Abstract
Nyere studier har knyttet uttrykk for lektin-lignende ox-LDL-reseptor 1 (
OLR1
) for å tumorigenesis. Vi analyserte microarray data fra
Olr1
knockout (KO) og villtype (WT) mus for gener involvert i cellulær transformasjon og evaluert effekten av
OLR1
over-uttrykk i normale mammary epitelceller (MCF10A ) og brystkreftceller (HCC1143) i form av genekspresjon, migrasjon, heft og transendothelial migrasjon. Twenty-seks av 238 gener ble hemmet i vev av OLR1 KO mus; det store flertallet av OLR1 sensitive gener som finnes NF-kB bindingsseter i sine arrangører. Videre studier viste bred hemming av NF-kB målgener utenfor transformasjon assosierte gener, med berikelse temaer forsvars respons, immunrespons, apoptose, spredning og sårheling. Transkriptomet av
Olr1
KO mus avslørte også hemming av
de novo
lipogenese, hastighetsbegrensende enzymer fettsyre syntase (
FASN
), stearoyl-CoA desaturase (
Scd1
) og ELOVL familiemedlem 6 (
Elovl6
), samt lipolytic fosfolipase A2 gruppe IVB (
Pla2g4b
). I studier som sammenligner MCF10A og HCC1143, vises den siste 60% høyere
OLR1
uttrykk. Tvunget over-uttrykk for
OLR1
resulterte i oppregulering av NF-kB (p65) og dens mål pro-onkogener involvert i hemming av apoptose (
BCL2
,
BCL2A1
,
TNFAIP3
) og regulering av cellesyklus (
CCND2
) i begge cellelinjer. Basal uttrykk for
FASN
,
SCD1 Hotell og
PLA2G4B
, samt lipogenese transkripsjonsfaktorer
PPARA
,
SREBF2 Hotell og
CREM
, var høyere i HCC1143 celler. Over uttrykk for
OLR1
i HCC1143 celler også forbedret cellemigrasjon, uten at det påvirker deres tilslutning til TNFa-aktivert endotel eller transendothelial migrasjon. På den annen side,
OLR1
nøytraliserende antistoff hemmet både heft og sjelevandring av ubehandlede HCC1143 celler. Vi konkluderer med at
OLR1
kan fungere som et onkogen ved aktivering av NF-kB målgener ansvarlig for spredning, migrasjon og hemming av apoptose og
de novo
lipogenese gener.
Citation: Khaidakov M, Mitra S, Kang BY, Wang X, Kadlubar S, Novelli G, et al. (2011) Oksidert LDL reseptor 1 (
OLR1
) som en mulig sammenheng mellom fedme, Dyslipidemi og kreft. PLoS ONE 6 (5): e20277. doi: 10,1371 /journal.pone.0020277
Redaktør: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia
mottatt: 20 desember 2010; Godkjent: 28 april 2011; Publisert: May 26, 2011
Copyright: © 2011 Khaidakov et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
OLR1
, et lektin -lignende scavenger-reseptor, er sterkt konservert hos pattedyr [1], og det er i stand til å gjenkjenne flere ligander, inkludert proteindelen av oksidert LDL (ox-LDL), avanserte glykerte endeprodukter, gram-positive og gram-negative bakterier og apoptotiske celler [2].
OLR1
er primært uttrykkes på vaskulære celler og blodkar-rik organer [3], og dens aktivering ved et bredt spekter av stimuli som indikerer dyslipidemi, inflammasjon og skade initierer flere signaleringskaskader inkludert MAPK, andre proteinkinaser, så vel som transkripsjonsfaktorer NF-kB og AP-1 [4], [5].
Overekspresjon av
OLR1
er vist i cellulære komponenter av aterosklerotiske lesjoner [6]. Sletting av
Olr1
i
Ldlr
knockout (KO) mus resulterer i mye mindre aterosklerotiske lesjoner assosiert med en drastisk reduksjon av betennelse i aorta [7].
Olr1
opphevelse demper også angiotensin II-indusert hypertensjon [8]. Tilsvarende oppheving av
Olr1
reduserer omfanget av iskemi /reperfusjonsskade [9].
en tilknytning mellom fedme og aterosklerotiske sykdomstilstander hos mennesker er vel etablert [10], [11]. Foreninger med fedme har blitt funnet for ulike kreftformer, inkludert bryst og prostata svulster [12], [13], noe som tyder en mekanistisk overlapping i patobiologi av atherogenesis og tumorigenesis. Nylig,
Olr1
, konstituert gjennom NF-kB mediert inflammatorisk signalering, var sterkt innblandet i kreftutvikling [14].
Fokus for denne studien var å ytterligere belyse rollen som
OLR1
som et onkogen basert på premisset om at som en sensor av dyslipidemi og et molekyl som er involvert i NF-kB aktivering,
OLR1
kan være en kobling mellom dyslipidemi og kreft. Den første delen av studien var basert på microarray analyse av villtype (WT) og
olr1
KO mus. Den andre delen definerer forholdet mellom
olr1 Kjøpe og apoptose og lipogenese gener i brystkreft cellelinje HCC1143 og migrasjon og vedheft av disse cellene.
Resultater
Sammenligning av
OLR1
KO og transformasjon transcriptomes
de viktigste funnene fra analysen av microarray data fra hjertene til villtype (WT) og
Olr1
KO fra vår gruppe er rapportert andre steder [15]. En ytterligere analyse mot overlappende sett av gener (n = 238) funnet å være oppregulert i løpet av transformasjon av to isogene celletyper [14] viste at 26 gener fra denne listen ble hemmet i
Olr1
KO transkriptom av ved minst 20% (tabell 1). Blant disse var ulike komponenter av immunrespons (
Isg20
,
C1S
,
S1r
,
Ifrd1
) og en rekke transkripsjonsfaktorer blant vel- kjente onkogener (
JunB
,
Rel
,
Irf2
,
Crem
). Arrangøren analyse av resulterende sett av gener [16] identifisert deres berikelse for NF-kB bindingsseter (p 0,03) som ble plassert innenfor 500 nukleotider proksimale til transcriptional starte nettsteder i alle unntatt ett (
C1S
)
Olr1
sensitive gener (n = 25, fig. 1).
et diagram som viser et sett med overlappende gener mellom transformasjon og
Olr1
KO transcriptomes. Fra settet av 238 gener oppregulert under transformasjon, ble 26 gener funnet å være hemmet i
Olr1
KO mus. Aller fleste av disse genene gjennomføres NF-kB områder i sin proksimale promotersekvenser. I alt ble 86 NF-kB målgener funnet å være hemmet i
Olr1
KO mus med berikelse for regulering av apoptose (p = 0,0002), spredning (p = 0,00003), sårheling (p = 0,0002) , forsvar respons (p = 0,0011), immunrespons (p = 0,0003) og cellemigrasjon (p = 0,0009).
OLR1
sletting resulterer i en bred hemming av NF-kB målgener
Videre søk etter NF-kB regulerte gener ved hjelp av en liste utarbeidet av tilgjengelige web baserte databaser og litteratur viste at hemming av p65 subenheten observert i
Olr1
KO transkriptomet ble supplert med oppregulering av hemmende
Ikbα
subenhet (1,36 fold, p = 0,002, tabell 1) og ledsaget av en betydelig nedregulering av flere (n = 61) NF-kB målgener (tabell 2). Den kombinerte sett
Olr1
sensitive NF-kB målgener vises berikelse for regulering av apoptose (p = 0,0002), spredning (p = 0,00003), sårheling (p = 0,0002), forsvar respons (p = 0,0011 ), immunrespons (p = 0,0003), og cellevandring (p = 0,0009) (figur 1). Blant de som er involvert i apoptose gener (n = 11) og celledeling (n = 12), 6 og 5, henholdsvis, var negative regulatorer (David Bioinformatikk Database, 17).
OLR1
sletting undertrykker lipogenese gener
De microarray funnene ble validert for utvalgte gener ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. For de fleste av de undersøkte gener, de transkripsjons forskyvninger i
Olr1
KO observert i mikromatriser ble bekreftet (figur 2A). I tillegg
Olr1
sletting resulterte i hemming av viktige enzymer for lipogenese (figur 2B), inkludert ATP citrate lyase (
Acly
), acetyl-koenzym A karboksylase alfa (
Acaca
), fettsyre syntase (
FASN
), stearoyl-CoA desaturase 1 (
Scd1
) og ELOVL familiemedlem 6 (
Elovl6
). Det er av interesse at ingen av
Olr1
-sensitive lipidmetabolismen relaterte gener gjennomført NF-kB bindingsseter i sine arrangører. Dette tyder på at effekten av
Olr1
på lipogenese kan være uavhengig fra sin NF-kB signale arm. På den annen side, flere lipid metabolisme transkripsjonsfaktorer, inkludert sterol regulatorisk element bindende faktor 2 (
Srebf2
), cAMP responsive element modulator (
Crem
), peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptorer alfa og gamma (
Ppara Hotell og
Pparg
), samt CCAAT /enhancer bindende protein (C /EBP) beta, ble funnet å være nedregulert i
Olr1
KO mus (figur 2B ).
A. qPCR validering av utvalgte gener fra overlappende sett (tabell 1); B. Uttrykk av lipogenese gener og transkripsjonsfaktorer i
olr1
KO mus. Hvite striper – microarray data; svarte striper – qPCR data. Alle P-verdier. 0,05
Effekter av
OLR1
overekspresjon i normale epiteliale celler og kreftceller
Transfeksjon av MCF10A og HCC1143 celler med
OLR1
ekspresjonsvektor resulterte i 5-8-dobling av
OLR1
uttrykk, som faller innenfor området OLR1 oppregulering. I epitel-celler eksponert til ox-LDL [18]. Dette førte til beskjeden oppregulering av
RELA plakater (p65) og betydelige økninger i RNA melding til
BCL2, BCL2A1, TNFAIP3 og CCND2 plakater (Figur 3B). Sammenlignet med MCF10A celler, vises HCC1143 celler økte basale nivåer av
OLR1 plakater (59%, p 0,05),
FASN plakater (24%, p 0,03),
SCD1
(21%, p 0,01) og
PLA2G4B plakater (153%, p 0,01) (Figur 3C). Responsen fra lipogenese gener til
OLR1
transfeksjon variert i disse cellelinjer (figur 3D). I MCF10A celler, over-uttrykk for
OLR1
betydelig stimulert transkripsjon av
SCD1 plakater (37%, p 0,02),
ELOVL6 plakater (38%, p 0,05) og
PLA2G4B plakater (153%, p 0,02) samtidig med oppregulering av
CREM
, mens i HCC1143 celler
CREM
transkripsjon avvist og
SCD1 Hotell og
PLA2G4B
ble hemmet sammenlignet med kontrollkulturer transfektert med tom vektor.
Disse cellene ble transfektert med enten tom vektor eller
OLR1
cDNA (Origene, Rockville, MD) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfeksjonseffektiviteten (70-80%) ble evaluert ved hjelp av GFP-vektoren. RNA ble ekstrahert 48 timer etter transfeksjon, omdannet til cDNA, og ekspresjon av gener ble bestemt ved kvantitativ PCR. A. Effektivitet av transfeksjon (celler transfektert med GFP vektor). B. Kvantitativ PCR plot. Legg merke til forbedring av OLR1 uttrykk i både kontroll og OLR1-transfekterte kulturer i respons til okse-LDL. C. Uttrykk av gener involvert i apoptose og spredning. For å stimulere
OLR1
forbundet signale krever OLR1-ligand interaksjon,
OLR1
transfekterte celler ble behandlet med 40 mikrogram /ml ox-LDL i 24 timer; grafene representerer sammenligning med ubehandlede kontrollceller transfektert med tom vektor; D. Basal uttrykk for
OLR1
,
PLA2G4B Hotell og lipogenese gener i normale menneskelige mammary epitelceller (MCF10A) og brystkreftceller (HCC1143); E. Uttrykk for
OLR1
,
PLA2G4B Hotell og lipogenese gener i MCF10a og HCC1143 celler transfektert med OLR1 behandlet i henhold til protokollen beskrevet ovenfor. F. Ekspresjon av lipogenese transkripsjonsfaktorer i MCF10a og HCC1143-celler transfektert med OLR1 og behandlet i henhold til den protokoll som er beskrevet ovenfor. Alle forsøk ble utført in triplo. (*) P 0,05 sammenlignet med respektive styre; (†) – p. 0,05 sammenlignet med MCF10A
Over-uttrykk for
OLR1
forenkler sårheling, men har ingen effekt på adhesjon
Det har vært rapportert at hemming av
OLR1
hjelp sirnas resulterte i reduksjon av tumorvekst
in vivo Hotell og kreft celle migrasjon
in vitro product: [14]. For å evaluere effekten av
OLR1
oppregulering, transfekterte vi HCC1143 celler med enten tom plasmid eller
OLR1
ekspresjonsvektor og testet migrasjon i en sårtilheling analyse (figur 4A). Over-uttrykk for
OLR1
ble bekreftet ved hjelp av qPCR. Celler med oppregulert
OLR1
bro sårene mye raskere enn kontrollkulturer (p 0,001). I motsetning til dette, adhesjon og migrasjon av transendothelial
OLR1
transfekterte kreftceller var ikke forskjellig fra kontrollverdiene (ikke vist).
A. Sårheling analysen. Øvre panel – representative bilder av sårheling analyse utført ved hjelp HCC1143 celler transfektert med enten tom plasmid eller
OLR1
cDNA vektor; Nedre panel – kurve som viser avstanden mellom kantene av såret etter 36 timers inkubering. (*) – P 0,01; B. Adhesjon analysen. Øvre pult representative bilder av heft ikke-transfektert HCC1143 celler lastet med CellTracker Red CMTX (Invitrogen, Carlbad, CA) og brukes på ikke-aktiverte eller aktiverte (50 mikrogram /ml oxLDL, 4 timer) sammenflytende HUVECs tilført med OLR1 Silencer eller egge siRNA. Nedre panel – Grafen viser antall heftende celler gjennomsnitt fra flere synsfelt i tre eksemplarer kulturer. (*) – P 0,05 sammenlignet med ikke-aktiverte kontroll ( «scrRNA»); (†) – p 0,05 sammenlignet med egge RNA; C. Colorimetric transendothelial migrasjon analysen. Øvre panel – verifisering av samløpet av HUVECs på membranene ved farging celler med CellTracker Red CMTX. Nedre panel – absorbans verdier av flekken hentet fra cellene migrerte gjennom TNFa-aktivert endothelial enkeltlag i nærvær av
OLR1
nøytraliserende antistoff eller humant IgG (Control)
Men basal vedheft. og transendothelial migrasjon av ikke-transfekterte HCC1143 celler ble betydelig svekket da OLR1 ble hemmet eller nøytralisert i endotelceller ved hjelp av siRNA eller pre-behandle celler med
OLR1
nøytraliserende antistoff (Figur 4bc).
Diskusjoner
Denne studien tyder på flere mulige koblinger mellom
OLR1 Hotell og faren for kreft. Først microarray databasen i mus med
Olr1
oppheving oppviste en markert reduksjon i ekspresjon av NF-kB målgener som er involvert i cellulær transformasjon [14], så vel som gener relatert til lipogenese. For det andre over-uttrykk for
OLR1
i en human kreftcellelinje viste signifikant oppregulering av flere gener med onkogene egenskaper og en betydelig økning i celle migrasjon.
Vår microarray analyse viste at de aller fleste av gener som er rapportert å være oppregulert i løpet av celletransformasjon (men hemmet i
Olr1
KO mus) gjennomført NF-kB bindingsseter i sine arrangører (tab 1). Videre, en betydelig del av NF-kB målgener utenfor transformasjon relaterte basseng, spesielt de som er involvert i reguleringen av apoptose, spredning og migrasjon, ble også nedregulert i
Olr1
KO transkriptomet (tabell 2 ). I mus
Olr1
KO microarray, både B-celle leukemi /lymfom to relatert protein A1 (
Bcl2a1
) og
BCL2
var transcriptionally hemmet.
Bcl2a1
er et oppstrøms negativ regulator av mitochondriocentric modusen for apoptose
via
forebygging av cytokrom c slipper inn i cytoplasma, som er nødvendig for initiering av apoptotiske kaskade. Det har blitt rapportert at økt syntese av
BCL2A1 Hotell og
BCL-XL
er den underliggende årsaken til ca 1000 ganger større motstand på undergrupper av kronisk lymfatisk leukemi celler [19]. TNFa-indusert protein 3 (
TNFAIP3
) er en viktig regulator av betennelse og immunitet involvert i utviklingen av ulike autoimmune sykdommer, og det desensitizes også celler fra TNFa-indusert cytotoksisitet og ble vist å være anti-apoptotiske i bryst kreft MCF7S1 celler [20]. Inhibering av
TNFAIP3
kompromisser vekst og overlevelse av glioblastom stamceller
via
inhibering av cellesyklusprogresjon og NF-kB aktivitet, og øker overlevelse av mus med glioblastome xenografter [21].
Vi har observert en betydelig reduksjon av
Ccnd2
melding i
Olr1
KO mus og dens multi-fold oppregulering i
OLR1
transgene HCC1143 celler. Cyclin D2 er et høyt konservert regulator av cyklin-avhengige kinaser 4 og 6 ansvarlig for av G1 /S overgang. Dette genet er epigenetiske forstummet i de fleste tilfeller av brystkreft [22]. Dens overekspresjon i LNCaP cellene resulterer i en hindring for spredning og økt apoptose [23]. I tillegg
Olr1
sletting syntes å kompromittere hele teknologiske kjeden av
de novo
lipogenese, inkludert syntese av mettede C16 og C18 fettsyrer (
FASN Hotell og
Elovl6
), og deres konvertering til MUFAs (
Scd1
). Mange kreftformer, inkludert de som involverer prostata og bryst [24], [25], stole nesten utelukkende på
de novo
syntese uavhengig av ernæringsmessige tilgjengelighet. Overgangen til
de novo
lipogenese oppstår tidlig og er en forutsetning for effektiv transformasjon. Nye effekter av
OLR1
på lipidmetabolisme kunne stå for mye av sin rapporterte pro-onkogen aktivitet. For eksempel, etter uttrykket nivået av
FASN positivt korrelerer med dårlig kreft prognose [26], er dens genom forsterkning en vanlig forekomst i enkelte kreft [27], og det er over-uttrykk fremmer transformasjon av epitelceller [28 ]. På samme måte over-ekspresjon av
SCD1
har blitt observert i flere typer kreft, inkludert mammary kreft [29]; dens oppregulering er forbundet med transformasjon og dens knock-down resulterer i redusert celleproliferasjon, et tap av forankrings-uavhengig vekst og svekket apoptose [30]. Det er verdt å merke at i forhold til MCF10A celler, over-uttrykk for
OLR1
i HCC1143 cellene ikke fremkalle den forventede aktivering av lipogenese gener. Dette kan forklares med maksimalt økt basal uttrykk av disse genene i HCC1143 celler ved baseline (figur 3D).
Som de fleste av genene oppregulert i
OLR1
-TG HCC1143 cellene er funksjonelt pleiotropisk, vi vurdert den kumulative effekten av deres oppregulering på sårtilheling, heft og transendothelial migrasjonsanalyser (figur 4). Spesielt ble migrasjon av celler sett til nesten det dobbelte av kontrollverdien i celler med over-uttrykk for
OLR1
sterkt antyder en rolle for dette molekylet i brystkreft vekst. På den annen side, presentasjon av
OLR1
på overflaten av kreftceller ikke synes å være avgjørende for adhesjon til aktiverte endotelceller eller for transendothelial migrasjon. Nivået av
OLR1
i endotelceller, synes imidlertid å være viktig, da tilsetning av nøytraliser
OLR1
antistoff til mediet eller inhibering av transkripsjon OLR1 signifikant nedsatt adhesjon og migrasjon transendothelial i ikke- transfekterte kreftceller. Dette er en indikasjon på
OLR1
som en mulig mekanisme for kreftcelle endotelet interaksjoner, som kreftceller er preget av overflod av
OLR1
ligand phophatidylserine på de cellulære membraner [31].
i sammendraget, våre data fra flere tilnærminger i transgene mus og humane normale epiteliale og kreft cellelinjer tyder på at
OLR1
har flere pro-onkogene handlinger basert på: a) aktivering av NF-kB signalveien resulterer hemming av apoptose og stimulering av spredning; b) aktivering av de novo-lipogenese, og c) mer effektiv adhesjon og migrasjon på grunn transendothelial til oppregulering av
OLR1
i endotel. Vi mener at disse dataene sterkt at
OLR1
kan fungere som et bindeledd mellom fedme og mottakelighet for brystkreft.
Materialer og metoder
Dyr
C57BL /6-mus ble oppnådd fra Jackson Laboratories. Homozygot
Olr1
KO mus ble utviklet på C57BL /6 bakgrunn som beskrevet tidligere [17].
Olr1
KO mus viste totalt fravær av
Olr1
som bestemmes av RT PCR og farging, og bindingen av oxLDL til det vaskulære intima var helt fraværende i disse dyrene. Alle dyr fikk human behandling i samsvar med Public Health Service politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr publisert av National Institutes of Health. De foreliggende studiene ble godkjent av UAMS Animal Care og bruk Committee godkjenningsnummer 2484, datert november 2007.
Microarray analyse
Total RNA hjerte ble hentet fra WT mus og
Olr1
KO mus. Microarray analyse ble utført av Affymetrix Mouse Genome GenChip 430 2,0 genuttrykk array (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA) og analysert ved hjelp av Affymetrix microarray analyse Suite (MAS) 5.0 for å vurdere kvaliteten på RNA og hybridisering. A log base 2 transformasjon ble brukt til data før de rekker var normalisert. Alle verdier fra hver gruppe ble normalisert til 75. persentil verdien i matrisen, som ble vilkårlig satt til minimum intensitet 100. For genekspresjon merknader, ENKEL (som beskrevet i https://apps1.niaid.nih.gov/David) ble utført analyse av betydelige gener identifisert av én prøve
t
-test. I tillegg ble Gene ontologi (GO) termer https://www.geneontology.org) for biologiske prosesser og cellekomponent identifisert som foreslått av GO Consortium. All microarray data er MIAME kompatibel og at rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database (ArrayExpress) som beskrevet på MGED Society hjemmeside https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html (tiltredelse nummer E -MTAB-473).
reagenser og cellelinjer
Alle reagenser, med mindre annet er angitt, ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Menneskelig brystkreft cellelinje HCC1143 var en slags gave av Dr. A. Basnakian (University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock AR). Pattedyr-ekspresjonsvektor (pCMV5-XL5) med humant
OLR1
cDNA ble oppnådd fra Origene (Rockville, MD). Silencer Velg Validert siRNA til OLR1 (s9843) ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Celler ble dyrket ved å bruke standard RPMI 1640 vekstmedium supplert med føtalt bovint serum (10%) og ampicillin /streptomycin. Høy TBAR ox-LDL (90 nmol MDA /mg protein) ble kjøpt fra Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, MA). Humant IgG ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA).
Real-Time Kvantitativ PCR
Celler ble transfektert med enten tom vektor eller
OLR1
ekspresjonsvektor. Effektiviteten av transfeksjon ble bekreftet i parallelle forsøk med GFP frakte plasmid. En del av de transfekterte kulturer (alle in triplo) ble behandlet med oxLDL (40 ug /ml) i 24 timer før høsting og RNA-ekstraksjon. RT qPCR ble utført ved anvendelse av Applied Biosystems 7900 real-time PCR system. qPCR spesifikke primere ble utformet ved hjelp Probe-Finder (https://www.roche-appliedscience.com) web-basert programvare. Alle qPCR reaksjonene ble utført i et sluttvolum på 15 ul inneholdende 1 x av SYBR grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 300 nM av hver genspesifikke primere, 100 ng cDNA, i sterilt avionisert vann. Den standard sykkel tilstand var 50 ° C i 2 minutter, 90 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 62 ° C i 1 min. Resultatene ble analysert ved hjelp av SDS 2.3 relativ kvantifisering manager programvare. Sammenligningsterskel sykluser verdiene var normalisert for GAPDH referanse gener. qPCR ble utført i tre eksemplarer for å sikre kvantitative nøyaktighet.
Transfeksjon protokollen
Celler ble transfektert med enten tom vektor eller
OLR1
cDNA konstruerer (Origene, Rockville, MD) ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner. I preliminære eksperimenter, fant vi ut at høyere transfeksjonseffektivitet oppnås ved å anvende en 02:01 forhold av DNA til lipofektamin i forhold til den foreslåtte konsentrasjonen av DNA som anbefales i den generelle protokollen. Ved hjelp av disse forholdene, vi rutinemessig observert 70-80% transfeksjonseffektivitet.
