Abstract
Cell invasjon gjennom en tett tredimensjonal (3D) matrise antas å avhenge av evnen til cellene til å generere strekkrefter. For å kvantifisere rolle i celle tractions under invasjon i 3D, presenteres en teknikk for å måle den elastiske belastning energien som er lagret i grunnmassen på grunn av traksjonsinduserte deformasjoner. Matrisen deformasjoner rundt en celle ble målt ved å spore 3D posisjoner av fluorescerende kuler tett innleiret i matrisen. De kule stillinger fungerte som noder for en element flislegging. Fra belastningen i hvert element og den kjente matrise elastisitet, beregnet vi den lokale påkjenningsenergien i matriksen som omgir cellen. Vi har anvendt teknikk for å måle belastningen energien av meget inngripende MDA-MB-231 bryst-karsinom og A-125 lunge carcinoma-celler i kollagen geler. Resultatene ble sammenlignet med påkjenningsenergien som genereres ved ikke-invasiv MCF-7 bryst og A-549 lunge carcinoma celler. I alle tilfeller, cellene lokalt kontrahert matrisen. Invasive bryst og lunge carcinoma celler viste en signifikant høyere kontraktilitet sammenlignet med ikke-invasive celler. Høyere kontraktilitet, ble imidlertid ikke universelt assosiert med høyere invasivitet. For eksempel, ikke-invasive A-431 vulva-karsinom-celler ble de kontraktile celler blant alle cellelinjene som ble testet. Som en universell funksjon, men vi fant at invaderende celler forutsatt en langstrakt spindel-lignende morfologi, i motsetning til en mer sfærisk form av ikke-invasive celler. Følgelig er fordelingen av belastningen energitetthet rundt invaderende celler fulgt mønstre av økt kompleksitet og anisotropi. Disse resultatene tyder på at ikke så mye omfanget av trekkraft generasjon, men deres retningen er viktig for kreftcelle invasjon
Citation. Koch TM, Münster S, Bonakdar N, Butler JP, Fabry B (2012) 3D Traction Forces i Cancer Cell Invasion. PLoS ONE 7 (3): e33476. doi: 10,1371 /journal.pone.0033476
Redaktør: Harry Mellor, University of Bristol, Storbritannia
mottatt: 07.07.2011; Godkjent: 15 februar 2012; Publisert: 30 mars 2012
Copyright: © 2012 Koch et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av følgende: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FA336 /2-1; National Institutes of Health – bioteknologi forskningssamarbeid NIH-BRP: HL65960. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cell migrasjon gjennom en bindevev matrix er en viktig del av normal fysiologisk funksjon, for eksempel ved sårheling, men er også et kjennetegn på avvikende atferd sett i kreftcelle invasjon gjennom bindevev. Cellemigrering på plane 2D-matrikser, slik som på en vanlig plast vevskulturskål, er blitt beskrevet som en syklisk prosess som involverer polarisering, fremspring dannelse ved forkanten, trekkraft generering av cellenes acto-myosin maskineri, og tilbaketrekking på baksiden ende av cellen [1]. Treghet og viskøse motstandskrefter er ubetydelige, og celle tractions er nødvendig bare for cellespredning og for å overvinne integrin-medierte adhesive krefter.
Cellemigrering gjennom en tett 3D nettverk av ekstracellulære matriksproteiner, i motsetning til 2D migrasjon, er bare mulig når cellen genererer tilstrekkelig tractions å overvinne sterisk hindring av omgivelsene [2]. Migrasjon hastigheten av celler i en 3D-matrise korrelerer med de maksimale matrise forskyvninger, som er en indikasjon på trekk kraften som disse cellene utøver [3]. Celler hvori acto-myosin sammentrekning hemmes ikke er i stand til å migrere gjennom tette 3D matrisene [4]. Disse funnene føre til hypotesen om at kreftceller som genererer høye tractions er mer invasive enn celler med lavere tractions. I denne studien presenterer vi en fremgangsmåte ved hvilken disse tractions kan kvantifiseres, og vi teste denne hypotesen i forskjellig invasivt karsinom-cellelinjer.
2D celle tractions kan måles ved å observere forskyvninger av kulene er innleiret i et plant fleksibel gel substrat på hvilket cellene dyrkes. Matematisk er dette en dårlig stilte problem som flere fremgangsmåter har blitt utviklet [5]. Tidlig tilnærminger invertert forholdet mellom forskyvninger og tractions i en celle på en semi-uendelig elastisk halfspace ved hjelp regularisering [6] eller Fourier [7] metoder. Disse fremgangsmåter ble nylig raffinert for å ta hensyn til en endelig tykkelse av det elastiske substrat [8], [9], [10], for å forbedre romlig oppløsning [11], og for å inkludere traksjonskomponenter normalt på substratet [12].
Perler kan også spres i 3D-cellekultursystemer for å estimere mobil kontraktilitet under trekket [13], [14]. Ved bruk av denne tilnærmingen, ble 3D-celle tractions og deres romlige fordeling nylig målt for første gang, ved å utvide ideene til 2D trekkraft mikroskopi til den tredje dimensjonen [15]. Denne nye fremgangsmåte er teknisk og beregningsmessig involvert, imidlertid, og krever en syntetisk polymer gel med lineære elastiske egenskaper som en 3D-matrise. Her presenterer vi en metode for å kvantifisere 3D kontraktilitet av celler i nesten alle biopolymer nettverk ved hjelp av en standard fluorescens mikroskop. Fremgangsmåten er beregningsmessig effektiv og robust mot målestøy. I stedet for å beregne det fulle 3D trekkraft kart over cellen, måler vi påkjenningsenergi og dets tetthetsfordeling i 3D-ekstracellulær matriks rundt isolerte celler. Denne metoden gir en skalar mål for den totale cellulære kontraktilitet. Kildekoden til alle nødvendige programmer for å utføre målingene er gitt i Hjelpemiddel Information File S1.
Vi har brukt denne metoden for å sammenligne kontraktilitet av flere tumorcellelinjer med ulike evner til å invadere et tett kollagen nettverk. Vi viser at høy kontraktilitet er nødvendig, men ikke tilstrekkelig for invasjon gjennom en tett 3D-nettverk; noen ikke-invasive tumorceller kan også generere høy kontraktile styrker, men mangler evnen til å lede disse kreftene for å drive sin bevegelse.
Resultater
Måling av belastning energi
For å måle påkjenningsenergien som cellene expend å deformere deres tredimensjonale omgivelser, blir cellene enten integrert i monomere kollagen før polymeriseringen, eller dyrkes på en kollagen-gel overflate og fikk deretter spontant invadere i kollagen bulk. Under begge betingelser, cellene spre og strekke seg inn i den porøse struktur og kollagen utøve trekkrefter at deformere gelen. Den således brukt energi er lagret som elastisk påkjenningsenergien i gelene. Ved å måle deformasjonen av kollagen geler, er det mulig å beregne påkjenningsenergien hvis de elastiske mekaniske egenskaper av kollagenmatriksen, er kjent.
Gel deformasjoner blir bestemt fra måling av posisjonene av fluorescerende markør perler som er innleiret gjennom gelen. Vi registrerer optiske seksjoner hver 2 mikrometer gjennom hele tykkelsen (rundt 500 nm) av gels (Movie S1). Ved hjelp av en forskjell-med-interpolasjonsalgoritme, kan vi løse perle forskyvninger med sub-piksler (Hjelpemiddel Informasjon Tekst S1). Nøyaktigheten av fortrengning måling for Ø 1 mikrometer perler på 10 x forstørrelse er 22 nm i xy-planet og 130 nm langs den optiske aksen.
I denne studien bruker vi rekonstituert kollagen gels som dannes spontant under selv -assembly av kollagen fibernett (fig. S1A). Ved en kollagenkonsentrasjon på 2,4 mg /ml, disse nettverkene danner en porøs struktur med en midlere porestørrelse på 1,3 um [16]. På en skala lengde større enn 10 um, kan nettverket morfologi betraktes som homogent og isotropt [16]. Den gjennomsnittlige avstand mellom de innebygde fluoriserende perler er ~24 um (fig. S1b), som er mye større enn porestørrelsen, slik at vi kan bruke et kontinuum tilnærming for å beskrive de mekaniske egenskaper for den kollagen-nettverk. For en validering av denne tilnærmingen se saksdokumenter Tekst S1 (Fig. S8, S9). Målinger med et kjegle-plate-reometer avslørte en overveiende elastisk respons av kollagen-nettverk (fig. S1d). Kollagen gels også utviser ikke-lineær oppførsel med fremtredende stamme avstivende (Fig. S1c), men for stammer av opp til 5%, kan materialegenskaper tilnærmes ved en lineær elastisk oppførsel med en skjærmodul
G
av 118 Pa. Vi bemerkning på denne tilnærming i diskusjonen.
den belastningen energi celler i kollagen gels er beregnet ut fra perle forskyvninger mellom deformert og udeformerte tilstand av geler. Den udeformerte, kraft-fri tilstand av kollagen blir oppnådd ved behandling av cellene med 4 mM cytokalasin D, som forstyrrer aktin cytoskjelettet og undertrykker styrkegenerering (film S2). De kule posisjoner av udeformerte gel anvendes for tessella det ekstracellulære mikromiljøet og tjene som hjørne noder av tetrae endelige elementer (fig. S3). De kule forskyvningene deretter gi opphav til et påkjenningsenergi i hvert elementmetoden. Påkjenningsenergien av et element, normalisert med elementet volum, gir stammen energitetthet (Hjelpemiddel Informasjon Text S1).
Denne fremgangsmåten for å utlede det materiale belastningen fra en tesselasjon av målte posisjoner er følsomme for målestøy, og omsorg må tas for å undertrykke sine bidrag til belastning energiresultater. Denne effekten skyldes det faktum at påkjenningsenergien er en kvadratisk funksjon av forskyvningsfeltet. Derfor er forventningsverdien av støybidrag ikke-null selv om støyen svinger rundt null. Feilaktige strekk energier fra støy kan i stor grad unngås ved å identifisere og eliminere tetraedriske elementer som er flate i den forstand plane nær-degenererthet (fig. S4, S5), og ved å subtrahere en eksperimentelt bestemt belastning energi grunnlinjen forårsaket av vulsten forskyvning støy (Fig . S6 og saksdokumenter Tekst S1).
den belastningen energitettheten er fordelt i komplekse mønstre i volum som omgir cellen (fig. 1). Generelt, er stammen energitettheten størst i umiddelbar nærhet av cellen, spesielt i nærheten av cellepolene, og faller raskt til neglisjerbare nivåer i alle retninger bort fra cellen. Den samlede påkjenningsenergi oppnås ved å integrere stammen energitettheten over et stort volum rundt cellen. Vår metode omfatter cellevolumet i seg selv, forutsatt at det for å ha en elastisitetsmodul lik den til den ekstracellulære matriks -. Vi bemerkning om denne forutsetning i Discussion
Strekkenergitetthet rundt en langstrakt, MDA-MB-231 bryst-karsinom celle innebygd ~400 mikrometer dypt i en kollagen gel. En isosurface belastning energi er vist med kutt anslått til de koordinere flyene som indikert av de gjennomsiktige flyene. Stammen energitettheten er størst i umiddelbar nærhet av celle polene og avtar hurtig i alle retninger bort fra cellen. Integrering av stamme energitetthet gir den samlede påkjenningsenergi og var 3,7 PJ i dette eksempel. Målestokken er 50 mikrometer.
Strain energi fra invasive og ikke-invasive carcinoma celler
For å teste hypotesen om at invasiv carcinoma celler generere høyere tractions sammenlignet med ikke-invasive celler, vi målt 3D påkjenningsenergi av fremmede celler (A-125 lunge og MDA-MB-231 bryst karsinom celler), og av ikke-invasive celler (A-549 lunge, MCF-7 bryst og A-431 vulva-karsinom-celler (ATCC -LGC-Promochem, Wesel, Tyskland)). Invasivitet av disse cellelinjer ble bestemt ved utsåing av cellene på en tykk gel kollagen og tillater dem å invadere i gelene. Etter tre dager, målte vi invasjonsprofiler som den romlige fordelingen av celletetthet ved forskjellige dybder gel [17]. De fleste celler fra de ikke-invasive cellelinjer som ikke var i stand til å invadere inn i hoveddelen av kollagen gel, og de få cellene som invaderer har holdt seg nær overflaten (fig. 2a). Invasive-celler, i motsetning, var i stand til å invadere dypt inn i gelene
a (figur 2a.):. Invasion profiler av A-125 og A-549 lunge, MDA-MB-231 og MCF-7 bryst og A-431 vulva karsinomceller. Celler ble sådd ut på overflaten av kollagen geler og tillates å spre seg og invadere i 3 dager. Invasjonen profil vs gel dybder beskriver den kumulative sannsynligheten for å finne en celle under en gitt dybde. Invasive celler ble preget av sin evne til å invadert dypt inn i gels. b: Drag energi av ikke-invasive og invasive karsinomceller. Invasiv lungekreft (n = 36) og brystkreft (n = 33) karsinomceller generere signifikant høyere strekk energier sammenlignet med ikke-invasiv lungekreft (n = 49) og brystkreft (n = 31) karsinomceller. Ikke-invasive vulva-karsinom-celler (n = 35), derimot, genererer den største påkjenningsenergi fra alle cellelinjene som ble testet (Fig S10.). c: anisotropi av cellen form. Ikke-invasive celler er betydelig rundere i forhold til invasiv celler. d: Anisotropi av stammen energitettheten er vesentlig høyere i invasiv sammenlignet med ikke-invasive celler. På grunn av at strekk energi- og anisotropi-verdier fra forskjellige celler følge en log-normalfordeling (Hjelpemiddel informasjonstekst S1, fig. S10, S11, S12), geometrisk gjennomsnitt ± geometrisk standardfeil er vist i fig. b-d.
For belastning energimålinger ble cellene innleiret i gelene før polymeriseringen, og isolerte celler i det sentrale område av gelen ble valgt for målingene. Både invasive lunge- og brystkreft celler gitt vesentlig høyere 3D tractions enn ikke-invasiv lunge og bryst karsinom celler, noe som reflekteres i betydelig høyere belastning energi av disse cellene (fig. 2b). Høy kontraktilitet, men ikke alltid korrelerer med celle invasivitet. Vi fant at ikke-invasive A-431 vulva carcinoma celler var overraskende kontraktile (fig. 2b). Videre invasiv lunge carcinoma celler var 4 ganger mer kontraktile enn invasiv brystkreft celler, men de var mindre invasiv (Fig. 2a).
Vi har merket oss at invasive carcinoma celler fra både lungene og brystet hadde en avlange spindel-lignende morfologi, mens ikke-invasive cellene hadde en rundere form (fig. 3a-e). Vi kvantifisert celleform anisotropi av forholdet mellom maksimal til minimal egenverdiene til den andre øyeblikk av cellen kontur. En verdi på 1 tilsvarer en sirkelrund form, og økende verdier til flere avlange former. Invasive cellelinjer viste en signifikant høyere cellen form anisotropi sammenlignet med ikke-invasive celler (fig 2b.)
a-e. Displacement felt (anslått til xy-planet, normalisert til de største forskyvninger) rundt invasiv og ikke-invasive carcinoma celler. Ikke-invasive celler trekke sammen gels mer isotropically. Invasive celler generere svært anisotrope fortrengning felt med store forskyvninger på celle stolper og en region med relativt små forskyvninger i nærheten cellen sentrum. f-j: 3D-forskyvnings felt av de samme cellene som vist i a-e. k-o: Sil energitetthet rundt de samme cellene som vist i a-e. Et lukket isosurface av belastning energitetthet (30% av maksimal verdi) er vist med kutt anslått til de koordinere flyene. Belastningen energitettheten er fordelt mer isotropically rundt non-invasiv celler med nesten sfæriske isosurfaces, og distribueres mer anisotropisk rundt invasive celler med komplekse isosurface former.
Cell form anisotropi er ledsaget av en anisotropisk fordeling av cellulære tractions og påkjenningsenergien rundt cellen (fig. 2c). Vi kvantifisert påkjenningsenergien anisotropi igjen av forholdet mellom maksimal til minimal egenverdiene til den andre øyeblikk av stammen energitettheten rundt en celle. Den belastningen energi ble distribuert mer anisotropisk rundt invasive celler, mens non-invasiv celler smittet av gel mer isotropically i alle retninger.
Videre innsikt i rollen anisotropisk kraftfordeling under carcinoma celle invasjon kan oppnås ved å kombinere belastning energi målinger med time-lapse opptak tetthet. Invasive MDA-MB-231 brystkreft celler tilpasse sine kontraktile stater (Fig. 4b) i samråd med sin vandring gjennom gel. Time-lapse bilder av en representant celle viser at retningsendringer i den lokale belastningen energitetthet forut for endringen i migrasjon retning (Fig 4g-j, jf. Figur S15, S16 og S17 og Movie S4 for komplett datasett.). Et kontrast datasett viser et tidsintervallmåling av et sterkt kontraktile men ikke-invasiv vulva karsinomcellelinje. Cellens kontraktile atferd (Fig. 4a) er heller ikke statisk, men svingningene er mindre sammenlignet med invasive celler (Fig. 4b). Viktigere er imidlertid cellen ikke er i stand til å generere en anisotropisk fordeling av tractions og belastning energi over lengre perioder (figur 4c-f, jf. Figur S13, S14 og Movie S3 for komplett datasett.), Og dermed netto bevegelsen av cellen er ubetydelig (Hjelpemiddel Informasjon Text S1)
a:. tidsforløpet av den samlede påkjenningsenergi rundt en ikke-invasiv vulva karsinomcellelinje (A-431) i en 3D-kollagen-gel. Null energi referansen ble målt etter Cytochalasin D-indusert spenning utgivelse. Den samlede påkjenningsenergi varierer med omtrent ± 25% rundt en høy middelverdi. b: Tidsforløp av den samlede påkjenningsenergi rundt en invasiv brystkreft celle (MDA-MD-231) i en 3D-kollagen-gel. Den belastningen energi viser store svingninger på ca ± 50% rundt gjennomsnittet. c-j: Tids serie av lysfelt bilder av en ikke-invasiv vulva karsinomcellelinje (A-431) (c-f) og en invasiv MDA-MB-231 bryst karsinom celle (g-j) i et 3D-kollagen-gel. Lagret er høydekurver som viser relative endringer i belastning energitetthet mellom to påfølgende tidssteg. Blå farge indikerer områder hvor spenningen er avslappet mellom påfølgende tidssteg, og røde farger indikerer områder hvor spenningen økes. Celleformen er skissert i hvit for oversiktens skyld. Mørk blå piler indikerer retningen av celle bevegelse mellom de to tidssteg (se Fig. S13, S14, S15, S16 og S17 og filmer S3 og S4 for mer informasjon).
Diskusjoner
påkjenningsenergi som cellene øve på sine omgivelser er et robust skalar mål på celle tractions i en 3D-biopolymer matriks, slik som en kollagen-gel. Fremgangsmåten er beregningsmessig effektiv; analyse av omtrent 10.000 perle forskyvninger mellom to påfølgende bilde stabler sammen med evalueringen av kartet resulterende belastningen energitettheten tar bare noen få minutter på en standard stasjonær datamaskin. Videre kan fremgangsmåten lett implementeres på en hvilken som helst fluorescens mikroskop med en motorisert z-fokus.
Fremgangsmåten er basert på flere forenklende forutsetninger. Først neglisjerer vi fibernettverkstruktur av kollagen gel og beskriver det som et kontinuum. Gel deformasjoner blir samplet ved list steder, og belastningen feltet mellom perlene blir beregnet ved en tri-lineær interpolasjon. I lengden skala fra en gjennomsnittlig perle separasjon av 24 mikrometer (Fig. S1b), er denne tilnærmingen en god tilnærming, men undervurderer den sanne belastning energi (Fig. S7).
For det andre antar vi lineære elastisk materialegenskaper og ignorere belastningen avstivning reaksjon av matrisen. Dette fører til en undervurdering av den absolutte påkjenningsenergi, spesielt for høyt kontraktile celler i sterkt ikke-lineære matriser. Dette er ikke en iboende mangel ved vår metode, men. Den lineære Stivhetsmatrisen av kollagen kan lett erstattes av en ikke-lineær konstituerende modell for kollagen gels (Hjelpemiddel Informasjon Tekst S1). Alternativt kan den lineære regime av fibrøse biopolymer nettverk forlenges ved tilsetning av en hydrogel [18].
For det tredje, er cellens mekaniske egenskaper antas å være den samme som den omgivende kollagen gel, og påkjenningsenergien blir beregnet over hele volumet, dvs. kollagen omgir cellen og volumet som opptas av selve cellen. Men som cellevolumet er liten – typisk mindre enn 3 tetraeelementer – den resulterende feilen er ubetydelig
En iboende begrensning av 3D trekk analysene er at celler kan lokalt bli dårligere, syntetisere, og tverrbinde den ekstracellulære matriks og. for derved å endre de matrise mekaniske egenskaper. For å minimere global matrise remodellering, blandet vi bare et lite antall celler med gelen før polymeriseringen. Eventuelle lokale endringer i matrise mekaniske egenskaper kan da med rimelighet antas å være begrenset til et volum rundt cellen som er liten i forhold til den typiske gelvolumet med høy belastning energitettheter.
Mens vår teknikk ikke kan gi en detaljert trekkraft kart over celleoverflaten, det gir flere fordeler sammenlignet med nylig utviklede metoder. Fordelingen av belastningen energitetthet er løst med tilstrekkelig romlig oppløsning for å skille områder med høy og lav kontraktilitet langs cellen form. Sammen med forskyvning feltet, er dette tilstrekkelig informasjon om 3D mobil kontraktilitet for mange biologiske spørsmål. Dessuten kan belastningen energifordeling bli integrert over matrisen volum som omgir cellen for å oppnå en enkel, skalar og biologisk relevant mål på celle kontraktilitet – den samlede påkjenningsenergi. Viktigst, kan vår teknikk brukes til å måle 3D cellulær kontraktilitet i en hvilken som helst biopolymer nettverk. Dersom biopolymer nettverket er ikke-lineær, men en lineær tilnærming benyttes for beregning av stammen energi, vil det være uunngåelig noen feil i strekkenergitettheter i de områder hvor celle-indusert stamme nå den ikke-lineære regime. Imidlertid er denne feilen ikke er degenerative i den forstand at det forekommer bare en gang ved hver romlig posisjon av et element, og ikke forplanter seg til naboelementer (som er tilfellet med tractions som er svært følsomme for fjernt forskyvninger og matrise ikke-lineariteter).
Våre data viser at invasive celler utøve betydelige krefter på sine omgivelser. Stammen energi som utøves av MDA-MB-231 bryst carcinoma-celler i en myk (118 Pa) 3D-gel var omtrent 10 ganger høyere enn de verdier som er målt for celler dyrket på stive (4,8 kPa) polyakrylamidgeler [17]. Dette er overraskende, da mange celletyper blitt mer kontraktile på stivere matriser [19]. Vi spekulerer i at dimensjonalitet av den omgivende grunnmasse kan spille en viktig rolle for evnen til cellene for å generere tractions.
Store kontraktile krefter, er imidlertid ikke tilstrekkelig for celle invasjon. Våre data viser at det ikke er invasivt karsinom-celler er i stand til å generere svært høye strekk energier. For effektiv celle invasjon, er det viktig at celle tractions brukes effektivt ved å lede dem langs en bestemt bane migrasjon. I samsvar med dette synet, fant vi at cellen form og fordeling av belastningen energitettheten er svært anisotropisk i invasive celler, men nesten isotrop i ikke-invasive celler. En forbindelse mellom anisotrope celleform og invasiv adferd er tidligere blitt beskrevet i celler etter epitelial-til-mesenchymale overgang [20], og det har vært spekulert at mekanismen for økt invasivitet i disse cellene er et anisotropt kraftfordeling [21] og resultatet av rom-tid koordinering av utstikket, vedlegg, trekkraft generasjon, og meldingen [22], [23]. Funnene presenteres her støtter dette synet og peker på viktigheten av form anisotropi og polaritet i migrere cellene. Vår teknikk tilbyr et verktøy for å studere disse prosessene i et 3D-miljø.
Metoder
Tredimensjonal kollagen analysen
Rat tail kollagen (kollagen R, Serva, Heidelberg, Tyskland ) og bovint skinnkollagen (collagen G, Biochrom, Berlin, Tyskland) ble blandet i et forhold på 1:01. Vi tilsatte deretter 10 vol% av natriumbikarbonat (23 mg /ml), oransje fluorescerende latekskuler med en diameter um (FluoSpheres®, Invitrogen, F8820) og 10 vol% av 10 x DMEM (Biochrom). Oppløsningen ble nøytralisert med 1 N natriumhydroksyd. Omtrent 2000-celler ble blandet i 1,2 ml kollagen løsning og satt til en 35 mm kulturskål. Oppløsningen ble polymerisert ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO
2 i 1 time. Polymeriserte kollagen gels hadde en tykkelse på ca 500 mikrometer.
Optiske seksjoner
For å kvantifisere 3D gel deformasjon, vi gjentatte ganger tatt opp like langt optiske z seksjoner (2 mikrometer fra hverandre) gjennom hele gel tykkelse ved hjelp av en motorisert invertert fluorescens mikroskop (DMI6000B, 20 × objektiv, NA = 0,4, 0,5 × videokobling, Leica Microsystems, Tyskland) er utstyrt med en CCD-kamera (ORCA ER, Hamamatsu Photonics, Tyskland). Mikroskopet ble dessuten utstyrt med en skreddersydd trinns inkubator for å holde cellene ved 37 ° C, høy fuktighet og 5% CO
2. Måleprosessen ble automatisert med tilpasset programvare. For å bestemme deformasjonen av kollagen geler ble minst to bildestakker registrert. Det første bildet stabel tilsvarte den deformerte tilstand av gelen. Det andre bildet stabel ble registrert etter at cellene ble behandlet i minst 10 minutter med cytokalasin D (4 uM) for å forstyrre aktin cytoskjelettet og for å oppnå den kraft-frie, udeformerte tilstand av gelen.
3D posisjoner av perler
3D forskyvning av hver perle ble bestemt ved bruk av en 3D-forskjell-med-interpolasjon algoritme anvendt på de to bildestakker. De kule posisjoner i den første bildestabelen er identifisert med en enkel intensitet terskel. En subvolume på 4,5 um x 4,5 um x 14,0 mikrometer i x-, y- og z-retningen ble deretter skåret ut rundt hver perle. Posisjonen av den samme vulsten i det andre bildestabelen ble deretter bestemt ved å forskyve subvolume fra den første stabelen i forhold til den andre stabelen inntil de kvadrerte forskjeller i de bildeelementintensitetene ble minimalisert (fig. S2). Sub-pixel nøyaktighet ble oppnådd ved tri-lineær interpolasjon av piksel intensiteter. Med denne metoden kan 3D-forskyvninger av kulene måles med en nøyaktighet på 22 nm i x- og y-retningen, og 130 nm i z-retningen.
Måling av strekkenergi
for å beregne en kontinuerlig belastning felt fra diskret perle posisjoner og deres forskyvninger, bruker vi en element tilnærming av gelen der perle stillinger tjene som noder av lineære tetrahedral elementer. Element mesh ble oppnådd ved Delaunay flislegging. Noden forskyvninger blir deretter gitt av perle forskyvninger mellom to bilde stabler. Hvert element ble tildelt med isotrop lineære elastisk materialegenskaper (skjærmodul 118 Pa, Poissons tall 0,35). Påkjenningsenergien for hvert element ble deretter beregnet som et produkt av stivhetsmatrisen med bevegelseskomponenter (Hjelpemiddel Informasjon Text S1).
Støy eliminering
påkjenningsenergien beregning fra forskyvningsdata er følsomme til målestøy, men den har bare en additiv effekt som i stor utstrekning kan korrigeres for ved enkel subtraksjon. I hvilken grad et individ tetraedrisk element påvirkes avhenger av sitt volum og sin form. Jo mindre elementet og den flatere form, desto mer tilbøyelig er det til uønskede belastning energiresultater. Formen av et element kan kvantifiseres med en passende form tiltak. Her benyttes et forhold mellom element volum til summen av cubed kantlengder. Normalisert ved, varierer denne verdi fra 0 (svarende til maksimalt degenererte elementer) til 1 (verdien av et regulært tetraeder med alle 6 kanter av lik lengde). Elementer med en formfaktor mindre enn 0,5 er uforholdsmessig følsomme for fortrengnings støy og er derfor ekskludert fra beregningen. Hullene i feltet belastningen energitettheten av de manglende elementene er fylt med nærmeste nabo interpolering. Påkjenningsenergien feil av de gjenværende elementer kan beregnes ut fra kjennskap til forskyvningsfeil og blir subtrahert fra resultatene.
tumorcelle-invasjon assay
Collagen-geler ble fremstilt som beskrevet ovenfor, men uten inkorporering av fluoriserende perler. 25.000 celler ble sådd på toppen av kollagen matriks og dyrket i 72 timer. På denne tidsperioden, forskjeller i invasivitet av cellene var godt synlig. Etter fiksering med 2,5% glutaraldehyd-løsning i PBS og Hoechst 33342 kjerner farging ble antallet invaderte celler og deres invasjon dybde bestemmes i 50 ikke-overlappende synsfelt rundt sentrum av gelene. Denne målingen ble automatisert skreddersydd programvare som finner kjernen av celler i stabler av bilder som er tatt på 2 mikrometer intervaller gjennom hele tykkelsen av geler.
Cell form anisotropi
For å kvantifisere celle formen vi ansatt en analyse av andre øyeblikk på 2D projeksjoner av cellen. Hver celle ble skissert manuelt med en lukket polygon i kontrast fasen ved z-stillingen med størst skarphet som er definert ved en Tenenbaum gradient tiltak [24]. Den lukkede polygon ble deretter brukt til å lage et binært bilde av cellen,. En matrise av andre øyeblikk kan da beregnes som, hvor x- og y-pikselkoordinater er sentrert i midten av massen. Cellular form anisotropi er definert ved forholdet mellom maksimum til minimum egenverdien av. En perfekt runde celle ville dermed ha en anisotropi verdi på 1, og økende verdier betegne stadig anisotrope former som avlange spindel-lignende former.
anisotropi belastning energitetthet distribusjon
For å karakterisere anisotropi av tetthetsfordeling påkjenningsenergien rundt en celle, beregner vi den andre øyeblikk av stammen energitetthet som, hvor x-, y- og z-koordinatene er sentrert i midten av massen av strekkenergitetthet. Indeksen for anisotropi for distribusjon stammen energitetthet er da definert som forholdet mellom maksimum til minimum egenverdien av de andre øyeblikk. Dermed vil en perfekt isotrop fordeling av belastningen energitetthet føre til en verdi på 1, og økende verdier i denne indeksen indikerer distribusjoner med økende anisotropi.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Egenskaper av kollagen gels. a) Confocal snitt gjennom en collagen-gel. b) Fordeling av perle-perle avstander. c) Stress-deformasjon av kollagen nettverket målt i en kjegle-plate-reometer under en belastning rampe (hastighet: 1% /s). Oppførselen er tilnærmet lineær for påkjenningen under 5%; d) Frekvens målt i en membran-plate rheometer. Amplituden av sinusformede svingninger var 5%. Lagringsmodulen G «er 118 Pa ved en frekvens f på 1 Hz.
