELA /p65 [53]; imidlertid rollen til hTREX84 som en transkripsjonsfaktor er ikke blitt godt etablert. Vi observerte også at hTREX84 uttrykk er forbedret i østrogenreseptor (ER) negativ brystkreft [11], mens konstitutiv aktivering av NF-kB er blitt vist å være assosiert med mer aggressiv brystkreft [40], [42], [54] . Som sådan, er mangelen på molekylære mål i ER-negativ brystkreft er fortsatt et stort terapeutisk hinder. Akkurat som NF-kB, kan hTREX84 anses som en ideell terapeutisk mål for ER-negativ brystkreft.
Andre transkripsjonsfaktorer er trolig bidra til regulering av
hTREX84
. Fire AP-1 bindingssteder ble identifisert i
hTREX84
promoter-regionen. AP-en transkripsjonsfaktor er en dimer kompleks som inneholder medlemmer av juni, FOS, ATF og MAF protein familier [55]. Forhøyede av AP-1-aktivitet ble også funnet i humane brysttumorer og medikamentresistent brysttumorcellelinjer [56], [57], [58]. NF-kB kan indirekte øke uttrykket av AP-1-regulerte gener ved fysisk assosiere med AP-1 [59]. Den potensielle rolle AP-1 og andre transkripsjonsfaktorer i å regulere
hTREX84
uttrykk gjenstår å bli bestemt; har imidlertid våre nyere studier vist at RELA /p65 spiller en sentral rolle i å regulere
hTREX84
uttrykk i brystkreft og eggstokkreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer og Cell Kultur
Media og cellekultur reagenser ble utarbeidet av Cell Culture Facility ved Fox Chase Cancer Center. Ti primære menneskelige eggstokkene overflaten epitelceller (SLANGE) cellekulturer og 10 SV40 Tag udødelige, ikke-tumorigene SLANGEcellelinjene ble etablert og dyrket i 199 Medium 15% FBS og insulin (290 enheter /per 500 ml) som vi har beskrevet tidligere [ ,,,0],60]. De udødeliggjort human bryst epitelceller MCF-10F (HMECs), som ble dyrket i DMEM /F12-medium supplementert med 5% hesteserum, insulin, hydrokortison, epidermal vekstfaktor, koleratoksin, og antibiotika, ble etablert fra en pasient med fibrocystisk sykdom og viser ikke egenskapene til en ondartet fenotype [61], [62]. Menneske eggstokkreft cellelinjer OVCAR2, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR8, OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289, UPN300, A2780 [63], [64], [65], [66], og brystkreftcellelinjer, MDA-
