Abstract
Bakgrunn
leverkreft (HCC) er den hyppigst forekommende primær leverkreft og er rangert som den femte hyppigste kreft, samlet, og den tredje største årsaken til kreftdødsfall, over hele verden. I dag effektive terapeutiske alternativer tilgjengelige for HCC er begrenset; følgelig er prognosen for disse pasientene dårlig. Vårt mål i denne studien var å identifisere en roman mål for antistoffer mot HCC.
Metodikk /hovedfunnene
Vi brukte Western blot og flowcytometrisk og immunocytokjemisk analyser for å undersøke regulering av FGFR1 ekspresjon av interferon-α /β i flere humane leverkreftcellelinjer. I tillegg har vi testet effekten av kombinert behandling med anti-FGFR1 monoklonalt antistoff og interferon-α /β i en murin xenograft modell for menneskelig HCC. Vi fant at interferon-α /β induserer ekspresjon av FGFR1 i humane HCC cellelinjer, og at et anti-FGFR1 monoklonalt antistoff (mAb) rettet mot i det induserte FGFR1 effektivt kan hemme vekst og overlevelse av HCC celler
in vitro
og
in vivo
. Videre er kombinasjonen av interferon-α, anti-FGFR1 mAb og perifere mononukleære blodceller (PBMC) som utøves en signifikant antitumoreffekt
in vitro
.
Konklusjoner
Vårt resultat tyder på at den kombinerte anvendelse av et anti-FGFR1-antistoff og interferon-α /β er en lovende tilnærming til behandlingen av HCC
relasjon:. Sasaki S, T Ishida, Toyota M, Ota A, Suzuki H, Takaoka A, et al. (2011) Interferon-α /β og anti-fibroblast vekstfaktor reseptor 1 Monoclonal Antibody Undertrykk leverkreftceller in vitro og in vivo. PLoS ONE 6 (5): e19618. doi: 10,1371 /journal.pone.0019618
Redaktør: Young Nyun Park, Yonsei University School of Medicine, Republikken Korea
mottatt: 09.10.2010; Godkjent: 11 april 2011; Publisert: 09.05.2011
Copyright: © 2011 Sasaki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Grants-i-Aid for Scientific Research på Prioriterte områder fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (17016060 til KI og TI); Grants-i-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for Promotion of Science (21590853 til SS); Grant-i-Aid for utforskende forskning fra Japan Society for Promotion of Science (17659218 til SS og KI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. A. Ota, M. Maeda, T. Seito er ansatte i Immuno-biologisk Laboratories Co., Ltd. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer med andre forskere.
Innledning
leverkreft (HCC) er den mest vanlig forekommende primær leverkreft og er rangert som den femte hyppigste kreft, samlet, og den tredje største årsaken til kreftdødsfall, over hele verden [1]. I dag, kirurgi, perkutane terapier slik som etanol injeksjon og radiofrekvens ablasjon, og Kateter behandlinger som arteriell chemoembolization anvendes ved behandling av HCC. Disse tilnærmingene kan selektivt å fjerne og drepe kreftceller, noe som gjør dem nyttige for kontroll av den lokale tumor; men de er ikke tilstrekkelig til å forbedre prognosen for HCC pasienter, som sykdommen gjentar seg lett på grunn av blod-born metastaser (f.eks intrahepatisk metastasering og vaskulær infiltrasjons) eller utviklingen av nye HCCs (multisentrisk carcinogenesis). Følgelig 1-års og 3-års overlevelse for HCC er bare 36% og 17%, henholdsvis [2]. Svakhetene ved dagens HCC behandlinger inkluderer ufullstendig hemming av multicentric kreftutvikling, vansker med å kontrollere intraportal infiltrasjon, og manglende evne til å hindre forverring av leverfunksjon eller fremme sin restaurering. Således kan også brukes til utvikling av nye behandlinger som forbedrer prognosen for HCC pasienter, og som i eldre og avansert stadium pasienter ville være meget ønskelig.
Målretting celleoverflatemolekyler ved hjelp av mAb blir en ny strategi i cancerterapi, og mAbs mot kreftrelaterte overflatemolekyler slik som EGFR, HER2 og CD20 er blitt anvendt [3], [4], [5]. Imidlertid er celleoverflate-ekspresjon av antigene molekyler ofte svake og heterogent, noe som hindrer effektiv målretting av tumorer [6], og til dags dato, har bare noen få pilot studier som undersøker ekspresjon av HCC-assosierte antigener blitt utført [7].
interferoner (IFN), som er mye brukt til behandling av neoplasier og virussykdommer, forbedre ekspresjon av flere celleoverflatemolekyler begge
in vitro
og i xenograft tumormodeller [8], [9 ]. Induksjon av genuttrykk ved IFN er et komplekst fenomen som involverer aktivering av målgener via fosforylering av stats av JAK kinase [10]. I tillegg kan IFN indusere ekspresjon av interferon-regulerende faktorer (IRFs), og transkripsjonsfaktorer, som så induserer gener involvert i apoptose og immunresponser [11]. IFN er allerede brukt til å behandle de fleste hepatitt pasienter, og deres effekter foreslår rettet mot celleoverflatemolekyler indusert av IFN kan være en nyttig strategi for behandling av HCC. Vårt mål i denne studien var å bruke HCC cellelinjer og en murine xenograft modell for menneskelig HCC å undersøke endringer i genuttrykk indusert av IFN og for å identifisere potensielle mål for antistoff terapi. Våre funn tyder på IFN-α /β-indusert fibroblast vekstfaktor reseptor 1 (FGFR1) kan være en roman terapeutisk mål for behandling av HCC.
Resultater
Induksjon av FGFR1 uttrykk ved IFN α /β i HCC xenografter
For å identifisere gener oppregulert ved IFN i HCC celler, utførte vi en microarray analyse ved hjelp av cDNA fremstilt av svulster dyrket i SCID-mus subkutant administrert HepG2 celler, en human leverkreft cellelinje. Resultatene av microarray analysen er oppsummert i figur 1A. Blant de genene oppregulert ved IFN var
FGFR1
, som koder for en reseptor tyrosin kinase. Real-time PCR-analyse bekreftet induksjon av
FGFR1
transkripsjon av både IFN-α og IFN-β (figur S1), og tilsvarende økninger i FGFR1 protein ble observert i HepG2, Huh-7 og CHC4 celler (figur 1B -D). Vi så brukt immunhistokjemisk farging for å undersøke fordelingen av IFN-α /β-indusert FGFR1 i svulster og funnet at nivåene av FGFR1 ble øket ved cellemembranen og i cytoplasma av HCC celler (figur 1E).
A, Sammendrag av gener indusert av IFN-α ved leverkreft cellelinjer og HepG2-xenografter. Ekspresjon av gener som induseres av IFN-α ble undersøkt ved hjelp av DNA rekke analyse, og ekspresjon av
FGFR1
ble funnet å være sterkt indusert. B, Western blot som oppviser IFN-α /β-indusert ekspresjon av FGFR1 i humane leverkreftceller. Relative proteinnivåer er angitt nedenfor. C, Strømningscytometrisk analyse som viser IFN-α /β-indusert ekspresjon av FGFR1 i humane leverkreftceller: svart, noe antistoff; grønn, ingen IFN; Rosa, IFN-α; Blå, IFN-β. D, Western blot som viser tidsforløp av FGFR1 uttrykk etter behandling med IFN-α /β. De immunoblotter ble gjort ved hjelp av totale lysatene fra HepG2-xenografter. E, IFN-α /β-indusert ekspresjon FGFR1 i skåret vev fra HepG2-xenografter. FGFR1 ble farget ved hjelp av anti-FGFR1 antistoff.
Utvikling av en anti-FGFR1 monoklonalt antistoff
Vi har utviklet ny anti-FGFR1 mAbs ved å immunisere BALB /c mus med en FGFR1 ekspresjonsvektor . Seks antistoffer som gjenkjenner FGFR1 ble isolert fra mus, hvorav to, utpekt A2C9-1 og A2D11-1, viste sterk affinitet i ELISA og ble karakterisert videre. For kinetisk analyse, ble det ekstracellulære domene av FGFR1 kovalent bundet til en CM-5-sensor chip ved lav tetthet (215 respons enheter av FGFR1), hvoretter vi fastslått Kd-verdiene for A2C9-1 og A2D11-1 til å være 209 nM og 7.03 uM, henholdsvis (fig S2A). Dermed A2C9-1 viste den sterkeste affinitet for FGFR1. Flowcytometrisk analyse bekreftet at A2C9-1 reagerer med FGFR1 (figur 2), og Western blot-analyse viste at molekylvekten til ectopically uttrykt FGFR1 å være rundt 115 kDa (figur S2B).
flowcytometrisk analyse viser ekspresjonsnivået av FGFR1 og spesifisitet av A2C9-1 mAb. Venstre: grafene viser resultatene oppnådd med lysater fra NIH3T3-celler i hvilke M19B2 cDNA innførte (kontroll). Høyre: grafene viser resultatene med lysatene fra NIH3T3 celler inn som full-lengde FGFR1 cDNA ble innført
Anti-FGFR1 mAbs hemmer HCC cellevekst in vitro
Vi neste undersøkt. virkningene av A2C9-1 og A2D11-1 mAb’ene på veksten av leverkreftceller (figur 3). IFN-α viste noen antitumoraktivitet mot leverkreftceller, og svak veksthemming ble sett når A2C9-1 eller A2D11-1 ble tilsatt til kulturer i fravær av IFN-α. På den annen side, behandling med en kombinasjon av A2C9-1 og IFN-a betydelig redusert celleoverlevelse sammenlignet med behandling med IFN-α alene (
P
= 0,01) (figur 3). Effekten av A2D11-1 i kombinasjon med IFN-α var ikke større enn effekten av IFN-α alene.
I diagrammet, er overlevelse hos dyrkede HepG2 HCC celler er vist på den vertikale akse, og inkubasjonstiden etter administrering av de angitte stoffene er vist på den horisontale akse. PBS er den negative kontroll. Symboler og barer representerer gjennomsnitt ± SD. Legg merke til at behandling med en kombinasjon av A2C9-1 og IFN-a betydelig redusert celleoverlevelse sammenlignet med behandling med IFN-α alene (
P
= 0,01).
Effekter av A2C9-1 med og uten IFN-α i en mus xenograft tumormodell
neste testet antitumor-virkningene av et anti-FGFR1 mAb i en mus xenograft modell for menneskelig HCC (figur 4A og B). I mus behandlet med bare A2C9-1 eller IFN-α, hadde tumorvolum ikke forskjellig fra kontrollgruppen administreres PBS. Imidlertid behandling med IFN-α + A2C9-1 hadde en hemmende effekt på tumorvekst, selv om undertrykkelse var ikke statistisk signifikant. Til slutt, i mus som ble behandlet med IFN-a + A2C9-1 + PBMC (mononukleære celler fra perifert blod), var det en signifikant antitumoreffekt, sammenlignet med gruppene som ble behandlet med PBS (p = 0,026), INF-α (p = 0.03) , A2C9-1 (p = 0,014), PBMC (p = 0,022) eller IFN-a + PBMC (p = 0,007). Faktisk forsvant tumoren i 2 av de 4 dyr som ble testet. I løpet av forsøkene vi har oppdaget ingen cytotoksisitet mot normale hepatocytter (data ikke vist). Histologisk analyse viste markert infiltrasjon av mononukleære celler fra de gjenværende tumorvev fra mus behandlet med IFN-a + A2C9-1 + PBMC, men ingen slik infiltrering ble observert i tumorvev fra mus i de andre gruppene (figur S3).
A, Representative bilder av kreft grafts på SCID-mus. B, I diagrammet, er størrelsene av tumorer i hver gruppe (n = 4 mus per gruppe) er vist på den vertikale akse, og den medgåtte tid etter behandling med de angitte stoffer og celler som er vist på den horisontale akse. Symboler og barer er midler ± SD. C, tumorvolum etter behandling med de angitte stoffer og celler. PBS er den negative kontroll. Dataene er midler ± SD.
IFN øker opphopning av anti-FGFR1 mAb innen svulster
For ytterligere å bekrefte at den observerte regresjon av xenografter var relatert til behandling med A2C9-1 mAb, Alexa Fluor 680-konjugert A2C9-1 ble injisert i halevenene av tumorbærende SCID-mus, hvoretter målretting av svulsten ved A2C9-1 ble evaluert i de samme dyrene på ulike tidspunkt ved hjelp av en optisk molekylær avbildning system (Figur 5A og B). I mus forbehandlet med IFN-α, A2C9-1 selektivt og tidsavhengig akkumulert i løpet av tumorene i perioden fra 24 timer til 192 timer etter dets administrering. I motsetning til dette ble det bare ubetydelige nivåer av mAb detektert i kontrollmusene administrert A2C9-1 + PBS. Vi bekreftet også at det var ingen akkumulering av en Alexa Fluor 680-konjugert kontroll antistoff (data ikke vist). Det ser altså at IFN-α øker opphopning av anti-FGFR1 mAb
in vivo
, mest sannsynlig med opp regulerende FGFR1.
A, SCID-mus var xenopodet med 1 × 10
6 HepG2-celler, hvoretter 50 ug av Cy5-konjugert A2C9-1 mAb ble intravenøst administrert via halevenen. Mus ble så fotografert under anestesi. B, Tid løpet av Cy5 signalintensitet.
Diskusjoner
I denne studien fant vi at FGFR1 kan tjene som en roman mål for antistoffer i HCC. Mer spesifikt, kombinert behandling med IFN-α /β og en anti-FGFR1 mAb (A2C9-1) viste sterk vekst undertrykkende effekter på menneske HCC celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Fem isoformer av den transmembrane reseptor FGFR (FGFR1-4 og FGFR5 /1 I) er kjent for å bli uttrykt i pattedyr [12]. Hver består av tre ekstracellulære immunoglobulin-lignende domener, et transmembrandomene, og to intracellulære tyrosinkinase-domener. FGF binder seg til FGFR via to av de immunoglobulin-lignende domener (II og III). Under FGFR uttrykk, alternativ spleising av
FGFr
transkripsjoner produserer flere spleise varianter med forskjellige vev-spesifikk ligand særegen [13]. Blant dem har FGFR1 blitt vist å bli uttrykt i HCC, og er kjent for å fremme utviklingen av HCC i respons til stimulering kreftfremkallende [14]. FGFR1 er ikke uttrykt i noncancerous hepatocytter. FGFR1-mediert signalisering er involvert i kreftcellevekst og infiltrasjon, samt i angiogenese [15], som allerede er et mål for antitumorterapi [16]. I tillegg har tidligere undersøkelser vist forhøyet ekspresjon av FGFR ligander, inkludert FGF1 og FGF2, i primær HCC vev og leverkreft cellelinjer [17], [18], [19], [20], sterkt at FGF signalering spiller en nøkkel rolle i utviklingen av HCC. Disse egenskapene gjør FGFR1 et attraktivt molekylære mål for behandling av HCC.
Et stort problem med antistoff mot kreft er de svake og heterogene uttrykk av celleoverflateantigener. For å bøte på dette problemet, undersøkte vi gener oppregulert ved IFN i HCC xenografter. Vi har funnet at ekspresjonen av FGFR1 er indusert av IFN-α /β og at behandling av HCC celler med en kombinasjon av IFN-α /β og et anti-FGFR1 mAb hemmer effektivt vekst og overlevelse av HCC celler. Således, en årsak til den utilstrekkelige terapeutiske effekten av anticancermedikamenter som målretter FGFR1 synes å være det vil si, uten induksjon, er ikke tilstrekkelig for effektiv behandling ekspresjon av FGFR1 på kreftceller. I samsvar med denne ideen, vår immunohistokjemisk analyse viste ekspresjon av FGFR1 å være meget lav i ubehandlede HCC celler. Spesielt, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er også oppregulert etter IFN [21], og dette oppregulering av EGFR er en avgjørende faktor bak den følsomhet av berørte kreftceller til anti-EGFR-antistoffer [22]. Samlet utgjør disse funnene tyder på behandling med en kombinasjon av IFN og et antistoff kan være en effektiv terapeutisk strategi mot ulike typer kreft.
Den molekylære mekanismen som IFN-α /β induserer FGFR1 uttrykk forblir ukjent. Det er imidlertid kjent at antitumor og antivirale virkninger av IFN medføre endringer i den transkripsjonelle regulering av forskjellige gener [23], og at IFN-induserbare gener inneholder et interferon responselement (SBR) i deres promotorområdene [24]. Ved hjelp av en transkripsjonsfaktor søkeprogram, identifiserte vi flere mulige ISREs i 5′-UTR av FGFR1, noe som tyder på at FGFR1 kan være et direkte mål for type I IFN (data ikke vist). Videre studier vil være nødvendig for å fastslå nøyaktig hvor interferon induserer FGFR1.
Vi vet ennå ikke fullt ut forstå den molekylære mekanismen som vår antistoff utøves sin anti-tumor effekt, selv om det er flere muligheter. Mange av de tumor-uttrykte mål for terapeutiske antistoffer er vekstfaktorreseptorer. For eksempel, anti-EGFR-antistoffer, omfattende Cetuximab, er blitt vist å blokkere vekstfaktor signalering ved å hindre den fra å binde ligand til dets reseptor, eller ved å forhindre reseptordimerisering [25]. Det er høyst sannsynlig at A2C9-1 undertrykker tumor cellevekst gjennom en lignende mekanisme ved å målrette IFN-indusert FGFR1. Det ble også rapportert at bindingen av et antistoff til en vekstfaktor reseptor fører til internalisering av antistoff-reseptor-komplekset, og det nedregulering av nedstrøms signalisering [26]; Men vi observerte ingen A2C9-1-indusert internalisering i kreftceller (data ikke vist). For det tredje, antistoffer mot vekstfaktor-reseptorer også utøve vekst undertrykkende virkninger via immunsystemet [27]. Her, for eksempel, viste vi at IFN-α /β forbedrer overflate ekspresjon av FGFR1, kanskje muliggjør en anticancer-effekt basert på antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet til å følge bindingen av anti-FGFR1 mAb til reseptoren. Resultatene av vår
in vivo
forsøk viser viktigheten av PBMC til antitumor virkningene av A2C9-1 er i overensstemmelse med ideen om at dette antistoff sterkt stimulerer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet.
i sammendraget, fant vi at IFN-α /β induserer uttrykk for FGFR1 og at behandling med en kombinasjon av IFN-α /β og en anti-FGFR1 mAb undertrykker HCC cellevekst
in vitro Hotell og
i vivo
. Vi bekreftet også at IFN-α /β fremmer akkumuleringen av den anti-FGFR1 mAb innenfor tumorer. Denne behandlingsprotokoll selektivt hemmer veksten av HCC celler uten å påvirke normale celler, noe som antyder at det kunne brukes i behandling av HCC uten å redusere lever foreløpige resultater. Vi foreslår derfor at våre resultater kan gi grunnlag for en ny tilnærming til behandling av HCC, for der er det ingen effektiv behandling for øyeblikket.
Materialer og metoder
Cellelinjer og eksperimentell dyr
menneske~~POS=TRUNC cellelinjer (HepG2, Huh-7 og CHC4) ble hentet fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser (Tokyo, Japan) og kultivert som anbefalt. Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin ved 37 ° C under en atmosfære av fuktig luft med 5% CO
2. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra friske frivillige ved bruk av Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) og anvendt som effektorceller i SCID-mus. Alle givere gitt skriftlig informert samtykke før samlingen i samsvar med Helsinkideklarasjonen, og alle protokoller med humane prøver ble godkjent av Institutional Review Board of Sapporo Medical University. Hele PBMC (1 x 10
7) suspendert i 0,2 ml RPMI 1640 ble injisert intraperitonealt i hver SCID-mus. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med aksepterte standarder for dyr omsorg og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Sapporo Medical University.
Microarray analyse
For microarray analyse, HepG2 celler (en × 10
6 celler) ble først xenopodet til alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Tre uker senere, når den resulterende tumoren hadde nådd 6-7 mm i diameter, IFN-α (OIF®; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokushima, Japan) ble injisert subkutant i en dose på 2000 U /mus. Prøver av tumorvev ble oppsamlet før og 24 timer etter injeksjon av IFN-α. RNA ble ekstrahert fra de innsamlede vev ved hjelp Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transkribert til cDNA ved hjelp Hevet III (Invitrogen). CDNA ble deretter omsatt ved bruk av Gene Navigator cDNA Array Filter-human kreft (Toyobo, Osaka, Japan) og underkastet DNA rekke analyse ved anvendelse av en Fluor-S Multi Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
real-time RT-PCR-analyse
HepG2 (1 × 10
6 celler) celler var subkutant xenopodet i ryggen av SCID-mus. Når den inokulerte tumoren nådde 10 mm i diameter, IFN-α (OIF®) eller IFN-β (Feron®; fremstilt av Toray Industries, Inc., Tokyo, Japan) ble administrert intravenøst ved en dose på 2000 U /mus, og prøver av tumorvev ble oppsamlet 0, 1, 3, 8, 24 og 48 timer etter administrering. Totalt RNA ble renset fra prøvene ved anvendelse av en RNeasy-sett (Qiagen, Hilden, Tyskland), og enkelt-tråd cDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA ved anvendelse av en første-Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) . Real-time kvantitativ analyse ble utført med SYBR Grønn I (Roche, Basel, Sveits) med en LightCycler Real-time PCR system (Roche). Nivåene av FGFR1 og OAS1 (kontroll) mRNA uttrykk ble normalisert til uttrykk av GAPDH mRNA. Primersett for FGFR1 (følelse, 5′-GGA CGA TGT GCA GAG CAT CAA CTG-3 «; anti-sense, 5′-AAC TTC ACT GTC TTG GCA GCC GG-3′), OAS1 (følelse, 5»-CAT CCG CCT AGT CAA GCA CTG-3 «, anti-sense, 5′-CCA CCA CCC AAG TTT CCT GTA-3′) og GAPDH (forstand, 5»-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3 «, anti-sense , 5»-GAA GAT GGT GAT GGG ATT-TC-3 «) ble syntetisert ved Greiner Bio-One (Tokyo, Japan).
Western blot analyse
HepG2, Huh-7 eller CHC4 cellene ble inkubert i 48 timer i nærvær av IFN-α eller IFN-β (1000 IU /ml), hvoretter cellene ble lysert i prøvebuffer (50 mM Tris-HC1, pH 6,8, 6% 2-merkaptoetanol, 2% SDS, 0,004% bromfenolblått og 10% glycerol). Proteiner i prøver av lysatet ble separert ved 7,5% polyakrylamid-gel-elektroforese og deretter overført på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad Laboratories). Etter blokkering av membranen med 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 time ved romtemperatur, ble det inkubert med anti-humant FGFR1 antistoff (sc-121, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) i 1 time ved romtemperatur. Blottet ble deretter utviklet med 0,005% H
20
2-3, 3′-diaminobenzidin ved hjelp av en immunoperoxidase ABC kit (Vectastain ABC kit, Vector Labs, Burlingame, CA, USA).
flowcytometrisk analyse
Førti-åtte timer etter administrasjon av IFN-α, uttrykk for FGFR1 ble vurdert ved hjelp av flowcytometri. Celler i suspensjon (4 x 10
5 celler /rør) ble vasket med 2 ml vaskebuffer (0,2% bovint serumalbumin, 0,1% NaN
3/10 mmol /l fosfat-bufret saltløsning, pH 7,4) og sentrifugert ved 300
g
i 5 min ved 4 ° C, hvoretter supernatanten ble fjernet. De resterende cellepellet ble fiksert i 0,25% paraformaldehyd i minst 15 minutter i mørke ved romtemperatur, vasket to ganger med 2 ml vaskebuffer, inkubert i 1 time i 70% metanol ved 4 ° C, og deretter vasket på nytt. For å undersøke ekspresjon av FGFR1, ble de fikserte cellene inkuberes først med anti-FGFR1 antistoff (1:100 fortynning) i 1 time ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket to ganger og inkubert i 30 minutter i 4 ml av fluorescein isotiocyanat-konjugert geit-anti-mus IgG på is i mørket. Etter igjen vasking av cellene to ganger, ble de suspendert i 1 ml vaskebuffer for analyse ved anvendelse av et FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).
Analyse av FGFR1-ekspresjon i humane hepatiske cancer xenografter
HepG2 celler (1 x 10
6 celler) ble xenopodet i SCID-mus. Når den resulterende tumoren nådde 10 mm i diameter, ble IFN-α (OIF®) eller IFN-β (Feron®) administrert intraperitonealt eller intravenøst i en dose på 100 U /g, og 24 timer senere tumorvev ble oppsamlet. Western blot og immunohistokjemiske analyser ble deretter utført ved anvendelse av et anti-humant antistoff FGFR1. (Sc-121, Santa Cruz Biotechnology)
Fremstilling av Anti-FGFR1 antistoff
Et polynukleotid som koder for det området som strekker seg fra aminosyre 1-822 av FGFR1 og representert ved SEKV ID NR. 1, ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av full-lengde FGFR1 (aksesjonsnr NM_000604) som et templat med primere No. 5′-3 [(SEKV ID NR. 3): 5′-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3 «] og nr 3′ 3 [(SEKV ID NR. 4): 5»-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3 «]. Det amplifiserte Polynukleotidet ble innsatt i pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for å konstruere en ekspresjonsvektor som ble administrert som det immuniserende antigen i en dose på 50 ug /mus i et 50 ul volum ved 1- eller 2- ukers mellomrom. Antigenet for den første immunisering ble blandet med Freunds fullstendige adjuvans, mens antigener for den andre og påfølgende administrasjoner ble blandet med Freunds ufullstendige adjuvans. Milt monocyttiske celler fra de immuniserte mus og en fusjonspartner, X63-Ag8-653, ble smeltet ved bruk av polyetylenglykol-formidlet cellefusjon, som ble etterfulgt av seleksjon av et hybridom ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Kinebuchi et al. [28]. Celler som hadde reagert med det immobiliserte FGFR1 ble dyrket i serumfritt GIT-medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) for å frembringe mAbs til 80% av cellene var døde. Cellene ble deretter fjernet fra dette medium ved sentrifugering (1000 rpm, 15 min), og ammoniumsulfat ble tilsatt til 50% metning og fikk stå over natten ved 4 ° C. De resulterende bunnfall ble gjenvunnet ved sentrifugering (1000 rpm, 30 min) og oppløst i to-ganger fortynnet bindingsbuffer (Protein AMAPS II kit), hvoretter IgG ble adsorbert på en protein A-kolonne (GE Healthcare Life Science). Etter eluering av de mAbs fra kolonnen, ble eluatet ble dialysert mot PBS over natten for å rense antistoffene, noe som ga en rekke mAb’er gjenkjenner FGFR1. En av disse mAbs ble utpekt A2C9-1 og ble bekreftet å gjenkjenne FGFR1 ved Western blotting og FACS bruker prøver av FGFR1 uttrykt i NIH3T3 celler.
Affinity måling
affinitet anti-FGFR1 mAbs for FGFR1 ble bestemt basert på overflate-plasmonresonans (SPR) ved anvendelse av en Biacore 3000 anordning (Biacore AB, Uppsala, Sverige). Det ekstracellulære domene av FGFR1 ble kovalent koblet til en CM-5-sensor chip ved lav tetthet (215 respons enheter av FGFR1). Bindingskinetikken ble deretter vurdert ved anvendelse av dobbelte seriefortynninger av antistoffet ved konsentrasjoner i området 500 til 0,08 nM i rennende buffer (PBS, pH 7,4, 0,005% (v /v), polysorbat 20 – filtrert og avgasset) ved 25 ° C og en strømnings hastighet på 25 ml /min. Regenereringsprosessen besto av tre injeksjoner av 10 ml 2,5 M guanidinium-hydroklorid, hvoretter sensorbrikken ble spylt i 5 minutter med rennende buffer. Statistikk og dataprosessering ble utført ved hjelp av BIA evalueringsprogramvaren 4.0.1 og GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Alle SPR forsøk ble utført ved Biaffin GmbH Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) i en dose på 20000 U /mus eller PBS (kontroll) ble administrert intraperitonealt. Etter 24 timer ble 50 ug av Alexa Fluor 680-konjugert anti-FGFR1 mAb ble intravenøst administrert via halevenen. Musene ble deretter fotografert under anestesi ved hjelp av en IVIS LUMINA bildesystem (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Induksjon av
FGFR1
transkripsjoner av IFN-α og IFN-β. HepG2-celler (1 x 10
6 celler) ble subkutant xenopodet inn i ryggen av SCID-mus. Når den inokulerte tumoren hadde nådd 10 mm i diameter, ble IFN-α eller IFN-β administrert intraperitonealt eller intravenøst i en dose på 2000 U /mus. Tumorvev ble deretter samlet 0, 1, 3, 8, 24 og 48 timer etter administrering. A, Time-løpet av FGFR1 og OAS1 (kontroll) mRNA uttrykk etter administrering av IFN-α. FGFR1 mRNA (blå linje) økt 3 h (151%), 8 t (202%) og 24 timer (119%) etter administrasjon. OAS1 mRNA (rød linje) ble økt 3 h (162%), 8 t (133%) og 24 timer (150%) etter administrasjon. Er vist er gjennomsnittene av to replikater av den sanntids RT-PCR. B, Time-løpet av FGFR1 og OAS1 mRNA uttrykk etter administrering av IFN-β. FGFR1 mRNA (blå linje) økt 8 h (348%) og 24 timer (337%) etter administrasjon, mens OAS1 mRNA (rød linje) ble økt 3 h (262%) og 8 t (511%) etter administrasjon. Nivåene av mRNA-ekspresjon ble normalisert til den av GAPDH mRNA.
