Abstract
Genome-wide assosiasjonsstudier (GWAS) har identifisert en rekke genetiske varianter assosiert med risikoen for lungekreft. Men disse loci forklare bare en liten brøkdel av lungekreft arvbarhet og andre varianter med svak virkning kan gå tapt i den GWAS tilnærmingen på grunn av den strenge betydning nivå etter multiple sammenlignings korreksjon. I denne studien, for å identifisere viktige veier som involverer lunge kreftutvikling, utførte vi en to-trinns sti analyse GWAS av lungekreft i Han-kinesere bruker genet satt berikelse analyse (GSEA) -metoden. Forhåndsdefinerte trasé ved BioCarta og KEGG databaser ble systematisk undersøkt på Nanjing studie (Discovery scenen: 1,473 tilfeller og 1,962 kontroller) og suggererende trasé var videre å få den godkjent i Beijing studie (Replication etappe: 858 tilfeller og 1,115 kontroller). Vi fant at fire baner (achPathway, metPathway, At1rPathway og rac1Pathway) var gjennomgående betydelig i både studier og
P
verdier for kombinert datasettet var 0,012 henholdsvis 0,010, 0,022 og 0,005. Disse resultatene var stabil etter sensitivitetsanalyse basert på genet definisjon og genet overlappinger mellom trasé. Disse funnene kan gi ny innsikt i etiologien av lungekreft
Citation. Zhang R, Zhao Y, Chu M, Wu C, Jin G, Dai J et al. (2013) Pathway Analysis for Genome-Wide Association Study of Lung Cancer i Han kinesiske befolkningen. PLoS ONE 8 (3): e57763. doi: 10,1371 /journal.pone.0057763
Redaktør: Ge Zhang, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 02.11.2012; Godkjent: 24 januar 2013; Publisert: 01.03.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er grunnlagt av China National High-Tech Research and Development Program Grant (2009AA022705) og delvis finansiert av National Key Basic Research Program Grant (2011CB503805) og Natural Science Foundation National of China (81072389, 30901232, 30730080, 30972541 og 30901233) Forskningsrådet funnet for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20113234110002), Jiangsu Natural Science Foundation (BK2011028), Foundation of Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner i Kina (11KJA330001 og 10KJA33034), det amerikanske National Institutes of Health Grant naturvitenskapelige universitet ( U19 CA148127), Forskningsrådet og Innovasjon Project for universitetsutdannet i Jiangsu-provinsen (CXZZ11_0733), og Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (PAPD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest diagnostisert kreft og de viktigste årsakene til kreft dødsfall globalt [1]. I Kina har forekomsten og dødeligheten av lungekreft vært økende raskt i de siste tre tiårene, hovedsakelig på grunn av tobakksforbruket [2]. Men genetiske faktorer spiller også en viktig rolle i lunge kreftutvikling. I løpet av de siste årene, har genom-wide assosiasjonsstudier (GWAS) identifisert mer enn 10 loci forbundet med risikoen for lungekreft med en beskjeden effekt for hver enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7], [8]. Men disse variantene utgjorde bare en liten brøkdel av arvbarhet av lungekreft [9], [10], [11].
Gitt at gen-gen interaksjoner kan bidra til komplekse sykdommer, har det vært foreslått at kombinere flere varianter med liten effekt sammen basert på biologiske mekanismer ved hjelp av GWAS data kan ha en tendens til å oppdage felles effekter av flere gener og for å markere den spesifikke pathway aggregert i en bestemt sykdom [12]. En stor andel av sykdomsresistensgener kan være funksjonelt relatert og /eller samvirke med hverandre i biologiske reaksjonsveier, og bare et lite antall av biologiske mekanismer kan hovedsakelig bidra til etiologien av kompleks sykdom [13]. Således har pathway baserte tilnærminger blitt anvendt for GWAS av flere komplekse sykdommer, og noen nye sykdoms følsomhet veier har blitt åpenbart i [14], [15], [16], [17], [18], [19] , [20], [21], [22], [23]. Nylig, Chung et al. (2012) [24] evaluert pathways forbundet med kreftrisiko lunge i fagene samlet av American Cancer Society tvers av alle amerikanske stater ved hjelp av en to-trinns tilfeldig skogbasert sti analysemetode basert på KEGG database (URL: http: //www.genome jp /kegg /pathway.html /), og identifisert 4 pathways assosiert med lungekreft blant p53 signalveien. I mellomtiden, Fehringer et al. (2012) [25] utført pathway analyse på kreftrisiko lunge i fagene samlet inn fra Sentral-Europa, Toronto, Tyskland og Texas bruker fire forskjellige metoder basert på Gene ontologi (GO) database (URL: https://www.geneontology.org/), og fant at acetylcholin reseptor aktivitet veien var signifikant assosiert med lungekreft, ved hjelp av to forskjellige metoder. Men ingen av veien analyser av lungekreft GWAS er rapportert i populasjoner av ikke-europeisk opphav til dags dato.
Flere metoder har blitt foreslått for pathway analyse [26], og en av de mest brukte metoden er genet sett berikelse analyse (GSEA) [16]. Kort fortalt er tre trinn brukes til sti-analyse i GSEA. Først blir individuelt-SNP krets analyse utført for å bestemme virkningen for hver SNP. For det andre er representant SNP med lavest
P
verdi tilordnet hvert gen, og alle genene er tildelt forhåndsdefinerte biologiske veier. Til slutt blir alle gener rangert etter sin betydning, og deretter skal vurderes hvorvidt en spesiell gruppe av gener som er anriket på toppen av rangert liste ved en tilfeldighet. Som et resultat, kan en klynge av biologiske relaterte SNPs som dukket opp i den øverste listen være potensielt assosiert med sykdommen som integrering.
I en storstilt GWAS av lungekreft i Han kinesiske befolkningen, vi har allerede validert tanke SNPs med en
P
verdi ≤1.0 × 10
-4 i uavhengige populasjoner og funnet fem nye lungekreft risikomessige loci med effektstørrelse (odds ratio) som strekker seg 0,84 til 1,35 på et genom-wide signifikansnivået [3], [4]. For ytterligere å dypt forstå den genetiske mekanismen for lungekreft og identifisere den avgjørende reaksjonsveien i lunge- kreftfremkallende, men for øyeblikket utføres en to-trinns reaksjonsvei analyse ved hjelp GSEA metode basert på eksisterende data i GWAS Han kinesisk befolkning. I fase 1, vist vi alle tilgjengelige baner i Nanjing studie med 1,473 tilfeller og 1,962 kontroller. I fase 2, trasé med
P
verdier ≤0.05 og
FDR
≤0.50 ble validert i Beijing studie med 858 tilfeller og 1,115 kontroller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne samarbeidsstudie ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i Kina Medical University, Tongji Medical College, Fudan University, Nanjing Medical University og Guangzhou Medical College med skriftlig informert samtykke fra alle deltakere [27 ], [28], [29], [30].
deltagerne
studien fag var fra en pågående to-senter GWAS av lungekreft i Kina, inkludert Nanjing studier og Beijing studere. Detaljene for befolkning er blitt beskrevet andre steder [3]. Kort fortalt var det 1,473 saker og 1,962 kontroller i Nanjing studien, 858 saker og 1,115 kontroller i Beijing studie etter kvalitetskontroll. Alle lunge krefttilfeller ble histopathologically eller cytologisk bekreftet av minst to lokale patologer. Alle kontroller ble valgt ut fra de som fikk rutinemessige fysiske undersøkelser i lokale sykehus eller de som deltar i samfunnet screening av ikke-smittsomme sykdommer og frekvens-matchet for alder, kjønn og geografiske regioner til hvert sett av lungekrefttilfeller.
Genotyping og kvalitetskontroll
Genotyping ble utført ved hjelp av en Affymetrix Genome-Wide Menneskelig SNP Array 6.0. En systematisk kvalitetskontroll prosedyren ble søkt om både SNPs og individer før sti analyse [3]. Kort fortalt SNPs ble ekskludert hvis de ikke kart på autosomal kromosomene, hadde en takst 95%, mindre allel frekvens (MAF) 0,05,
P
1 x 10
-5 for Hardy-Weinberg likevekt (HWE) i kombinerte prøver av to studier eller
P
1 x 10
-4 for HWE i enten Nanjing eller Beijing studieprøver. Vi fjernet prøver med takst 95%, tvetydig kjønns, familiære relasjoner, ekstrem heterozygositet rente og rammene. Til slutt, totalt 2,331 tilfeller og 3,077 kontroller (Nanjing studie: 1,473 saker og 1,962 kontroller, Beijing studie: 858 tilfeller og 1,115 kontroller) med 570,373 SNPs ble holdt i påfølgende pathway analyse
Pathway data Konstruksjon
Vi har samlet trasé fra to offentlige ressurser: KEGG og BioCarta database (URL: https://www.biocarta.com/). Trasé som inneholder gener fra 10 til 200 ble inkludert i denne studien. Dette genet tallintervallet var egnet til å redusere flere sammenligning problemet og for å unngå testing altfor smale eller brede funksjonelle genet kategorier [22]. Pathway overlapping ble definert som andel av felles gener til totalt de av to veier [14].
Statistical Analysis
Logistisk regresjonsmodell med justering for alder, kjønn, pakke-år av røyking og de første fire hovedkomponenter som stammer fra EIGENSTRAT 3.0 [31] ble brukt til å evaluere foreningen betydningen av hver SNP hjelp GLM pakke henrettet i R (versjon 2.14.0; R Foundation for Statistiske Computing). SNP’er ble tildelt til et gen hvis de ligger innenfor 50 kb nedstrøms eller oppstrøms for genet. Betydningen av hvert gen ble avledet fra den representative SNP. Alle gener ble tildelt veier. Så sammenhengen mellom risikoen for lungekreft og hver sti ble evaluert av Gengen programvare [16] ved bruk av vektet Kolmogorov-Smirnov-lignende løping sum statistikk (merket med berikelse score,
ES
), som reflekterte overrepresentasjon av en klynge av gener innenfor denne bane på toppen av hele rangert liste av gener i genomet. Vi tilfeldig stokket det case-control status for 1000 ganger, og gjentok disse trinnene over for å få permut pathway foreningen resultater. Dermed blir normalisert
ES
etter justert for ulike størrelser av gener, kan bli kjøpt via permutasjon prosedyren. I mellomtiden
P
verdien av hvert reaksjonsvei og den falske funnraten (FDR) for å holde andelen av forventede falske positive resultater ble utledet. Betydningen nivået av trasé analyse ble satt til å være
P
≤0.05 og
FDR
≤0.5.
Resultater
genetisk informasjon og Prior biologisk informasjon som brukes i Pathway Analysis
av totalt 570,373 genotypede SNPs, ble 340,060 SNPs kartlagt i 17,225 gener innen 50 kb oppstrøms eller nedstrøms. Blant dem, ble 135,160 SNPs slutt tildelt 3,514 gener innenfor de forhåndsdefinerte baner (41,560 SNPs til 1003 gener i BioCarta trasé og 120 864 SNPs til 3134 gener i KEGG trasé). Alle gener ble tildelt 368 trasé som inneholdt 10 200 gener (191 trasé som brukes i BioCarta database, 177 trasé som brukes i KEGG database) i følgende sti analyse.
Resultater av Pathway Analysis bruker GSEA Metode
Som vist i tabell 1, totalt 22 veier var signifikant (
P
≤0.05,
FDR
≤0.5) i Nanjing studien. Blant dem ble fem trasé vellykket kopiert i Beijing studien, inkludert achPathway (
P
= 0,007), agrPathway (
P
= 0,033), At1rPathway (
P
= 0,003 ), metPathway (
P
= 0,007) og rac1Pathway (
P
= 0,041). Etter å kombinere de to studiene, fire av fem replikert veier forble betydning, inkludert achPathway (
P
= 0,012), At1rPathway (
P
= 0,022), metPathway (
P
= 0,010) og rac1Pathway (
P
= 0,005). Mens, i KEGG database, ble det ikke sti identifisert (data ikke vist). Blant de store baner (
P
≤0.05) for det kombinerte datasettet av de to studiene (tabell S1 i File S1), disse fire identifisert trasé ble rangert på topp liste (No.1 for rac1Pathway, No. 3 for metPathway, No.4 for achPathway og No.5 for At1rPathway)
for achPathway, 9 av 16 som hadde SNPs med
P
verdier. 0,05; Tilsvarende ble 15, 14 og 18 viktige gener observert blant 28 gener i At1rPathway, 32 gener i metPathway og 23 gener i rac1Pathway hhv. De representative SNPs med lungekreft på
P
verdier og 0,01 for hvert gen i disse 4 trasé vist i tabell 2.
sensitivitetsanalyse av Pathway-baserte foreningen
for å evaluere påvirkningen av SNP-til-genkartlegging strategi på vei analyse, vi videre kartlagt SNP’er til gener innen 20 kb oppstrøms eller nedstrøms. Tjuetre trasé var betydelig i Nanjing studien, og 7 av dem ble kopiert i Beijing studien. Etter å kombinere to studier sammen, tre veier (achPathway, metPathway og rac1Pathway) var fremdeles signifikant (0,019, 0,005 og 0,004 henholdsvis) (tabell S2 i File S1). Disse tre veier ble også identifisert i den innledende analyse tilnærming. I tillegg At1rPathway som ble identifisert i den innledende analysen var også viktig for kombinert datasettet (
P
= 0,015) om
P
verdi var 0,086 i Nanjing studien. For de betydelige trasé observert i Nanjing studien ble 19 trasé påvist i begge tilnærminger ved hjelp ’50 kb regelen og ’20 kb regelen og samstemmighet var 73,08% (19/26) mellom to tilnærminger.
med tanke på overlapping av gener mellom stier, vi beregnet parvise overlappinger mellom 4 identifiserte stier og fant lapper prisene varierte fra 6,25% til 25,00% (tabell S3 i File S1). Siden bare betydelige gener i trasé bidratt til de endelige resultatene, vi re-beregnet overlappinger mellom disse banene ved hjelp av sine betydelige gener, og de overlapper prisene var fra 4,17% til 18,75% (tabell S3 i File S1). Videre fire gener (
PAK1
,
PIK3R1
,
PTK2
, og
PTK2B
) som bidro til mer enn 2 baner (Tabell S4 i File S1), ble ytterligere fjernet fra trasé for sensitivitetsanalyse. Som et resultat av de fire identifiserte baner (achPathway, metPathway, At1rPathway og rac1Pathway) var fremdeles signifikant (Tabell S5 i File S1) i kombinerte datasettet (
P
= 0,033, 0,040, 0,039 og 0,012, respektivt).
Diskusjoner
GWAS har nå identifisert en rekke loci assosiert med sykdommer /egenskaper, som har kraftig forbedret vår forståelse av genetiske mekanismen av disse fenotyper. Men som den strenge kvalitetskontroll prosedyre og streng korreksjon på flere sammenligninger brukes i GWAS, individuelle SNPs som virkelig er forbundet med fenotyper med beskjeden effekt kan ha gått tapt. Derfor kan en vei basert tilnærming som vurderer den kumulative bidrag av funksjonsrelaterte gener gi ny innsikt i biologien til en bestemt sykdom utnytte GWAS data. GSEA har to viktige fordeler sammenlignet med andre metoder [16], [26]. Først utfører den to-trinns permutasjon-basert korreksjon prosedyre som effektivt justerer for ulike størrelser av gener og bevarer korrelasjoner av SNPs i det samme genet. For det andre kan kovariater som alder, kjønn eller befolkningen lagdeling i GWAS justeres i GSEA. Derfor, i denne studien, brukte vi GSEA og identifisert fire baner (achPathway, metPathway, At1rPathway og rac1Pathway) som kan spille en viktig rolle i utviklingen av lungekreft i Han kinesiske befolkningen. Disse funnene var stabil etter sensitivitetsanalyse når de vurderer SNP-til-genet kartlegging tilnærming og genet overlapping mellom trasé.
achPathway (Role of nikotin acetylkolin reseptorer i reguleringen av apoptose) ble identifisert til å være de beste trasé assosiert med lungekreft i denne studien. Nikotiniske acetylkolinreseptorer (nAChR) er avgjørende for nevromuskulær signalering og har også blitt funnet på ikke-nevronale celler, så som bronkiale epitelceller og lungekreft cellelinjer [32], [33], [34]. Nikotin og dens avledede karsinogene nitrosaminer kan spille en viktig rolle i patogenesen av lungekreft gjennom binding til nAChR-er uttrykt i lunge epitelceller, som i hovedsak skyldes motstanden av kreftceller til apoptose [35]. Maneckjee et al. (1994) viste at lave konsentrasjoner av nikotin kan blokkere induksjonen av apoptose i lungekreftceller [33]. I tillegg til utviser resistens mot apoptose, har flere studier vist at nAChR-er kan indusere celleproliferasjon og angiogenese [36], [37], som begge er involvert i dannelsen av kreft.
Viktigere, flere GWAS basert på kaukasiske populasjoner har konsekvent identifisert 15q25 som lungekreft mottakelighet region [5], [6], [7], som inneholder nikotin acetylkolin reseptor subenhetgen klynge, husing
CHRNA5
,
CHRNA3
og
CHRNA4
gener.
TERT
er inkludert i achPathway og dens representative SNP rs2736100 har blitt identifisert som et lungekreft mottakelighet locus i ulike etniske populasjoner [3], [8], spesielt i asiatiske populasjoner [38], [39], [40].
i At1rPathway (Angiotensin II mediert aktivering av JNK Pathway via Pyk2 avhengige signalering), Clereet. al (2010) foreslo at angiotensin II type 2 reseptor (AT2R) ville fremme svulst utvikling, både ondartet cellevekst og tumor angiogenese [41]. Over-ekspresjon av angiotensin II type 2 reseptor genet induserer celledød i lunge adenokarsinomceller [42], [43]. Den avvikende aktivert JNK vei kan føre til patologisk celledød og ulike sykdommer, inkludert kreft [44], mens mutasjoner i JNK veien kan også være involvert i kreftutvikling [45].
For metPathway (signale av hepatocytter Vekst Factor receptor), den hepatocytt-vekstfaktor-reseptor, også kalt c-Met, blir aktivert av hepatocytt-vekstfaktor (HGF). Avvikende c-Met signale spiller viktige roller i patogenesen og biologi kreft hos mennesker [46]. I mellomtiden, mutert og over-uttrykt former av c-Met er forbundet med onkogenese og metastasering, noe som gjør c-Met et potensielt terapeutisk mål for kreft narkotika [47], [48]. Interessant, kan c-Met og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR-hemmere) synergi hemme celleproliferasjon og fremme apoptose i lungekreft [49]. Yano et al. (2008) foreslo at HGF-mediert MET aktivering kan indusere gefitinib motstand i lunge adenokarsinom med
EGFR
aktiverende mutasjoner [50].
For rac1Pathway (Rac en cellemotilitet signalveien), rac-1 er et lite GTP-bindende protein i Rho familien som regulerer celle motilitet og proliferasjon som respons på ekstracellulære signaler [51]. I mellomtiden kan Rac-en fungere som onkogener i fibroblaster når over uttrykt [52]. Rab5 kan indusere aktivering av Rac gjennom flere mekanismer, Rab5-regulert omsetning av Rac er involvert i celle-motilitet, som også kan påvirke cellemigrering under morfogenese og kreft metastase [53], [54]. I mellomtiden, Rac aktivering av IRSp53 /Eps8 kompleks spiller en viktig rolle i metastatisk oppførselen til ondartet svulst celle [55].
I tillegg har vi også sjekket de rapporterte trasé ved Chung et al. (2012) og Fehringer et al. (2012) i vår studie. Interessant, den sterkeste krets rapportert av Fehringer et al. (2012) var den acetylcholin reseptor aktivitet svei mens achPathway ble identifisert i denne studien. Noen studier har vist at aktivering av nikotiniske acetylcholin-reseptorer kan endre apoptotisk signalering, så vel som stimulerer proliferasjon, som begge spiller en viktig rolle i lunge karsinogenese [56], [57], [58]. Resultatene gående støtter betydningen av de 2 veier i utvikling av lungekreft, som er biologisk plausibel. Vi har imidlertid ikke funnet signifikante signaler for andre rapporterte veier. Dette kan forklares med etnisk heterogenitet, ulike sti analysemetoder eller definisjon av trasé fra ulike databaser.
Denne studien har flere sterke sider. Først spilte vi en to-trinns sti analyse i to uavhengige populasjoner, noe som kan redusere falske positive funn og øke troverdigheten av resultatene. For det andre, de fire identifiserte trasé var fortsatt stabilt etter sensitivitetsanalyse når de vurderer SNP-til-genet kartlegging tilnærminger og genet overlapping mellom trasé. Dette punktet samt viktig biologi av de identifiserte trasé i lunge kreftutvikling har økt vår tillit til at våre funn kan være sant annet enn bare ved en tilfeldighet. Likevel, flere begrensninger er også behov for å bli behandlet i denne studien. For det første kan ufullstendig annotering av menneskelige genom redusere studien makt for sti analyse, siden mange gener med ukjent funksjon ikke kan tildeles kjente stier og intergeniske SNPs fysisk fjerne fra gener ble ikke tatt ennå. Dermed kan videre studier basert på forbedret genom-merknaden database gi ytterligere forståelse i genetikk av lungekreft. For det andre, forskjellige pathway databaser har ulike retningslinjer for sti bygging. Følgelig kan genet innholdet av reaksjonsveier som representerer den samme biologiske prosessen variere betydelig mellom ulike databaser [14]. Vi kun fokusert på KEGG og BioCarta databasene som kan ha begrenset vår analyse på grunn av iboende definisjon av veien, selv om disse to databaser har vært vanlig brukt i reaksjonsveien analyse [19], [22], [24]. Til slutt, er det bedre å utføre genet fritt interaksjonsanalyse eller gen-gen interaksjonsanalyse for å diskutere videre på involvering av disse fire baner i røyke-relatert kreftutvikling. Vi vil undersøke dem i våre fremtidige studier.
I sammendraget, denne studien gjennomførte en to-trinns sti analyse i GWAS av lungekreft i Han-kinesere bruker GSEA metode, og identifisert fire baner (achPathway, metPathway, At1rPathway og rac1Pathway) forbundet med risikoen for lungekreft. Disse funnene kan være et viktig supplement for GWAS og gi ny innsikt i biologi for lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Tabell S1. Rangeringen av trasé basert på kombinerte datasett fra Nanjing og Beijing studier. Tabell S2. Sensitivitetsanalyse av reaksjonsveien Analyse for gener som er definert av SNP’er innen 20 kb oppstrøms eller nedstrøms. Tabell S3. Gene overlappinger mellom 4 identifisert trasé for alle genene definert av BioCarta database eller gener med betydelige representative SNPs (
P
0,05)
a. (A) nederst til venstre på symmetrisk matrise er antall lapper gener mellom parvise trasé og deres totale genet nummer. Øverst i høyre del er overlappforholdet mellom parvise trasé (%). Tabell S4. Gener med betydelige representative SNPs (
P
≤0.01) bidratt til flere veier. (A) Avledet fra logistisk regresjonsmodell med justering for alder, kjønn, pakke-års røyking og hovedkomponentene i kombinerte datasett fra Nanjing og Beijing studier. Tabell S5. Resultatene av sensitivitetsanalyse for fire identifiserte veien etter å fjerne betydelige overlappende gener (
PAK1
,
PIK3R1
,
PTK2 Hotell og
PTK2B
).
doi: 10,1371 /journal.pone.0057763.s001 plakater (docx)
takk
forfatterne takke alle forsøkspersonene, forskere og studenter som deltok i dette arbeidet. Vi setter også to anonyme anmeldere for sine verdifulle forslag til dette manuskriptet.
