Abstract
Økt dødelighet som følge av lungekreft har gjort det nødvendig å lete etter potensielle nye kreft forbindelser som carbazole derivater. Carbazoles er aromatiske heterosykliske forbindelser med anticancer, antibakteriell og antiinflammatorisk aktivitet. Studien undersøkte evnen av den nye karbazol forbindelsen (Z) -4- [9-etyl-9AH-karbazol-3-yl) amino] pent-3-en-2-on (ECAP) for å indusere cytotoksisitet av lungekreftceller og virkningsmekanismen. ECAP ble syntetisert som et gult pulver med smeltepunkt på 240-247 ° C. 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT), lipidperoksidasjon og komet analyser ble brukt for å vurdere den cytotoksiske effekten av forbindelsen på A549 lungecancerceller. Proteinekspresjon ble bestemt ved anvendelse av Western blot, Apoptose ble målt ved luminometry (caspase-3/7, -8 og -9) analyse og flow-cytometri ble anvendt for å måle fosfatidylserin (PS) eksternalisering. ECAP induserte en p53-mediert apoptose av lungekreftceller på grunn av en vesentlig reduksjon i ekspresjonen av antioksidantforsvar proteiner (Nrf2 og SOD), Hsp70 (p 0,02) og Bcl-2 (p 0,0006), for derved opp regulerende reaktive oksygenarter (ROS) produksjon. Dette resulterte i DNA-skade (p 0,0001), oppregulering av ekspresjon Bax og kaspase-aktivitet og induksjon av apoptose i lungekreftceller. Resultatene viser at anticancer potensialet i ECAP på lungekreft
Citation. Molatlhegi RP, Phulukdaree A, Anand K, Gengan RM, Tiloke C, Chuturgoon AA (2015) cytotoksisk effekt av en roman Synthesized Carbazole Compound på A549 Lung Cancer Cell line. PLoS ONE 10 (7): e0129874. doi: 10,1371 /journal.pone.0129874
Redaktør: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 07.11.2014; Godkjent: 14 mai 2015; Publisert: 02.07.2015
Copyright: © 2015 Molatlhegi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Relevante data er tilgjengelig på Figshare.com: 1) MTT analyse Raw data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425070. 2) A549 celler TBARS analyse: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425071. 3) A549 celler Comet Assay Raw data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425073. 4) Western blot rå data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425077. 5) Luminometry caspase og ATP-data etter 6 og 24 timer: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425078. 6) Annexin flekken for A549 celler Flowcytometri data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425080. 7) Carbazole 6 (CML1) Syntese og Characterization_1: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425089. 8) Carbazole 6 (CML1) Syntese og Characterization_2. https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425090
Finansiering: RM erkjenner College of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal for . finansiering dette prosjektet
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Kreft er blitt en andre ledende livstruende sykdom regnskap for høy dødelighet. priser etter hjerte- og karsykdommer over hele verden [1, 2]. Ifølge Globocan, i 2012 var det om lag 14,1 millioner nye krefttilfeller og 8,2 millioner kreftrelaterte dødsfall globalt, sammenlignet med rapporterte 12,7 millioner og 7,6 millioner i 2008. Flertallet av globale krefttilfeller rapportert i utviklingsland, med en 63% dødelighet sats [3]. En økning i lungekreft tilfellene i utviklingsland, inkludert Sør-Afrika (SA) er assosiert med smittsomme sykdommer som ervervet immunsviktsyndromer (AIDS) og tuberkulose (TB) [2]. I løpet av 2006 alene om 4525 lungekreft dødsfall ble rapportert i SA. En økning i lungekrefttilfeller i SA er også knyttet til andre faktorer som røyking, miljøgifter, yrkesmessig eksponering og endring av livsstil [2, 4].
reaktive oksygenforbindelser (ROS) er en av de viktigste årsakene for malignitet. De er produkter av oksygen metabolisme i cellene og deres funksjoner varierer fra celle signalisering, homeostase og antimikrobielle effekter [5]. Pattedyrceller er kontinuerlig utsatt for ROS generert både extrinsically og egentlig [6]. Kronisk og vedvarende eksponering for høye ROS-nivåer fører til DNA, protein og lipid skade, og kan resultere i induksjon av sykdommer slik som kreft [7, 8]. For å opprettholde homeostase i vev flercellede organismer, blir celleproliferasjon og død strengt regulert av cellesyklus og apoptose prosesser. Imidlertid kan mutasjon av tumor suppressor-gen (er) (for eksempel p53) og forhøyede nivåer av ROS tillate uregulert vekst fører til kreftutvikling. Pattedyrceller inneholder forsvarssystemer for å regulere oksidativ skade, og disse inkluderer proteiner slik som superoksyd-dismutase (SOD), nukleær faktor erytroid 2 relatert faktor to (Nrf2) og varmesjokkprotein 70 (Hsp70) [9-12].
De overlevelse for lungekreftpasienter som gjennomgår operasjonen er dårlig, derfor det er behov for mer potente anti-lunge kreft narkotika. Utfordringen fortsatt er evnen til å utvikle svært effektive legemidler spesifikke for lungekreft med liten eller ingen bivirkninger på normale celler [13]. Heterocykliske grupper er blitt en viktig klasse av organiske forbindelser for forskning på grunn av deres tallrike medisinske og landbruket [14].
Carbazoles er aromatiske heterocykliske organiske forbindelser, med en tricyklisk struktur bestående av to kondenserte benzenringer hver på fem -membered nitrogenholdige ring [14, 15]. Disse syntetiske eller naturlige produkter virke gjennom interaksjon med DNA; de DNA-skade som resulterer i inhibering av syntese av nye DNA eller RNA [16]. Carbazoles og deres derivater hemmer kreftvekst ved interkalering inn i DNA, inhibering av DNA topoisomerase II-aktivitet, så vel som ved dannelse av kovalente DNA-addukter formidlet gjennom oksydasjon av cytokrom P
450 og peroksider [15]. Forskjellige naturlige og syntetiske carbazolforbindelser derivater inkludert ellipiticin, olivacine, elliptinium acetat, mahanimbine, mukonine, koenoline og rebaccamycin har blitt rapportert å ha antineoplastisk aktivitet [15].
Basert på deres rapporterte antitumor-, antibakterielle og anti-inflammatoriske aktiviteter , forskjellige syntetiske carbazolforbindelser-analoger er blitt syntetisert fra naturlig forekommende carbazoles [14, 15, 17]. Carbazoles og deres derivater er i økende grad blir målrettet for potensiell bruk i kreftbehandling grunn det til sin store π-konjugert system som gjør det enkelt å innføre ulike funksjonelle grupper i den stive carbazole ring [15].
Undersøkelsen undersøkte anticancer egenskaper ECAP på lungecancerceller og bestemmes den anti-neoplastisk pathway den modulerer sammen med de tilknyttede proteiner. Det ble antatt at ECAP indusert apoptose av A549 lungekreftceller gjennom induksjon av oksidativt stress.
Materialer og metoder
Carbazole derivat (ECAP) ble syntetisert ved Institutt for kjemi (Durban University of Technology , SA). Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra fullblod fra en frisk mann frivillig etter å ha innhentet Institutional etisk godkjenning (BF 170/11). A549 celler ble hentet fra Highveld Biologicals (Johannesburg, SA), Cell kultur reagenser fra Whitehead Scientific (Johannesburg, SA), ellipiticin (Sigma, St. Louis, MO, USA) og Western blot reagenser fra Bio-Rad (USA). Andre reagenser ble oppnådd fra Merck (SA)
Syntese av (Z) -4 -. ((9-etyl-9H-karbazol-3-yl) amino) pent-3-en-2-on
En blanding av acetylaceton (1,02 ml, 0,01 mol), 3-amino-9-etylkarbazol (2,1 g, 0,01 mol) og indium-klorid (0,22 g, 0,001 mol) i etanol (25 ml) ble oppvarmet under tilbakeløp i 5 timer. Etter fullførelse av reaksjonen ble overskudd av løsningsmiddelet fordampet. Resten ble oppløst i is /vann og ekstrahert med etylacetat. Kombinerte organiske lag ble tørket over vannfritt natriumsulfat. Det ble deretter renset på en silika gel kolonne (eluent-petroleter: etylacetat (90:10)). Det rene produkt ble omkrystallisert fra metanol
Tittelforbindelsen (Z) -4 -. ((9-etyl-9H-karbazol-3-yl) amino) pent-3-en-2-on (ECAP ) ble fremstilt med godt utbytte av to-komponent-reaksjonsblandingen under indiumklorid som promotor struktur av den fremstilte forbindelsen (figur 1). Strukturen av den tilberedte forbindelsen ble deretter studert og karakterisert ved hjelp av infrarød (IR), Hydrogen-1 (
1 H) og karbon-13 (
13C NMR) spektroskopiske teknikker.
Extraction av perifert blod mononukleære celler
perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra heparinisert fullblod ved tetthetsgradient sentrifugering. Like volumer av blod og Histopaque 1077 (Sigma, Tyskland) ble alikvotert inn i 15ml koniske rør og sentrifugert (400 g, 30 min). Buffy coat-lag som inneholder den PBMC ble aspirert og vasket to ganger med 0,1 M fosfat-saltvannsbuffer (PBS; 400 g, 10 min).
Tissue cellekultur
A549-celler ble dyrket i henhold til en tidligere beskrevne metoden [18]. I sammendrag A549-celler ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2 i Eagles minimum essensielt medium (EMEM) supplert med 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin-Fungizone og 10% føtalt kalveserum. Cellevekst ble overvåket og cellekulturmedium (CCM) ble endret etter behov. Konfluente kolber ble trypsinert og trypanblått ble brukt for celle numeration. PBMC erholdt fra en mannlig donor ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2 i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) supplementert med 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin-Fungizone og 10% føtalt kalveserum .
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble gjennomført som tidligere beskrevet [18], med liten endring. Metyl- tiazol-tetrazolium (MTT) assay ble anvendt for å bestemme cytotoksisiteten til ECAP på PBMC og A549 lungekreftceller. PBMC og A549-celler (20 000 celler /brønn) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,6, 0,7 og 0,8 ug /ml) av ECAP og inkubert i en 96-brønns mikrotiterplate i triplikat ved 37 ° C, 5% CO
2 i 24 timer. Celler inkubert med 1% DMSO ble anvendt som bærerkontroll (V kontroll) og ellipiticin ved konsentrasjoner (0, 0,01, 0,025, 0,050, 0,10, 0,25, 0,6 og 0,8 ug /ml) ble anvendt som en positiv kontroll. Etter 24 timers inkubering, ble CCM /MTT saltoppløsning (5 mg /ml) tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Supernatanten ble deretter fjernet, og 100 ul /brønn dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt etterfulgt av inkubasjon (1 time). Absorbansen av det produserte formazan ble målt ved 570 nm og referansebølgelengde på 690 nm ved anvendelse av en Bio-Tek μQuant spektrofotometer. GraphPad Prism V5.0 programvare ble brukt til å plotte en konsentrasjon-responskurve som deretter ble anvendt for å bestemme en IC
50 verdi av ECAP på PBMC og A549-celler.
lipidperoksidasjon assay for kvantifisering av malondialdehyd ( MDA)
tiobarbitursyre assay (TBARS) ble anvendt for å måle evnen til å generere ECAP ROS. Supernatanten av styre, V kontroll og ECAP behandlede celler ble overført til reagensglass med 2% H
3PO
4 (200 ul), TBA /BHT-løsning (400 ul) og 7% H
3PO
4. En positiv kontroll på 1% MDA og en negativ kontroll av 3 mM HCl (400 ul) ble anvendt. Eksempel pH ble kontrollert (pH 1,5) og oppvarmet ved 100 ° C i 15 min. Prøvene ble tillatt å avkjøles til romtemperatur (RT), etterfulgt av tilsetning av 1,5 ml butanol, vortex-blandet og fikk så separere i distinkte faser. Den øvre butanol fase ble porsjonert ut i 96-brønners mikrotiterplate i triplikater. Den optiske tetthet ble målt ved 532 nm med referanse bølgelengde på 600 nm. Den midlere optiske tetthet ble beregnet for hver prøve og dividert med absorpsjonskoeffisienten til 156 mM
-1 for å oppnå MDA konsentrasjon (uM) per behandling.
DNA skade
komet assay ble anvendt som tidligere beskrevet [18], med ubetydelig modifikasjon for å bestemme DNA-skade. De tre behandlinger (kontroll, V kontroll- og ECAP) ble fremstilt henholdsvis etterfulgt av fjerning av supernatanten, og deretter trypsinert. To lysbilder per prøve ble fremstilt som følger; det første laget av 700 pl 2% lavt smeltepunkt agarose (LMPA, 37 ° C), andre lag av celler (25 pl), 1% LMPA (175 ul, 37 ° C) og gel-rød (1,5 ul), og det tredje lag av 1% LMPA (250 ul, 37 ° C), og deretter dekket med mikroskop-dekkglass. Etter stivning ble det glir neddykket i kaldt lyserende oppløsning [2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 M Tris, 10% DMSO] og inkubert ved 4 ° C i 1 time. Etter lysis, ble platene plassert i elektroforese-buffer [300 mM NaOH, 1 mM Na
2EDTA (pH 13)] i 20 minutter, og deretter elektroforese ble kjørt ved 25 V i 35 minutter. Etter elektroforese, ble objektglass vasket tre ganger i 5 minutter med nøytraliserende buffer [0,4 M tris (pH 7,4)]. Slides ble deretter sett på med et fluorescerende mikroskop (Olympus IXSI invertert mikroskop med 590 nm emisjonsfiltre og 510-560 nm eksitasjon). For hvert bilde, ble 50 celler fanget og deres komet hale lengder ble målt i mikrometer ved hjelp av Soft Imaging System (Life Science-Olympus Soft Imaging Solution v5).
Western blot analyse
protein uttrykk av p53, ble Bax, BCL-2, Nrf2, SOD og Hsp70 i A549 celler bestemmes ved hjelp av western blot. Proteiner ble isolert fra A549 celler ved hjelp Cytobuster reagent supplert med fosfat-hemmer (Roche, kat. Nr. 04906837001) og proteasehemmer (Roche, kat. Nr. 05892791001). Bicinchoninic syre analyse (Sigma, Tyskland) ble brukt for protein kvantifisering. Proteiner ble standardisert til en konsentrasjon på 3,966 mg /ml. Prøvene ble deretter fremstilt i en Laemmli buffer, kokt i 5 minutter ved 100 ° C og underkastet elektroforese ved 150 V i 1 time i 7,5% natriumdodecylsulfat polyakrylamid (SDS-PAGE) ved bruk av Bio-Rad kompakt strømforsyning. Trans-Blot Turbo overføringssystem ble brukt til å overføre de separerte proteiner til nitrocellulosemembraner ved 20 V i 45 minutter. 3% BSA i Tris-bufret saltvann [(TTBS) -NaCl, KCl, Tris, dH
2o, Tween 20, pH 7.4)] inneholdende 0,5% Tween 20 ble brukt til å blokkere membraner i 1 time, etterfulgt av en over natten inkubasjon med primære antistoffer [p53 (2521P), Nrf2 (8882), SOD (4266), Hsp70 (BD 610 607) og BCL-2 (3869); 1: 5000], 5 x vask med TTBS, 1 timers inkubasjon med sekundære antistoffer (anti-mus: ab97046, 1: 10000) ved romtemperatur og 5 x vask med TTBS (10 min hver). β-actin (ab8226; 1: 5000) ble brukt for protein normalisering. En 50:50 (v /v) av klarhet Western luminal /enhancer-løsning og peroksyd-løsningen ble tilsatt til hvert elektro-blottet nitrocellulosemembranen for å danne antigen-antistoff-komplekset. Den genererte signalet ble oppdaget ved hjelp Alliansen 2,7 bildedokumentasjonssystem (UViTech). Protein uttrykket ble deretter analysert ved hjelp UViBand avansert bildeanalyse programvare v12.14 (UViTech). Dataene ble uttrykt som ganger endring (FC).
Caspase-3/7, 8, 9 og ATP aktiviteter
Tidsavhengige luminescens-baserte analyser (6 timer og 24 timer) ble benyttet å vurdere virksomheten til caspase-Glo 3/7, 8, 9 og ATP. Etter behandling med ECAP (6 timer og 24 timer), ble A549-cellene trypsinert, justert til 20000 celler /brønn, etterfulgt av sentrifugering ved 3000 g x (5 min, RT). Supernatanten ble fjernet; cellene ble deretter resuspendert i 50 mL PBS /brønn for hver behandling og deretter sådd ut i en ugjennomsiktig polystyren 96-brønners mikrotiterplate i seks replikater. Produsentens retningslinjer ble brukt til å forberede caspase-Glo 3/7, 8, 9 og ATP reagenser (Promega). Rundt 100 pl reagens ble tilsatt i bestemte brønner, og deretter inkubert i mørke (30 min, RT). Den Modulus mikro luminometer ble anvendt for den etterfølgende måling av luminescens, og de oppnådde data ble uttrykt som RLU.
Annexin-V-Fluos assay
Annexin flekk-analyse ble utført som tidligere beskrevet [19 ], med liten endring. Phosphatidylserine (PS) trans ble bestemt ved bruk annexin-V-Fluos apoptose deteksjon kit (Roche). Til hver 100 pl A549 cellesuspensjonen, 100 ul av Annexin flekker buffer og 100 ul av Annexin-V-Fluos merking oppløsning (annexin-V: propidiumjodid: annexin flekker buffer (1: 1: 50 vol /vol /vol)) var tilsatt i 1,5 ml rør. BD Accuri flowcytometeret ble brukt til å fange opp data fra fargede celler. Celler ble analysert ved hjelp av Accuri C6 gating og CFLOW Plus v1.0 analyse programvare. For hver prøve 50.000 hendelser ble analysert in triplo. Resultatene er presentert som prosentandel av apoptose der cellene positive for Annexin-V (FITC) i nedre høyre kvadrant (tidlig apoptose) og øvre høyre kvadrant (sent apoptose) ble inngjerdet.
Statistisk analyse
GraphPad Prism v5.0 programvare (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA) ble brukt for statistisk analyse. For alle forsøk ble de oppnådde resultatene av de tre paralleller representert som menes med standardavvik (SD). Den statistiske signifikans av resultatene ble analysert med uparede
t
-test og en 95% konfidensintervall. Verdiene av
p . 0
05
ble deretter vurdert som statistisk signifikant
Resultater
Syntese av (Z) -4 -. ((9-etyl-9H-karbazol-3 -yl) amino) pent-3-en-2-on
Det resulterende produkt var et gult, fast stoff fremstilt i 94% utbytte; smeltepunkt (smp): 240-247 ° C. Funksjonelle grupper ble forutsagt ved hjelp av IR (KBr, cm
-1): 1774,97 (C = O), 3043,92 (N-H), 2988,76 (C-H) Alkaner, 1562,66 (C = C) Aromatiske ringer (figur 2A). Den
1H-NMR (400 MHz, CDCh
3) ble anvendt for å forutsi forholdet mellom hydrogen nummer: δ (ppm) 12,59 (s, 1H), 8,20 (q, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,45 til 7,40 (m, 2H), 7,35 til 7,30 (m, 3H), 5,3 (s, 1H), 4,35 (q, 2H), 2,25 (s, 3H) 1,95 (s, 3H), 1,45 ( t, 3H) (figur 2B). Den
13C-NMR (400 MHz, CDCh
3) ble videre brukt til å forutsi ryggraden av molekylet: δ (ppm) 195,67, 191,20, 161,94, 140,51, 138,18, 130,13, 126,39, 126,18, 123,93, 123,15, 122,47, 121,00, 120,52, 119,00, 117,65, 109,32, 108,72, 108,59, 96,60, 37,70, 29,08, 27,84, 19,80, 13,82, 13,72 (fig 2C).
(A) IR, (B)
1 H-NMR og (C)
13C-NMR spektrum.
Celleviabilitet analysen
MTT analysen ble benyttet for å bestemme den cytotoksiske effekten av ECAP på normal sunne PBMC og A549 lungekreftceller. Ellipiticin (en potent neoplastisk carbazol-derivat) ble anvendt som en positiv kontroll (figur 3), mens 1% DMSO ble anvendt som en bærerkontroll (S1 Fig). Basert på kjøretøyet kontrollresultater de (S1), og Fig de foregå DMSO cellelevedyktighetsresultatene [20], 1% DMSO har ikke indusere cytotoksisitet, derfor ECAP ble oppløst i 1% DMSO og brukes i alle etterfølgende behandlinger. Cytotoksisiteten data representerte et doseresponsforhold med hensyn til både ECAP og ellipiticin (figur 3).
(A) Virkning av (A) ECAP og (B) ellipiticin på cellelevedyktigheten av PBMC og A549-celler etter 24 h behandling. [N = 3 gjentak ved 95% konfidensintervall].
Bruke innhentet dose-responskurve, en IC
50 verdi på 1,99 mikrometer ved 95% konfidensintervall ble beregnet for ECAP behandlet A549 lungekreftceller (tabell 1) og deretter brukes i alle analyser. Videre ECAP viste ingen cytotoksisitet i normale, friske PBMC (det var ikke mulig å beregne IC
50 verdi for PBMC).
lipidperoksidasjon assay for kvantifisering av malondialdehyd (MDA)
lipidperoksidasjon, målt ved MDA-konsentrasjonen, var signifikant økt i ECAP behandlede celler sammenlignet med kontrollen (0,305 ± 0,00490 uM vs 0,190 ± 0,007479 uM (kontroll)) ved 95% sikker intervall (figur 4).
(p 0,0002) [*** betydning sammenlignet med kontrollgruppen, antall replikater: n ≥ 3]
DNA-skader
DNA skaden ble vurdert ved hjelp. kometen analysen. ECAP økt betydelig lengde komet haler i behandlede celler sammenlignet med kontrollgruppen med 81,80 ± 1,19 mikrometer vs 68,20 ± 1,61 mikrometer (kontroll) (figur 5).
(A) Kontroll og (B) ECAP behandlet A549 celler. (P 0,0001).
Western blot-analyse
Western blotting ble brukt for å bestemme apoptotiske proteiner indusert av ECAP i A549 lungekreftceller. Nrf2 /Keap1 system regulerer ekspresjon av proteiner som SOD og varmesjokkproteiner som er involvert i den cellulære antioksidant og anti-inflammatorisk forsvar [21]. En vesentlig reduksjon i ekspresjonen av Nrf2 (p 0,02 *), Hsp70 (p 0,02 *) og SOD (p 0,01 **) ble observert i ECAP behandlede celler sammenlignet med kontrollen (Fig 6, S2 Fig ). ECAP behandlede celle ytterligere viste en økning i ekspresjonen av pro-apoptotiske proteiner, slik som p53 (p 0,09) og Bax (p 0,25) og en reduksjon i ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl-2 (p 0,0006 ***) (figur 6, S2 figur).
(A) Bax, (B) Bcl-2, (C) p53, (D) Nrf2, (E) Hsp70 og (F) SOD.
Caspase-3/7, 8, 9 og ATP aktiviteter
Kaspaser er ATP-avhengige enzymer som fremmer apoptose. Den tidsavhengige effekt av ECAP på aktiviteten av kaspaser og ATP-nivåer ble målt i A549 lungekreftceller etter 6 timer og 24 timer inkubasjon (figur 7).
(A) Aktiviteten av Caspase-3/7 (6 t: p 0,4036, 24 timer: p 0,0003), (B) caspase-8 (6 t: p 0,4364, 24 timer: p 0,0001), (C) Caspase-9 (6 h: 0,4171, 24 timer: p 0,0124) og (D) ATP (6 H: 0,4011, 24 timer: 0,0011) nivåer i A549 lungekreft cellelinjen etter 6 timer og 24 timers inkubering. [* Angir statistisk signifikans i forhold til kontroll og usikkerheter representerer standard avvik (SD) fra anordningen. Antall replikater. N ≥ 3]
Annexin-V-Fluos analysen
Translokasjon av membranen fosfatidylserin (PS) er en av markører for de tidlige stadier av apoptose. Etter 24 timers behandling, ECAP signifikant induserte apoptose i A549 lungekreftceller (figur 8, 50,4 ± 0,44%)
[(p 0,0001)., *** Betydning sammenlignet med kontrollen, og antallet replikater .: n ≥ 3]
Diskusjoner
Den cytotoksiske aktivitet av carbazoles og noen av deres analoger er tidligere vist på ulike kreftcellelinjer inkludert lunge, leukemi og bukspyttkjertelen celler [22 -24]. Resultatene av denne studien viste evne til ECAP til å indusere cytotoksisitet på A549 lungekreftceller (figur 3) og det ikke noen cytotoksiske effekter på normale, friske humane PBMC (Fig 3). ECAP også vist et bredt spekter av apoptotiske egenskaper hos A459-celler som inneholdt DNA-fragmentering og PS translokasjon (figurene 5 og 8). I tillegg ECAP induserte endringer i protein ekspresjon i A549-celler ved å redusere Nrf2, SOD, Hsp70 og Bcl-2 og overekspresjon p53 og Bax (figur 6). En tidsavhengig økning i kaspase-aktivitet og en reduksjon i ATP-nivåer ble også observert i nærvær av ECAP. ECAP ytterligere indusert heving av lipidperoksidasjon i behandlede A549 lungekreft celler (figur 4).
Anticancer behandlinger som kjemoterapi og strålebehandling gjør bruk av ROS over å hemme spredning av kreftceller [25]. Western blot data viste en reduksjon i Nrf2 ekspresjon i ECAP behandlede A549-celler etter 24 timer inkubasjon (figur 6). Derav den observerte reduksjon i ekspresjonen av Nrf2 kan forklare de reduserte nivåer av ekspresjon av Hsp70 og SOD i A549 lungekreftceller (Fig 6). Nedregulering av antioksidant forsvarssystemer er ansvarlig for ROS høyde i kreftceller, så vel som en induksjon av kronisk oksydativ skade på biomolekyler så som DNA, proteiner og lipider [18, 26]. ECAP betydelig økt både lipidperoksidasjon i A549 lungekreftceller målt ved forhøyede MDA nivåer (fig 4) og DNA-skade (demonstrert av høyere intensitet og lengre lengder av komethaler) (figur 5).
Den observerte oksidative DNA-skader i kometmetoden kunne ha resultert i økt overekspresjon av serin 46 fosforylert p53 i ECAP behandlet A549 lungekreftceller (fig 6). Det har blitt rapportert at DNA-skade kan aktivere p53-protein-fosforylering ved serin 46 rest som resulterer i cellesyklus-stans og påfølgende DNA-reparasjon [27]. Western blot data videre demonstrert Bax aktivering og reduksjon i ekspresjon av Bcl-2 i nærvær av ECAP (figur 6). Dette tyder på DNA-skade var repareres, og økt p53-indusert celledød gjennom aktivering av pro-apoptotiske proteiner og reduksjon av anti-apoptotiske proteiner.
Bax aktivering induserer mitokondriell depolarisering og derved avbryte elektrontransportkjeden (ETC) og påvirker ATP-nivåer. Roy og medarbeidere (2005) demonstrerte mehanine, den karbazol alkaloid, for å depolarisere den mitokondriemembranen av U937-celler som resulterer i 60-40% reduksjon av cellulære ATP-nivåer sammenlignet med kontrollen. I tråd med denne observasjonen, ECAP induserte en signifikant 0,894 (24 timer) fold og en 0,497 (6 h) fold reduksjon i cellulære ATP-nivåer i A549 lungekreftceller sammenlignet med kontrollen (Fig 7). Dermed ECAP depolarized mitokondrie membraner av A549 lungekreftceller resulterer i cytokrom
c
meldingen og den påfølgende aktivering av caspase-9.
Den cytotoksisitet av ECAP i A549 lungekreftceller er assosiert med evnen til å indusere ROS overproduksjon, noe som resulterer i lipid-peroksydasjon og DNA-skade, og påfølgende aktivering av øket ekspresjon av tumor suppressor proteiner som p53. For å bekrefte apoptotisk handlingen i denne romanen carbazole forbindelse, ble luminometry brukt til å vurdere effekten av ECAP på aktiviteten til kaspaser. Aktiviteten av caspase-8 var 0,621 ganger etter 6 timer og 0,797 ganger etter 24 timer mindre i nærvær av ECAP sammenlignet med kontrollene (fig 7). Imidlertid ble en tidsavhengig økning i kaspase-9 aktiviteten til 0,497 ganger ved 6 timer og 1,17 ganger ved 24 timer etter ECAP i behandlede celler observert, sammenlignet med kontrollene (fig 7). Våre data er i overensstemmelse med en tidligere studie hvor mahanine ble rapportert å indusere apoptose gjennom en mitokondrieavhengig vei [16, 28]. ECAP fremkaller død hos A549 lungekreftceller gjennom den indre mitokondrie-reaksjonsvei ved aktivering av kaspase-9 (figur 7). ECAP også resultert i økt aktivitet av kaspase-3/7 (1,31 gangers endring (6 timer) og 1,50 ganger endring (24 timer) sammenlignet med kontrollene).
PS eksternalisering, en tidlig markør av apoptose, var signifikant høyere i ECAP behandlede celler sammenlignet med kontrollen, ytterligere å demonstrere dets potensielle anticancer-egenskaper. Dataene viser at den nye carbazol forbindelsen, ECAP, induserer cytotoksisitet og apoptose i A549 lungekreftceller. ECAP induserer apoptose i dyrkede lungekreftceller ved aktivering av caspase indre mitokondrie-mediert apoptose reaksjonsvei; aktivert caspase-9 vil aktivere bøddelen caspases-3/7 og resultere i nedstrøms spalting av proteiner som PARP.
Konklusjon
Undersøkelsen viste kreft egenskaper av ECAP å skyldes til dens evne til å indusere p53 mediert apoptose i lungekreftceller gjennom aktivering av oksidativt stress og reduksjon i ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner og antioksidantforsvar proteiner. Dette resulterte i DNA-skade og påfølgende økt uttrykk av pro-apoptotiske proteiner og apoptose bøddelens molekyler (fig 9).
Våre data viser at romanen karbazol forbindelsen (Z) -4- [9-etyl -9aH-karbazol-3-yl) amino] pent-3-en-2-on besitter potensielle farmasøytiske egenskaper som en alternativ behandling for lungekreft. Men siden dette var en
in vitro
studie, flere studier må gjøres for å ytterligere karakterisere denne nye forbindelsen og virkningsmekanismen i
in vivo
modeller. Fremtidig arbeid omfatter overvåking av effekten av metylering av ECAP på epigenetiske forandringer og dens effekt på histoner og mikroRNA uttrykk. DNA avslapping analyser vil bli brukt til å evaluere dens effekt på topoisomerase aktivitet i ulike kreft og ikke-kreft cellelinjer.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. . MTT analysen måles i ubehandlet (kontroll) og 1% DMSO (kjøretøykontroll) behandlet A549 celler
Dataene viste ingen signifikant cytotoksisitet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129874.s001 plakater (TIF)
S2 fig. Western blot som viser effekten av ECAP på uttrykk for Bax, Bcl-2, p53, Nrf2, Hsp70 og SOD
De opprinnelige vestlige blotter som ble brukt til western blot analyse (figur 6)
Doi:.. 10.1371 /journal.pone.0129874.s002 product: (TIF)
