Abstract
Cancer stamceller (cscs) kan invadere og metastasere av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) . Men hvordan de unnslippe immun overvåking er uklart. B7H1 er avgjørende negativ co-stimulerende molekyl, men lite informasjon om hvorvidt det fungerer i cscs. Derfor bestemte vi den uttrykk for B7H1 og EMT-tilknyttede markører i kolorektal kreft stamceller lignende celler for å undersøke en mulig immunoevasion måte cscs. Vi beriket CD133
+ kolorektal kreft celler som manifesterte de cscs-lignende egenskaper som høyere nivåer av andre stamcellemarkører oktober-4 og Sox-2, tumor sfære dannende evne og mer tumorigene i NOD /SCID-mus. Disse CD133
+ celler har EMT genekspresjon profilen inkludert høyere nivå av sneglen, Twist, vimentin, fibronektin og lavere nivå av E-cadherin. Videre CD133
+ celler i både cellelinje og kolorektal kreft vev uttrykt høyt nivå av negativ co-stimulere molekyl B7H1. Videre noen B7H1
+ kreftceller viste også karakteristisk for EMT, som indikerer EMT celler kunne unnslippe immunangrep i løpet av metastaser. B7H1 uttrykk og EMT fenotyper på cscs indikerer en mulig immunoevasion måte
Citation. Zhi Y, Mou Z, Chen J, han Y, Dong H, Fu X, et al. (2015) B7H1 Expression og epithelial-To-Mesenchymale Transition fenotyper på Colorectal Cancer Stem-lignende celler. PLoS ONE 10 (8): e0135528. doi: 10,1371 /journal.pone.0135528
Redaktør: Giuseppe Pirozzi, Istituto Nazionale Tumori, ITALIA
mottatt: 8 mars 2015; Godkjent: 22 juli 2015; Publisert: 18 august 2015
Copyright: © 2015 Zhi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (til ZM, nr 30872466), Nasjonalt Program på Key Basic Research Project (973 Program) Kina (til ZM, Nei 2010CB529404). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den andre i kvinner [1], men fremskritt av anti-kreft terapi har blitt gjort i begrenset grad i de siste 50 årene. Svikt i anti-kreft terapi er knyttet til en undergruppe av kreftceller som kalles kreft stamceller (cscs), som er de antatte kreft initiere celler med egenskaper av normale stamceller, som for eksempel selvfornyelse, multipotency og ubegrenset proliferasjon potensiell [ ,,,0],2]. Videre er cscs antas å være avgjørende for resistens [3]. Derfor er det antatt at cscs er «frø» av kreft dannelse og vanskelige å bli eliminert. Kolorektal cscs har også blitt isolert og karakterisert basert på cscs markører som CD133 [4-9].
cscs spille en avgjørende rolle i kreft invasjon og metastasering. For å forstå hvordan kreftceller metastaserer, har rollen som epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) blitt grundig studert det siste tiåret. EMT overfører invasive og metastatiske egenskaper, motstand mot terapi, og cscs fenotyper på kreftceller i eksperimentelle modeller [10-15]. Kreftceller under EMT downregulate proteiner assosiert med celle adhesjon, for eksempel E-cadherin og oppregulere proteiner uttrykt på mesenchymale celler, slik som vimentin, N-cadherin og fibronektin [13], og transkripsjonsfaktorer inkludert
Snail
Twist
, og
Slug
samt [16]. EMT forenkler også kreftcelleoverlevelse etter behandling med anti-kreft legemidler, som er rettet mot reseptorer på epitelceller [12, 17]. I tillegg induksjon av EMT i kreftceller med narkotika eller overekspresjon av EMT transkripsjonsfaktorer resulterer i kjøp av mesenchymale egenskaper og uttrykk for stamcellemarkører [18-20]. På den annen side, kreftceller etter behandling med anti-kreft legemidler, som har vist seg å berike cscs, manifesterer fenotypene og genekspresjon som EMT [21]. Disse funnene indikerer den nære sammenhengen mellom cscs og oppkjøpet av EMT. Men et flertall av patologer er fortsatt ildfast til EMT teorien fordi definitive bevis på EMT skjer i humane tumorer mangler så langt.
cscs har iboende biologiske egenskaper for å danne svulst og kan invadere vev gjennom EMT. Men det er uklart at hvordan de unngå immunovervåking for endelig å overleve i immunkompetente verter. Immunoevasion kan bidra cscs til å overleve og deretter danne tumor [3]. Tidligere rapporter har antydet iboende forbindelser mellom immunsuppresjon og EMT, som for eksempel at Snail-indusert EMT indusert regulatoriske T-celler og nedskrevne dendrittiske celler [22]. Til sammen hypoteser vi immunoevasion er viktig for cscs som gjennomgår EMT gjennom paraneoplastic betennelse regionen uten immunbehandling og deretter implementere invasjon og metastasering. Imidlertid er dataene fortsatt mangelvare av immunoevasion mekanismer i cscs [3].
B7H1, en ligand av programmert celledød 1 (PD-1), har vært kjent som en viktig co-stimulerende molekyl og spiller en viktig rolle ved induksjon og opprettholdelse av perifer toleranse [23]. B7H1 oppregulert på betydelige typer kreftceller som gir negative signaler og fører til immunsuppresjon via PD-1-B7H1 interaksjonen mellom kreftceller og T-celler [24, 25], noe som resulterer i tumor-infiltrerende T-celler dysfunksjon og treg rekruttering [26] . Disse egenskapene gjør B7H1 bli et lovende mål å kontrollere kreft. Likevel er B7H1 uttrykk på cscs ikke kjent godt i tykk- og endetarmskreft. Derfor vi har oppdaget B7H1 uttrykk i tykk- og endetarmskreft i denne studien og viste B7H1 uttrykk og EMT fenotyper på kolorektal kreft stilk-lignende celler, som kan være mekanismer for cscs å unnslippe immun overvåking og invadere fjerne vev.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
den menneskelige kolorektal kreft vev ble hentet fra Southwest Hospital etter etiske protokoller godkjent av etikkomiteen av den tredje Military Medical University, Chongqing, Kina. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke. Dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Third Military Medical University. Alle prosedyrer var i samsvar med National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
Kreft vev og cellelinje
Den menneskelige kolorektal tumorer ble histopathologically evaluert og klassifisert av Tumor- node-metastaser (TNM) staging system (tabell 1). Tykktarmen cellelinjen HT29 celler (Katalognummer: TCHu 103, kjøpte 29. mai 2010 fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) ble dyrket i McCoys 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Grand Island, NY, USA).
magnetisk cellesortering
HT29-celler ble høstet ved eksponensiell vekstfase med 0,25% trypsin ( inneholdt EDTA) og deretter sortert etter CD133 Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) i henhold til instruksjonene fra produsenten. De døde celler ble fjernet av Dead Cell Removal Kit (Miltenyi Biotec) før sortering. Den CD133
+ og CD133
– fraksjoner ble samlet separat og farget med PE-konjugert menneskelig CD133 /2 (293C3) antistoff (Miltenyi Biotec). PE-konjugert mus IgG2b (Miltenyi Biotec) ble anvendt som isotypekontrollantistoff. Cellen renhet ble vurdert ved flowcytometri (BD FACSCanto Ⅱ, San Jose, CA, USA).
Svulstfremkallende analyser i mus
NOD /LtSz-SCID /SCID (NOD /SCID) mus (Kjøpt fra Beijing Laboratory Animal Research Center, Kina) ble avlet og vedlikeholdes i Individual Ventilert Caging System under betingelser godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Third Military Medical University. CD133
+ og CD133
– celler ble sortert og telt før inokulering. Kreftceller ble suspendert i en 1: 1 blanding av medier og matrigel (BD Biosciences, Bedford, UK) og injisert subkutant inn i flankene på 4 mus (8-10 uker gamle). Hver flanke ble injisert 1 × 10
4 celler. Veksten av tumorene ble målt ukentlig og måles volumet av lengde x bredde x bredde /2. Alle mus ble avlivet etter 7 uker transplantasjon. De xenotransplantater ble fjernet, fiksert med 10% bufret formalin, og farget med hematoxylin og eosin (HE)
Sphere-analysen
sortert CD133
+ og CD133
. – cellene ble dyrket i serumfritt medium (NS-A basal medium, Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada) pluss 10% NS-en spredning Supplements (human) (Stemcell Technologies), epidermal vekstfaktor (EGF) (20 ng /ml) (Stemcell Technologies), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) (10 ng /ml) (Stemcell Technologies) og heparin (2 ug /ml) (Invitrogen). Dyrkningsmediet ble erstattet hver 3. dag. Bildene av kulene ble tatt etter 20 dager ved mikroskop og telles tall på under 100 × forstørrelse i tilfeldige synsfelt. Noen kuler ble farget med PE-konjugert CD133 /2 (293C3) antistoff (Milteny Biotect). Noen kreftkuler ble dissosiert ved Collage Type Ⅳ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og deretter dyrket i serumfritt medium som nevner ovenfor for å bestemme hvorvidt kuler kan danne nytt.
RNA ekstraksjon, cDNA syntese, og Q-PCR
CD133
+ og CD133
– HT29 celler ble samlet henholdsvis og lagt Tripure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) for å trekke RNA. 500 ng RNA for hver prøve ble omvendt transkribert i en 20 mL reaksjonsblanding (Toyobo Bio Technology, Shanghai, Kina). Ekspresjonsnivået av hvert gen ble bestemt ved sanntids-kvantitativ PCR (Q-PCR). Nivå av produktet ble bestemt ved SYBR Grønn (TAKARA bioteknologi, Dalian, Kina). Q-PCR ble utført ved Mx3000P qPCR system (Agilent Technologies) med følgende program: innledende denaturering i 2 minutter ved 95 ° C, etterfulgt 45 sykluser med PCR (95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder). Etter at en syklus designet av Mx3000P programvare (95 ° C i 60 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder, 95 ° C i 30 sekunder) ble tilsatt for smelting kurve analyse. Primer sekvenser ble oppført i tabell 2. glyseraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble brukt som husholdningsgenet kontroll.
immunfluorescens farging
De frosne deler av kreft vev ble farget i henhold til online protokollen (https://www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl.htm). Antistoffer mot human CD133, B7H1, E-cadherin og vimentin ble anvendt for å bestemme ekspresjon av EMT markører på CD133 positive eller B7H1-positive celler. Tilsvarende ble antistoffer mot humant CD133, B7H1 og EpCAM brukes til å oppdage CD133 og B7H1 uttrykk på kreftvevet. Detaljene antistoffer utvalg ble oppført i Tabell 3. Sekundære antistoffer ble kjøpt fra Beyotime Institute Biotechnology, Shanghai, Kina. Diamidino-fenyl-indol (DAPI) (Beyotime Biotechnology) ble anvendt for å farge kjerne. Kontroller inkludert: 1) Blank: brukes antistoff fortynningsbuffer (5% bovint serumalbumin i fosfat-buffer saltoppløsning, pH 7,2) bare; 2) Negativ kontroll: brukt antistoff fortynning buffer pluss sekundære antistoffer; 3) Isotype antistoff kontroll: brukt IgG fra antistoff arter utvannet av antistoff fortynning buffer pluss sekundære antistoffer. Kontroller ble anvendt for å unngå ikke-spesifikk fluorescens.
HT29-celler fargeprotokollen var lik kreftvev, men før det celler ble sådd ut på poly-L-lysin (Sigma-Aldrich) forhåndsbelagt-dekkglass, kultivert i McCoy «5A medium i 24 timer og deretter fast med Fixation og Permeabilization Solution (BD Biosciences).
etter farging ble alle lysbilder holdt i fuktede kamre fra lys ved 4 ° C til bildeopptak.
bilder fangst og uttrykk analyse
Alle confocal bilder ble tatt av laserskanning confocal fluorescens mikroskop (Leica TCS-SP5, Tyskland). Kontroller ble anvendt til å justere riktig fange tilstand for å unngå ikke-spesifikk fluorescens forstyrrelser. Det samme merke i ulike sider ble oppdaget under samme tilstand. Ekspresjonshastigheter ble målt ved å telle tilsvarende positive celler i ta bilder. Hver side ble målt mer enn 5 felt og telles minst 1000 celler.
Statistisk analyse
Forskjellene av xenograft volumer, sfære tall og mRNA uttrykk nivå mellom CD133
+ og CD133
– celler ble analysert ved Student
t
-test. En
p
-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant forskjell. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 13.0).
Resultater
CD133
+ celler har mer karsinogent potensial og tumor sfære forming evne
Som debattene av cscs markører fortsatt eksisterer [27, 28], sjekket vi kreft stilk-lignende karakteristikker av sortert CD133
+ celler først. CD133
+ og CD133
– HT29 celler ble samlet for å bestemme celle tumorigenitet. Prosentandelen av CD133
+ celler var ca 90% (fig 1A). Ti tusenvis av CD133
+ og CD133
– ble subkutant injisert i de ulike flankene av NOD /SCID-mus. Fra 5 uker etter injeksjon, svulster avledet fra CD133
+ celler begynte å bli betydelig større enn de som stammer fra CD133
– celler (figur 1B og 1C). Den CD133
+ celletransplantater viste malign histologi som tykktarmskreft (fig 1D), noe som tyder på at CD133
+ celler er mer tumorigent. I tillegg er sfære dannelse en av egenskapene til cscs [4], vi bestemt sfære dannelsen av CD133
+ celler og funnet ut at CD133
+ celler dannet betydelig mer kreft kuler enn CD133
– cellene i serum- fritt kulturmedium
in vitro plakater (figur 1E). Videre nesten alle celler i CD133
+ celler avledet kreftkuler uttrykt høy CD133 (Fig 1F). I tillegg, etter celledissosiasjon med collagenase, kunne cellene danner tumor kuler på nytt i serumfritt medium (figur 1G), som indikerer den selvfornyelse kapasitet av CD133
+ -celler. Samlet er disse resultatene indikerte at CD133
+ celler besatt cscs-lignende egenskaper.
HT29 celler ble renset med CD133 magnetiske kuler. Renheten av CD133
+ celler ble bestemt ved flow-cytometri (A). 1 × 10
4 CD133
+ og CD133
– celler ble subkutant injisert i de ulike flankene av NOD /SCID-mus. Vekstkurven av xenograft tumorer i NOD /SCID-mus viser forskjellig evne til tumorgenese i to subpopulasjoner (B). Kinetikken til tumorstørrelse ble målt en gang i uken (n = 4, middelverdi ± SA, **
p
0,01) .En representativt for mus er vist ved 7 uker etter inokulering (C). De delene av transplantater (D) fra CD133
+ celler (venstre, 200 × forstørrelse) og CD133
– celler (høyre, 200 × forstørrelse) ble analysert med hematoxylin og eosin flekken (bar = 100 nm). CD133
+ celler viser mye kraftigere av sfære formasjon enn CD133
– de (E). Histogrammet viser antall kuler som stammer fra forskjellige subpopulasjoner (**,
p
0,01). Tumor kuler uttrykke CD133 (F, topp: nøytral lys, bunn: fluorescens, rød, bar = 100 nm). Etter dissosiasjon, celler dannes kuler igjen (G, nederst) i serumfritt dyrkningsmedium som sine eldre generasjonen (G, øverst) (bar = 100 nm).
CD133
+ HT29 celler uttrykke både stamcelle-forbundet og EMT-assosierte molekyler
cscs er de antatte kreft initiere celler med egenskapene til normale stamceller uttrykker pluripotency markører, for eksempel Sox-2 og oktober-4 [29-31] . For å avgjøre om CD133
+ HT29 celler også uttrykk for disse stamcelle-assosiert faktorer, transkripsjonsnivået av oktober-4 og Sox-2 uttrykk ble målt. Som forventet ble to stamcellemarkører okt-4 og Sox-2 uttrykt betydelig høyere i CD133
+ undergruppe (
p
0,05) enn CD133
– celler (figur 2A), som er konsistent med oktober-4 og Sox-2 overekspresjon i dårlig differensierte svulster [32].
Relative mRNA uttrykk nivåer av stamcellemarkører okt-4 og Sox-2 (A), EMT assosiert transkripsjonsfaktorer Twist og Snail (B), og EMT markører E-cadherin, fibronektin, og vimentin (C) ble bestemt ved real-time kvantitativ PCR og normalisert til GAPDH uttrykket. *,
p
0,05; **,
p.
0,01
Forrige studie viste at EMT er involvert i omdannelsen av tidlig stadium svulster i invasive kreftformer [33]. Interessant, samler bevis tyder på at induksjon av EMT fenotyper av ulike faktorer også induserer CSC-lignende celler [15]. Det er imidlertid ikke klart om cscs skjerm EMT fenotyper. For å løse dette spørsmålet, uttrykk for EMT-assosierte molekyler i HT29 celler ble oppdaget, inkludert transkripsjon faktorer sneglen og Twist, epitelial protein E-cadherin, mesenchymale markører vimentin og fibronectin. CD133
+ celler uttrykt betydelig høyere nivåer av Snail, Twist, vimentin og fibronektin enn CD133
– celler (
p
0,05) (figur 2B og 2C). Omvendt, E-cadherin uttrykk i CD133
+ celler var signifikant lavere (
p
0,05). (Fig 2C), som indikerer CD133
+ -celler manifestert EMT-tilknyttede egenskaper
CD133
+ celler i pasientens vev vise EMT fenotyper
Selv om EMT ble mye studert
in vitro
, det sentrale spørsmålet om EMT var at direkte bevis for dette fenomenet skjer i menneske kreftvev manglet. For å løse dette problemet, uttrykk for CD133 og EMT-fenotypiske molekylene ble analysert i menneskelige kolorektal kreft vev. CD133 ble uttrykt dispersedly ved adenokarsinom reir (fig 3), men ikke i paraneoplastic vev (S1 fig). Interessant, fant vi at noen CD133
+ celler uttrykte vimentin (Fig 3B), men ikke E-cadherin i 13/20 oppdaget menneskelige kolorektal kreft vev (fig 3A). Ved farging disse tre molekylene på den samme delen, bekreftet vi en del av CD133
+ celler i forskjellige prøver (20% -40% i total CD133
+ celler) viste denne fenotype (Fig 3C). Det indikerte direkte bevis på at noen CD133
+ kreft stilk-lignende celler hadde EMT fenotyper i humane kreftvevet.
uttrykk for CD133 (rød), E-cadherin (grønn) (A) eller CD133 (rød) og vimentin (grønn) (B) eller CD133 (rød), E-cadherin (grønn) og vimentin (blå) (C) ble bestemt ved immunofluorescens farging. De kjernene ble farget med DAPI (A, B: blue; C: grå). Det er vist en representant for tykktarms moderat differensiert adenokarsinom, T3N0M0. (Bar = 20 mikrometer)
Co-uttrykk for B7H1 og CD133 i HT29 cellelinje og kolorektal kreft vev
For å undersøke mekanismen hvordan cscs unnslippe immunovervåkning, B7H1 ble bestemt i HT29 cellelinje og kolorektal kreft vev. Vi fant at samtidig uttrykk for B7H1 og CD133 var allestedsnærværende i HT29 celler (figur 4A). For ytterligere å bestemme B7H1 uttrykk i pasient vev, ble kolorektal kreft vev samlet. EpCAM, en luminal epitelial markør, ble brukt til å skille kreft reir og stromal region [34]. Vi fant at B7H1 ble uttrykt hovedsakelig i kreftceller i mer enn halvparten (11/20) av kolorektal kreft vev (Tabell 4). Mer interessant, ca 50% av CD133 uttrykker kreftceller uttrykt B7H1 (fig 4B og 4C, tabell 4). Videre B7H1 og CD133 var alltid co-uttrykt i EpCAM
+ celler (fig 4B og 4C). Det indikerer CD133
+ cscs kan unnslippe immunovervåkning ved å uttrykke hemmende molekyl B7H1.
uttrykk for CD133 (rød) og B7H1 (grønn) i HT29 celler (A) (Bar = 20 mikrometer), og ekspresjon av EpCAM (blå), CD133 (rød) og B7H1 (grønn) i kolorektal kreft vev (B) (bar = 50 uM) ble bestemt ved immunofluorescens farging. De kjernene ble farget med DAPI (grå). Den rektangel område i bildet forstørres (C) og viser en typisk co-uttrykk for CD133 og B7H1 (indikert med piler). Det er vist en representant rektal moderat differensiert adenokarsinom, T3N0M0.
B7H1 uttrykke celler vise EMT fenotyper i kolorektal vev
Vi fant at B7H1 ble uttrykt på CD133
+ celler, og kan spille en rolle i immunoevasion av kreft stilk-lignende celler. Det ville være interessant å vite om B7H1 uttrykk er relatert til EMT. For å møte dette direkte, B7H1 uttrykk i EMT fenotypiske celler ble bestemt i 11 menneskelige kolorektal kreft prøver hvor CD133 var co-uttrykkes med B7H1. I likhet med tidligere studier [35], ble B7H1 uttrykt på kreftceller spesielt på kanten av kreft (figur 5). I disse tilfellene, spesielt der det så ut som svulst spirende, fant vi at 20% -40% av B7H1expressing kreftceller nedregulert E-cadherin (fig 5a). Videre, 10% -25% av B7H1
+ kreftceller uttrykt vimentin, en mesenchymale markør (figur 5B), som indikerer EMT fenotype eksisterer i visse B7H1
+ celler. Til sammen foreslås det at overekspresjon av B7H1 kan være en av immunoevasive mekanismer ikke bare for CD133
+ cscs, men også for forbigående EMT fenotypiske kreftceller.
uttrykk for B7H1 (grønn) og E- cadherin (rød) (A) eller B7H1 (grønn) og vimentin (rød) (B) ble bestemt ved immunofluorescens farging. En av B7H1 uttrykker celler er angitt med en pil. De kjernene ble farget med DAPI (blå). Det er vist en representant for tykktarms moderat differensiert adenokarsinom, T3N0M0. (Bar = 20 mikrometer)
Diskusjoner
cscs anses å være «frø» av kreft, og kan bli beriket av celle sortering basert på noen spesifikke overflatemarkører. Selv om markører for cscs er fortsatt diskutabel, kreftceller som uttrykker visse spesifikke molekyler vise cscs-lignende egenskaper [9]. CD133 er en av markører for blodkreft stamceller og anses å være en cscs markør i tykk- og endetarmskreft [5-7, 27, 28, 36]. I denne studien CD133
+ celler hadde cscs-lignende egenskaper ved å vise evne sfære forming og tumorigenicity, uttrykker høyere nivåer av stamcellemarkører okt-4 og Sox-2 som ble overuttrykt i dårlig differensierte svulster [29, 31] . Dessuten, disse cellene manifestert EMT genekspresjon profil, som hadde blitt ansett for å være en viktig eiendommelighet linking til cscs [15].
Vårt resultatene av de cscs-lignende egenskaper av CD133
+ -celler var i overensstemmelse med tidligere studier [5-7]. I motsetning, er det noen andre Resultatene viste at CD133-negative celler besatt cscs-lignende egenskaper istedenfor [27, 28]. For eksempel ble en CD133 negativ cellelinje (NANK) etablert fra xenografter som stammer fra friske kirurgiske prøver av menneskelige colonic primær og dets eggstokkreft metastatisk kreft vev transplantert inn NOD /SCID-mus [28]. NANK celler besatt cscs-lignende egenskaper som sfære dannelse og tumorigenicity i NOD /SCID-mus. Sammenlignet med vår studie, kan det bli funnet at opprinnelsen av kreftceller var helt forskjellig, noe som kan virke forstyrrende konsistensen av resultatene. Videre NANK celler skilte seg fra sin opprinnelige kreft også, slik som at CD133 og CD44 ble uttrykt i original kreft, men heller svakt i NANK. Derfor ser det ut til at denne kontrasten innebærer kompleks av kreft i stedet for feilene til forskningsmetoder. Selv om det ikke er strenge nok til å bruke CD133 alene for å identifisere cscs, er det bekreftet at cscs ble beriket i CD133
+ undergruppe og gjorde det vise cscs-lignende funksjoner. Det er interessant og verdifull for å utforske egenskapene til denne undergruppe.
CD133
+ kolorektal kreft celler i begge cellelinje og kreft vev manifestert egenskapene gjorde dem spesielle og lettere å invadere og metastasere. I denne studien fant vi at CD133
+ HT29 celler viste EMT fenotyper og co-uttrykt B7H1, noe som indikerer cscs kan uttrykke B7H1 å unndra immune overvåking når de invaderer gjennom EMT. I likhet med HT29 celler, CD133 uttrykk nivå i kolorektal kreft vev var variabel i forskjellige celler. Tidligere studier viste at CD133 ble uttrykt på kreftcellene, men ikke haemocytes [4, 5] og de fleste karsinomceller uttrykte en membran glykoprotein EpCAM [34], som er ansett som en av CSC markører i flere typer carcinom [37] .Vi funnet at CD133 ble uttrykt på EpCAM
+ celler (figur 4), noe som indikerer de CD133 uttrykker cellene er kolorektal kreftceller. Selv EMT er indisert som karakteristisk for cscs, om det er forbindelse mellom dem fortsatt uklare. I tidligere studier, kan cscs ende celler bli generert av indusert aktivering EMT i cellelinjer eller musemodell [19, 38]. Derfor tenkte vi at lignende fenomen kan eksistere i tykk- og endetarmskreft. I den nåværende forsøk ble konfokalt mikroskop benyttet for å detektere forskjellige markører ekspresjon i kreftformer, noe som kan observere flere proteiner ekspresjon i hver celle samtidig. Som forventet fant vi at CD133
+ celler i menneske kolorektal kreft vev hadde EMT fenotyper, downregulating E-cadherin og oppregulering vimentin. Dette fenomenet har skjedd i et parti av CD133-positive celler, som kan være opptatt på grunn av at EMT var en dynamisk kurs og vanskelig å fange bryteren. Til sammen våre resultater indikerer den direkte sammenhengen mellom cscs og EMT i kolorektal kreft vev.
cscs har iboende biologiske egenskaper for å danne svulst og kan spre gjennom EMT. Det ville være interessant å finne ut hvordan de unngå immunovervåking for endelig å overleve særlig i immunkompetente verter. B7H1 er en avgjørende negativ co-stimulerende molekyl som fører til immunoevasion i kreft. B7H1 uttrykk på CD133
+ kreftceller indikerer at B7H1 kan spille en rolle i cscs. Nylig kliniske stier viste at blokkerings PD-1-B7H1 reaksjonsveien resulterer i relativ god prognose i anticancerterapi og B7H1 uttrykk i kreftvev er forbundet med resultatet av behandlingen [39]. Basert på hva vi har funnet her, kan dette bemerkelsesverdig utfallet være relatert til å kontrollere cscs ved å målrette PD-1-B7H1 veien. B7H1 er ansett som et bedre mål enn et annet negativt ko-stimulerende molekyl, CTLA-4, fordi fordelingen av B7H1 /PD-1-aksen er i svulsten mikromiljøet mer selektivt [40, 41]. Våre resultater tyder på at målretting B7H1 kan skade «prime skyldige» av kreft, kreft stamceller, i tykk- og endetarmskreft. Dessuten har enkelte B7H1
+ manifest EMT-lignende fenotype, hinter potensialet tilkobling av immunoevasion og EMT. I transgene mus modell, hadde det blitt bevist at oppregulering av B7-H1 i huden epitelceller fremmet EMT og akselererer kreftutvikling [42], som var i samsvar med våre funn at B7H1 uttrykker kreftceller hadde EMT fenotyper i kolorektal kreft vev.
til sammen våre resultater viste B7H1 uttrykk og EMT fenotyper i CD133
+ celler, noe som indikerer mulige mekanismer for cscs å unnslippe immun overvåking og invadere fjerne vev. Selv om enkelte studier tvil om CD133 for cscs «markør, våre resultater tyder på at i CD133
+ undergruppe inkludert en del av celler har egenskaper som hjelper cellene invadere og metastaserer, spesielt der manifest EMT fenotyper og uttrykke B7H1. En slik liten del av kreftcellene har kraftig tumorgenisitet og kan invadere og metastasere uten immunangrep, noe som kan lukkes til de teoretiske cscs i funksjonelle aspekter. Likevel er det fortsatt usikkert om EMT og B7H1 uttrykk for cscs er to uavhengige hendelser eller regulert av samme signalveien samtidig. Det ble vist at mTOR signal og hypoksi-induserbar faktor -1α, som var en viktig faktor for å indusere EMT, regulert CD133 uttrykk i kreftceller [43], noe som indikerer at CD133 uttrykk og EMT fenotyper var knyttet til hypoksi og kan bli regulert av mTOR signal. Videre B7H1 ble regulert av PTEN gjennom PI3K /AKT /mTOR signal i bukspyttkjertelkreft [44]. Disse studiene antydet at mTOR signalering kan være involvert i forholdet mellom EMT og immununndragelser i cscs. Deretter prøver vi å finne ut den viktige veien opptatt av EMT og immunevasion i cscs i videre studier, som kan være et avgjørende mål i kreftbehandling.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. CD133 er neppe uttrykkes i paraneplastic vev.
Immunofluorescensanalyse av frosne delen av tykktarmskreft prøven viser at det er en region med relativt normal ved kreft reir, hvor CD133 (rød) er noe svakere (til venstre) enn i kreft reir (til høyre) . DAPI (grå) ble anvendt for å farge atom. Det er vist en representant for tykktarms moderat differensiert adenokarsinom, T3N0M0. (Bar = 50 mikrometer)
doi: 10,1371 /journal.pone.0135528.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Dr Yongwen Chen for innsiktsfulle kommentarer, Prof. Lieping Chen for B7H1 antistoff og Wei Sun og Liting Wang for utmerket teknisk assistanse for bildesamlingen av laserskanning confocal fluorescens mikroskop.
