Abstract
Utvikling av målrettede molekylære terapi har gitt bemerkelsesverdige fremskritt i behandlingen av kreft hos mennesker. Men i de fleste svulster i seleksjonspress utløst av legemidler mot kreft oppfordrer kreftceller til å erverve resistensmekanismer. Generering av nye rasjonelt utformet målretting midler som onkogene banen (e) på flere nivåer er en lovende metode for molekylær terapi. 2-fenylimidazo [2,1
b
] Benzothiazole derivater er blitt fremhevet for sine egenskaper rettet mot onkogene Met reseptortyrosinkinasehemming (RTK) signalering. I denne studien evaluerte vi den virkningsmekanismen til en av de mest aktive imidazo [2,1-
b
] benzotiazol-2-ylfenyl moiety-baserte midler, Triflorcas, på et panel av kreftceller med distinkte egenskaper. Vi viser at Triflorcas hemmer in vitro og in vivo tumorigenesis av kreftceller som bærer Met mutasjoner. Dessuten vanskeliggjør Triflorcas overlevelse og forankrings-uavhengig vekst av kreftceller, karakterisert ved «RTK bytting» ved å forstyrre PDGFRp fosforylering. En behersket virkning av Triflorcas på metabolske gener korrelerer med fravær av store bivirkninger in vivo. Mekanistisk, i tillegg til målretting Met, Triflorcas endrer fosforylering nivåer av PI3K-Akt veien, onkogene mediere avhengighet til Met, i tillegg til retinoblastom og nucleophosmin /B23, noe som resulterer i endret cellesyklusprogresjon og mitotisk svikt. Våre funn viser hvordan den uvanlige binding plastisitet av Met aktive sete mot strukturelt forskjellige inhibitorer kan utnyttes til å generere legemidler i stand til å målrette Met onkogene avhengighet ved forskjellige nivåer. Videre sykdommen orienterte NCI Anticancer Drug Screen avdekket at Triflorcas utløser en unik profil av veksthemmende-respons på kreftcellelinjer, noe som indikerer en ny mekanisme av narkotika handling. Den anti-tumor aktivitet utløst av to-fenylimidazo [2,1
b
] Benzothiazole derivater gjennom kombinert hemming av forskjellige effektorer i kreftceller avsløre dem til å være lovende kreftlegemidler for videre etterforskning.
Citation: Furlan A, Roux B, Lamballe F, Conti F, Issaly N, Daian F et al. (2012) Kombinert Drug Handling av 2-fenylimidazo [2,1
b
] Benzothiazole Derivater på kreftceller i henhold til deres Oncogene Molecular signaturer. PLoS ONE 7 (10): e46738. doi: 10,1371 /journal.pone.0046738
Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, Tyskland
mottatt: May 25, 2012; Godkjent: 04.09.2012; Publisert: 05.10.2012
Copyright: © Furlan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Inca (Institut National du Cancer), ARC (Association pour la recherche contre le cancer), FRM (Fondation pour la recherche MEDICALE), FDF (Fondation de France), Fondation Bettencourt-Schueller, Marie Curie Host Fellowship for overføring av kunnskap (MTKD-CT-2004-509804), Protisvalor, Valorpaca, og OSEO til FM. Denne forskningen har blitt utviklet innen CM0602 COST Handling «hemmere av angiogenese: Design, syntese og biologisk utnyttelse». AF ble støttet av Inca og ARC; NI av Valorpaca, FC av den italienske foreningen for kreftforskning (ARC) og ved OSEO. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har mottatt støtte fra Protisvalor. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
reseptortyrosinkinasehemming (RTK) signal har vært innblandet i tumor evolusjon for sin evne til innflytelse celle skjebne gjennom endringer i viktige regulatoriske kretser [1] – [3]. Som dokumentert av kreft genomiske studier, er RTK signal en kjerne veien ofte endres i human kreft [4], [5]. Vi har nylig vist relevansen av signal noder sammenhengende RTK og p53 kjerne trasé og virkningen av målretting slike noder i løpet av svulst evolusjon [6], [7]. Relevansen av endrede RTK i onkogenese har trukket enorm interesse for å identifisere midler som kan dempe sin aktivitet og funksjon. Til dags dato er molekylær terapi for «RTK-avhengige» kreftceller i hovedsak basert på anvendelse av forbindelser som selektivt målrette onkogene RTK [1]. Imidlertid har suksessen til disse strategiene vært begrenset fordi hemming av «primær RTK-avhengighet» utløser et selektivt press på kreftceller til å erverve resistens gjennom «RTK swapping» [8], [9]. Disse begrensningene pålegge identifikasjon, eller den kombinerte bruk av midler som ikke bare er rettet mot RTK signaleringsavhengighet, men også hemme tilpasning på grunn av redundans i RTK signaleringsnett [10].
En måte å omgå «RTK bytte «kan være identifisering av narkotika forstyrrer onkogen avhengighet ved å opptre på flere nivåer i avhengighet banen. Et eksempel på dette konseptet er levert av Sorafenib, en liten kjemisk middel i stand til å hemme flere RTK’er, inkludert VEGFR, PDGFRp, Kit, FGFR1, Ret, og den intracellulære Raf kinase [11]. Den bredspektret aktivitet av Sorafenib i flere kreft modeller er sannsynlig på grunn av det store omfanget av sine mål. Likevel er Sorafenib aktivitet i noen typer av tumormodeller tilskrives samtidig hemming av RTK-drevet angiogenese og RTK nedstrøms Raf /MAPK-reaksjonsveien [11]. Den generasjonen av agenter, som er rettet mot onkogene sti (er) på flere nivåer, er ikke en enkel sak som tydelige mål krever en presis stoffet struktur og kjemiske modifikasjoner av narkotika kan enten påvirke selektivitet (f.eks ved å målrette flere RTK), effektivitet, eller toxcicity . I motsetning til andre RTK’er, er hepatocytt vekstfaktor (HGF) reseptoren Met kjennetegnes ved uvanlig strukturell plastisitet som dets aktive sete kan innta distinkt inhibitor-bindingsmåter [12]. Faktisk, et bredt spekter av små-molekyler har blitt oppdaget som inhibitorer Met [13], [14]. Likevel fortsetter arbeidet med å avdekke nye anti-Met midler for målrettet terapi og tilknyttede resistensmekanismer [8], [15] -. [17]
For å identifisere kjemiske midler som kan hemme onkogen Met signalering i kreftceller, vi tidligere søkt en Met-fokusert celle-basert skjerm. Vi hadde begrunnet at en slik strategi ville tilby muligheten for å identifisere forbindelser som kan: a) framprovosere hemmende effekter direkte på Met; b) målrette andre viktige komponenter i Met signalkaskade; c) være godt tolerert på grunn av begrensede toksiske effekter på biologisk aktive konsentrasjoner [18] – [20]. Vi har rapportert at nye aminosyreamider inneholdende imidazo [2,1-
b
] benzotiazol-2-ylfenyl-del target Met direkte og inhibere onkogen Met funksjon, uten å fremkalle store bivirkninger in vitro [19]. I denne studien utforsket vi anticanceraktiviteten til en av de mest aktive midler har vi identifisert, Triflorcas (TFC), på et panel av kreftceller med forskjellige egenskaper og undersøkt dens mekanisme for legemiddelvirkningen av en rekke komplementære tilnærminger. Vi viser at Triflorcas rettet mot kreftceller enten bærer Møtte mutasjoner eller preget av RTK bytte. Vi viser at Triflorcas er godt tolerert in vivo og som ikke i betydelig grad endrer ekspresjonen av flere celle-toksisitet og stressgener. Biokjemiske og fosfo-screening array-studier viste at Triflorcas overveiende endrer fosforylering nivåer av PI3K /Akt svei, som sikrer onkogen avhengighet til Met, samt Retinoblastom (Rb), og nucleophosmin /B23. Disse endringer funksjonelt korrelert med forandringer i cellesyklusprogresjon liggende mitotisk svikt. Selv Triflorcas anticancer aktivitet korrelerer med sine hemmende effekt på Met, dets narkotika virkningsmekanismer kan ikke bare begrenset til Met målrette seg selv. Den unike evne Triflorcas å modulere flere veier deregulerte i tumorceller med avvikende Met signaliserer ytterligere styrker utsiktene til å utnytte den fleksible bindende modus kapasitet på Met aktive området for å identifisere nye agenter med hemmende egenskaper mot signaliserer mål som kreves for å utføre onkogene programmet. Endelig vurdering av den hemmende respons profil på kreftceller gjennom National Cancer Institute kreft narkotika skjermen tyder på at Triflorcas er preget av en ny mekanisme av narkotika handling. Bioinformatikk studier indikerer mulige molekylære signaturer som korrelerer med kreft følsomhet for imidazo [2,1
b
] benzotiazol-2-ylfenyl moiety-baserte agenter.
Resultater
Triflorcas hemmer overlevelse og Anchorage uavhengig Vekst av humane kreftceller bære~~POS=TRUNC mutert Met
Vi først undersøkt effekten av Triflorcas på to human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler bærer Møtte mutasjoner: H2122 og H1437 celler, husing punktmutasjoner i aminosyreresten N375S og R988C, henholdsvis [21]. Triflorcas nedsatt overlevelse og forankringsuavhengig vekst av H2122 og H1437, henholdsvis (figur 1A og B). Ingen av Met-inhibitorer som anvendes som referanseforbindelser, som for eksempel SU11274, crizotinib, og PHA665752 blandet med overlevelse og in vitro tumorigenesis av disse cellene (figur 1A og B). I motsetning til dette alle testede inhibitorer svekket overlevelse og forankringsuavhengig vekst av human gastrisk karsinom GTL-16, karakterisert ved Met forsterkning (figur 1A og B), som tidligere rapportert [19], [21]. Disse data antyder at Triflorcas utøver en markant inhiberende virkning på kreftceller med Met mutasjoner, som ikke er følsomme for andre inhibitorer Met, i tillegg til celler som bærer Met forsterkning.
(A) Overlevelse av H2122 og GTL-16 cellene ble redusert med Triflorcas ved angitte konsentrasjon (uM; n = 3). I motsetning til dette SU11274 (SU), crizotinib (crizo), og PHA665752 (PHA) svekket overlevelse av GTL-16, men ikke av H2212-celler. Celler ble serum-sultet i 24 timer og deretter inkubert med forbindelser i 48 timer. (B) Triflorcas blokkerte forankringsuavhengig vekst av H1437 og GTL-16-celler på en doseavhengig måte (n = 3). SU11274, crizotinib, og PHA665752 svekket in vitro tumorigenesis av GTL-16, men ikke fra H1437 celler. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. ** P 0,01; *** P 0,001; Student-
t
test.
Triflorcas forstyrrer Met Fosforylering, med Met lokalisering, og med PI3K-Akt Pathway Activation
Vi har tidligere vist at Triflorcas griper med Met fosforylering i levende celler, og med Met-aktivering in vitro [19]. Vi undersøkte derfor effekten av Triflorcas på Met i H1437 celler ved å følge Met fosforylering på to tyrosinrester plassert i sitt kinase domene, Tyr
1234 og Tyr
1235. Immunocytokjemisk analyse viste Met fosforylering hovedsakelig på plasmamembranen når H1437 cellene ble utsatt for HGF stimulering (figur 2A). Spesielt, har vi funnet at Triflorcas fører til endringer i fosforylert Met: a) nedregulering av sine fosforylering nivåer og b) en dominerende lokalisering i intracellulære (Figur 2A). Behandling med klorpromazin, et kationisk amfipatisk stoff som hemmer clathrin endocytose, restaurert fosfo-Met lokalisering på cellemembran, og indikerer således at Triflorcas forbedrer Met internalisering (figur 2A) Redusert Met fosforylering ble også observert i proteinlysatene fra H1437 celler ledsaget av reduserte Møtte protein nivåer (figur 2B). Densitometrisk analyse viste at Met nedregulering gjennom endocytose bevirker reduksjonen i Met-fosforylering (data ikke vist). Konsekvent, fant vi redusert fosforylering av Gab1, som er en umiddelbar signal Målet Met (figur 2B).
(A) Met fosforylering ble analysert ved immuno-cytochemistry på H1437-celler ubehandlet, behandlet med HGF, med Triflorcas (TFC, 10 mikrometer i 24 timer) eller med Triflorcas (10 mm i 24 timer) pluss klorpromazin (Chlor, 10 mikrogram /ml for 2 timer), etterfulgt av HGF stimulering (20 ng /ml i 30 minutter). Triflorcas reduserte nivåene av Met fosforylering indusert av HGF. Merk også at HGF-indusert fosfo-Met er lokalisert på plasmamembranen til kontrollceller, mens det vises internalisert i celler eksponert for Triflorcas. Endocytose inhibering med klorpromazin medikament gjen fosfo-Met lokalisering på cellemembran. Piler indikerer klynge av fosforylert Met på plasmamembranen (40X forstørrelse). (B) HGF-indusert (20 ng /ml) fosforylering nivåer av Met, Gab1, Akt, og p70
S6K ble redusert i H1437 celler eksponert for Triflorcas. Derimot ble det ikke observert noen endringer på ERK fosforylering nivåer. Lignende uttrykk nivåer av total Gab1, Akt, og p70
S6K ble også funnet, noe som indikerer at Triflorcas forstyrret deres fosforylering snarere enn med sine uttrykk nivåer. Western blot analyser ble utført på totale proteinlysatene. (C) fosforylering nivåer av Akt, P70
S6K, og S6 ribosomal protein, men ikke ERKs, ble redusert i GTL-16 celler eksponert for Triflorcas. Aktin eller Tubulin proteinnivåer ble anvendt som laste- kontroller i alle eksperimenter (nedre paneler i B og C). (D og E) Anchorage-uavhengig vekst av H1437 (D) og GTL-16 (E) celler ble svekket i nærvær av Triflorcas (TFC), LY294002 (PI3K-hemmer), eller A443654 (Akt hemmer). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. ** P 0,01; *** P 0,001; Student-
t
test.
Den biologiske effekten av Triflorcas på celler som bærer Møtte mutasjoner og Met forsterkning (figur 1) [19] ledet oss til å evaluere fosforylering status for RTK nedstrøms effektorer. Blant trasé som kreves i kreftceller med onkogene Met, har det vist seg at bare en delmengde av Met-aktiverte trasé opprett avhengigheten av kreftceller på Met. Spesielt Ras /ERK og PI3K /akt er to veier som hovedsakelig sikrer avhengighet av onkogene Met [22]. Vi har derfor undersøkt om Triflorcas begrenser aktiveringen av disse to veier ved å følge fosforylering nivået av ERK og Akt i H1437 celler. Ingen signifikante endringer ble observert på HGF-indusert ERK-fosforylering når H1437 cellene ble utsatt for Triflorcas (figur 2B). I motsetning til dette ble Akt fosforylering signifikant redusert etter Triflorcas behandling (figur 2B). Redusert fosfo-Akt Parallelt med en reduksjon i fosforyleringen nivåene av dets nedstrøms signal p70
S6K (figur 2B). Konsekvent, redusert fosforylering nivåer av Akt og dens nedstrøms signaler p70
S6K og S6 ribosomal protein, men ikke ERKs, ble observert også i GTL-16 celler (Figur 2C). Vi bekreftet den funksjonelle relevansen av intakt PI3K /Akt system for forankringsuavhengig vekst av H1437 og GTL-16 celler ved farmakologisk blokkere aktivering med LY294002 (PI3K hemmer) eller A-443654 (Akt hemmer) (figur 2D, E, S1 A, og 1B). Nedgangen av Akt fosforylering etter Triflorcas behandling ble også observert i ErbB1-avhengige human brystkreft BT474 celler, hvor ErbB1 fosforylering nivået uendret (figur S1C) [19]. Til sammen indikerer disse resultatene at reduksjonen av PI3K /Akt reaksjonsvei aktivering ved Triflorcas er ikke bare et resultat av hemmingen av oppstrøms RTK aktivitet. Vi fant også at Akt aktiviteten ikke er nødvendig for overlevelse av BT474 celler (Figur S1D). Disse resultatene gir innsikt i BT474 celle motstand mot Triflorcas behandling ved å vise at deres avhengighet til onkogene ErbB1 er sikret av veien (s) enn PI3K /Akt. Sammen utgjør disse funnene viser at anti-tumor aktivitet utløst av Triflorcas skjer gjennom kombinert utfall på forskjellige effekt involvert i RTK-drevet onkogen avhengighet.
Triflorcas Svekker in vivo Tumor Vekst av humane kreftceller Bære Met Mutation, Without forårsaker store bivirkninger
Vi har nylig rapportert at Triflorcas er godt tolerert av primære nerveceller og leverceller [19]. For å vurdere ytterligere potensiell terapeutisk anvendelse av denne forbindelse, vurderte vi hvorvidt det er også godt tolerert etter in vivo administrering. Triflorcas ble intra-peritonealt injisert i mus i en dose på 30 mg.kg
-1 hver dag. Ettersom kroppsvekt er et generisk indikator for dyr fysiologi påvirkes, for eksempel ved metabolisme, dyr aktivitet, og foringsadferd, ble vekten av Triflorcas-behandlede mus fulgt over tid. Ingen signifikante forskjeller ble funnet versus kontroller og gjennom behandling (
P
0,05; figur 3A). Vi målte også vekten av hjerte, milt, nyre og lever fra mus behandlet i 21 dager, og ingen forskjeller ble funnet mellom de to gruppene (
P
0,05; figur 3B).
(A) Utvikling av kroppsvekt hos mus, behandlet intra-peritonealt med enten bærer eller Triflorcas (TFC; 30 mg.kg
-1 hver dag), viste ingen signifikante forskjeller. Kroppsvekt uttrykkes som vekt utvikling over den 21 dagers behandlingsperiode. (B) Vekten av hjerte, milt, nyre og lever ble evaluert i mus daglig injisert med Triflorcas (30 mg.kg
-1) eller bærer i 21 dager. Ingen ble observert signifikante forskjeller. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M.
P
0,05. (C og D) Triflorcas behandling (i.p. 30 og 60 mg.kg
-1 annenhver dag) reduserte tumorvolum (C) og vekt (D) i nakne mus injisert subkutant med H1437 celler. Crizotinib (50 mg.kg
-1 daglig) svekket ikke tumorvekst. Verdier er rapportert som boksplott og uttrykt som betyr ± standardavvik *
P
0,05; Student-
t
test.
Vi viste tidligere at Triflorcas utløser tumorvekstinhibitering av GTL-16 celler in vivo (figur S2) [19]. Vi har derfor bestemt hvorvidt antitumor handlingen av Triflorcas observert in vitro på H1437 celler kan også være dokumentert in vivo ved hjelp xenopodet nakne mus. H1437-celler (5 x 10
6) ble subkutant injisert inn i nakne mus. Etter svulstdannelse, ble musene behandlet med Triflorcas, crizotinib, eller bæreren alene, og tumorvekst ble undersøkt under og etter behandling. Spesielt, fant vi en 58,7% og 59% reduksjon i tumorvolumet når Triflorcas ble gitt med en dose på 30 mg.kg
-1 eller 60 mg.kg
-1 annenhver dag, henholdsvis (kontroll: 82.4 mm
3 ± 78,2; 30 mg.kg
-1 Triflorcas injeksjon: 34,0 ± 24,5;
P
= 0,04; 60 mg.kg
-1 Triflorcas injeksjon: 33,8 ± 24,2;
P
= 0,04, figur 3C). En reduksjon av tumorvekt ble også observert i Triflorcas-behandlede mus (kontroll: 147,1 mg ± 92,5; 30 mg.kg
-1 Triflorcas injeksjon: 79,1 ± 58,1,
P
= 0,03; 60 mg. kg
-1 Triflorcas injeksjon: 62,0 ± 38,9,
P
= 0,01; Figur 3D). I motsetning til dette ble ingen reduksjon i tumorvekst funnet i mus behandlet med crizotinib i doser på 50 mg.kg
-1 hver dag (tumorvolum: 118,6 mm
3 ± 69,4; tumorstørrelse: 205,0 mg ± 84,8; Figur 3C og D), i overensstemmelse med tidligere studier [21]. Samlet utgjør disse funnene viser at in vivo Triflorcas utløser tumorvekstinhibitering av kreftceller med onkogene Met. Videre fraværet av bivirkninger indikerer at Triflorcas tolereres godt når de injiseres i mus i doser som kreves for å utløse sin anti-tumoreffekter.
Små endringer i genekspresjon Profil av stress og Toxicity Pathways ved Triflorcas korrelere med Mangel av giftvirkninger in vivo
Som Triflorcas er godt tolerert både in vitro [19] og in vivo (figur 3A og B), vi neste fulgt genuttrykk nivåer av et menneske RT-PCR rekke fokusert på giftighet og stress trasé. Uttrykket profil av 84 gener relatert til celle stress og toksisitet ble analysert i GTL-16-celler utsatt for Triflorcas, SU11274, eller kjøretøy. SU11274 endret ekspresjon av 39 gener i minst to ganger (ved å øke eller redusere dem;
P
0,05). Disse gener som tilhører den apoptose /nekrose (n = 10), inflammasjon (n = 7), oksidativt /metabolsk stress (n = 7), varmesjokk (n = 6), proliferasjon /karsinogenese (n = 5), og vekst arrest /senescence baner (n = 4, 4A og tabell S1). I kontrast Triflorcas førte til en signifikant endring i uttrykket av bare 14 gener (
P
0,05). Blant disse 13 gener overlappet med de som er endret ved SU11274, og tilhørte apoptose /nekrose (n = 3), oksidativt /metabolsk stress (n = 3), og vekststans /senescens (n = 3, figur 4A og tabell S1) . Ingen signifikant reduksjon av genekspresjon enn 50% sammenlignet med kontrollceller kunne observeres. Gener som viser over en 2-ganger økning i uttrykk nivåer inkludert
TNF plakater (3,83 ganger;
P
= 0,0008),
gdf15 plakater (3,18 ganger;
P
= 0,0007),
egr1 plakater (2,68 ganger;
P
= 0,003), og
serpine1 plakater (2,42 ganger;
P
= 0.005). Forbløffende nok Triflorcas ført til et robust og dominerende oppregulering av cytokromoksydase
CYP1A1
genet (611 ganger;
P
= 0,0001, figur 4A). Uttrykk for
CYP1A1
genet ble også økt med SU11274, men på betydelige lavere nivåer (22 ganger;
P
= 0,02, figur 4A). CYP1A1 er et medlem av familien CYP1 av cytokrom P450 implisert i kreft-celle respons på terapeutiske midler. Western blot-analyse bekreftet oppregulering av CYP1A1 proteiner ved Triflorcas, som ble svekket av sin inhibitor acacetin (figur 4B) [23]. CYP1A1 oppregulering av Triflorcas var uavhengig av dens virkning på Met som finnes også i celler, slik som i de humane brystkreft BT474-celler (figur 4C), som er avhengige av ErbB1 signalering. Sammen utgjør disse studiene understreke en selektiv aktivitetsprofil metabolisme fremkalt ved Triflorcas knyttet til oppregulering av en liten undergruppe av stress og toksisitets gener. Således angir det minimale antall gener som påvirkes av Triflorcas at denne forbindelse frembringer mer selektiv virkning på stress og toksisitets gener i forhold til andre Met anticancermidler så som SU11274.
(A) ekspresjonsprofilen av 84 gener relatert til celle stress og toksisitet ble analysert i GTL-16 celler. Celler ble behandlet med enten Triflorcas (svarte kolonner, 3 uM) eller SU11274 (grå kolonner, 1 uM) i 24 timer, og genekspresjon ble sammenlignet med den i ubehandlede celler. Gener ble gruppert i klynger som tilsvarer oksidativt /metabolsk stress, varme sjokk, spredning /karsinogenese, vekst arrest /senescence, betennelse, og apoptose /nekrose signalering. Bare statistisk signifikante endringer i genuttrykk er indikert (
P
0,05). Triflorcas endret ekspresjon av bare 14 gener i forhold til endring av 39 gener som induseres av SU11274 behandling. Spesielt uttrykk for
CYP1A1
ble økt 611 ganger i nærvær av Triflorcas. (B) Western blot-analyse som viser oppregulering av CYP1A1 proteinnivåene i celler eksponert for Triflorcas (3 eller 10 uM). Acacetin (ACA, 10 mm) behandling forhindret CYP1A1 oppregulering av Triflorcas (TFC). (C) CYP1A1 oppregulering av Triflorcas også skjedde i ErbB1-avhengige kreft BT474 celler. Gefitinib (GEF, 10 mm) og SU11274 (SU, 2 mm) ble benyttet som kontroller
Triflorcas Mekanismer av Drug Handling og dens virkninger på cellecyklusprogresjonen Ledende å Mitotisk Failure
effektene av Triflorcas på PI3K-Akt veien vist ved biokjemiske studier (figur 2B og C) viser at Triflorcas kreft egenskaper kan være forbundet med sin aktivitet på forskjellige signalerings mål i tillegg til Met. En screening-metode i stor grad brukt for å identifisere mål i en gitt kjemisk middel er det KINOME
scan
, noe som gjør det mulig å vurdere aktiviteten av forbindelser mot et panel av kinaser gjennom bindingsanalyser [24]. Triflorcas ble vist mot 98 kinaser i en enkel konsentrasjon på 10 mikrometer, i samråd med standardprotokoller. Men den lave oppløselighet av Triflorcas i bufferbetingelser som brukes for denne type av skjermen begrenser mulighetene for å identifisere målrettede kinaser. Likevel fant vi at Triflorcas reduseres med mer enn 30% av bindingskonstanten for bare fem mer enn 98 kinaser analysert: Abl-en (enten villtype, eller E255K og T315I mutante former), IKK-beta, JAK2, MKNK1, og ZAP70 (figur 5 og tabell S2). Selv om mønsteret for kinaser som samvirker med Triflorcas virker sterkt fokusert, må disse resultatene ta hensyn til at en del av mål ble muligens ikke detektert på grunn av den lave oppløselighet av Triflorcas i bufferbetingelser som brukes for denne skjermen. . For eksempel ble Met ikke identifisert til tross for at Triflorcas hemmende aktivitet ble tidligere etablert bruker Kinexus sammensatt profilering tjeneste [19]
Forbindelsen ble screenet mot et KINOME
scan product: (http: //www.kinomescan.com) panel av 98 kinaser. (A) I tabellen angis kinaser som Triflorcas redusert mer enn 30% bindingen konstant. Den ligandbinding for hver kinase (% av kontroll tilstand) er indikert. (B) TREEspot bilde av de 98 kinaser skjermet med posisjonen Triflorcas mål: Abl villtype, Abl E255K og Abl T315I mutante former, IKK-beta, JAK2, MKNK1, og ZAP70. Den komplette datasettet er vist i Tabell S2. TK: tyrosin kinase; TKL: tyrosinkinase som; STE: STE kinase; CK1: cell kinase1; AGC: PKA, PKC, PKG kinaser; CAMK: kalsium calmodulin-regulert kinase; CMGC. CDK, MAP, GSK, CDK-lignende kinase
Derfor, for ytterligere å undersøke mekanismene for narkotika handling av Triflorcas, søkte vi et cellebasert assay, som tillater evaluering av agentens effekter på flere onkogene signalveier i dyrkningsforhold som er kompatible med Triflorcas løselighet og biologisk aktivitet. Fosforyleringen nivåer av flere signaliseringsmolekyler ble derfor undersøkt ved å bruke Kinexus fosforylert protein skjerm array. Spesielt sammenlignet vi fosforylering nivåene av 44 signale fosfo-epitoper i GTL-16 celler behandlet eller ikke med Triflorcas (figur 6, S3, S3 og tabell). I samsvar med våre biokjemiske studier, fant vi at fosforylering tilstand av flere komponenter innenfor PI3K /Akt veien ble endret i celler eksponert for Triflorcas. Spesielt ble redusert fosforylering nivåene observert for akt1, mTOR /FRAP, p70
S6Kb1, og S6 ribosomalt protein (figur 6A og B; røde sirkler). Forbløffende nok fant vi at Triflorcas vesentlig endrer fosforylering status av to ekstra proteiner: fosforylering av Rb på ulike Tjen /Thr rester ble redusert (Figur 6A og B; blå sirkler); fosforylering av nucleophosmin /B23, en nukleolært protein funnet å være signifikant rikelig i svulster [25], ble økt (Figur 6A og B, grønne sirkler). Western blot-analyse bekreftet endringene i fosforyleringstilstanden av Rb og nucleophosmin /B23-proteiner etter Triflorcas behandling (figur 6C).
(A) Fosforyleringen status av flere cellesyklusproteiner ble analysert ved anvendelse av fosfo-matrisen KPSS 10.1 (Kinexus bioinformatikk). GTL-16 celler ble behandlet med kjøretøy (kontroll) eller Triflorcas (TFC, 3 mm) for (henholdsvis venstre og høyre panel,) 72 timer. Røde sirkler markere bestanddeler av Akt /mTOR /S6 veien. Grønn og blå sirkler omgir nucleophosmin /B23 og Rb fosfo-epitoper, henholdsvis. (B) Grafen viser forholdet mellom fosforylering nivåer av de indikerte proteiner i celler ubehandlede versus de som utsettes for Triflorcas. (C) fosforylering nivåer av nucleophosmin /B23 ved Ser
4 og Rb ved S
780 ble økt og redusert, henholdsvis i GTL-16-celler utsatt for Triflorcas (TFC, 3 uM i 24 timer).
Som både Rb og nucleophosmin /B23 er viktige regulatorer av cellesyklusprogresjon, neste evaluert vi enten ble Parallelt disse endringene i fosforylering tilstand med endring av cellesyklusen. Cellene ble farget med propidiumjodid og deres fordeling i ulike cellesyklusfaser ble vurdert ved flowcytometrisk analyse. Ubehandlede GTL-16 celler ble prolifererende, som bekreftet ved flowcytometri mønster (figur 7A og data ikke vist). Triflorcas behandling endrer GTL-16 cellesyklusfordeling, med en økning av G0 /G1 cellepopulasjon på bekostning av S og G2 /M populasjon (figur 7A og data ikke vist). Som kontroller, behandling av GTL-16-celler med enten SU11274 eller nocodazol førte til en blokkering i G0 /G1 eller G2 /M fase, henholdsvis (data ikke vist). Således påvirker Triflorcas cellesyklusprogresjon av GTL-16 celler. Morfologisk analyse av celler eksponert for Triflorcas viste en signifikant økning i antall multinucleated celler, noe som indikerer svikt mitotisk (figur 7B og C). I motsetning til dette ble det ikke observert noen mitotisk svikt i celler behandlet med SU11274, crizotinib, eller PHA665752 (figur 7C). Sammen utgjør disse funnene viser at anti-tumor-aktivitet fremkalt ved Triflorcas kan delvis står for fosforylering forandringer av forskjellige signalerings mål, slik som komponenter av PI3K /Akt vei, Rb, og nucleophosmin /B23, som korrelerer med endringer i cellesyklus progresjon og mitotisk svikt.
(A) Diagram som viser forholdet mellom prosentandelen av GTL-16 celler i G0 /G1 fasen over prosentandelen av celler i S + G2 /M-fasen. Celler ble behandlet med Triflorcas (TFC, 3 uM), eller bærer (CNTR) i 48 timer, deretter farget med propidiumjodid. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. *** P 0,001; Student-
t
test (n = 3). Prosentandeler av celler i G0 /G1, S og G2 /M-faser er gjengitt i tabellen. (B) GTL-16 celler ble dyrket i nærvær av Triflorcas eller bærer og kjerner ble visualisert ved hjelp av farging DAPI. Piler viser eksempel på celler med flere kjerner (40X forstørrelse). (C) Kvantifisering av celler med mitotiske svikt uttrykt som prosent av det totale antall celler som ble analysert. Triflorcas (TFC, 3 eller 10 uM), men ikke SU11274 (SU, 1 uM), crizotinib (crizo, 1 uM), eller PHA665752 (PHA; 1 pM) førte til en betydelig økning i antall celler med mitotiske svikt. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. *** P 0,001; Student-
t
test.
Triflorcas Svekker Overlevelse og Anchorage uavhengig Vekst av humane kreftceller preget av RTK Bytte
En viktig begrensning av molekylære behandlinger ved hjelp av agenter målretting distinkte RTK er den medikamentresistens mekanisme, som kan være enten konstitutiv eller ervervet etter behandling. I denne sammenheng har det vist seg at Met, kan ErbBs og PDGFRs gjensidig erstatte hverandre for å opprettholde aktiviteten av RTK-drevne onkogene trasé [9], [26] – [29].
