Abstract
Bakgrunn
Det overordnede målet med prosjektet er å etablere en pasient-avledet blærekreft xenograft (PDX) plattform, merket med dyp sekvensering og pasient klinisk informasjon, for å akselerere utvikling av nye behandlingstilbud for pasienter med blærekreft. Heri beskriver vi skapelsen, innledende karakterisering og bruk av plattformen for dette formålet.
Metoder og funn
Tjueto PDXs med annotert kliniske opplysninger ble etablert fra ukultur uselekterte klinisk blærekreft eksemplarer i immunsvikt NSG mus. Den morfologiske troskap ble opprettholdt i PDXs. Hele exome sekvensering viste at PDXs og foreldrepasient kreft delt 92-97% av genetiske avvik, inkludert flere druggable mål. For narkotika gjenbruk, en EGFR /HER2 dual hemmer lapatinib var effektive i PDX BL0440 (progresjonsfri overlevelse eller PFS på 25,4 dager mot 18,4 dager i kontrollgruppen, p = 0,007), men ikke i PDX BL0269 (12 dager versus 13 dager i kontroll, p = 0,16) selv om begge uttrykt
HER2
. Til undersøkelse av de mest effektive MTT, evaluert vi tre medikamenter (lapatinib, ponatinib, og BEZ235) matchet med avvik i PDX BL0269; men bare en PIK3CA inhibitor BEZ235 var effektiv (p 0,0001). For å studere mekanismene for sekundær motstand, en fibroblast-vekstfaktor-reseptor-3-inhibitor BGJ398 forlenget PFS av PDX BL0293 fra 9,5 dager i kontrollgruppen 18,5 dager (p 0,0001), og serie biopsier viste at MAPK /ERK og PIK3CA-AKT trasé ble aktivert ved motstand. Inhibering av disse banene signifikant forlenget PFS fra 12 dag av kontrollen til 22 dager (p = 0,001). Å screene for effektive cellegifter, fire av de seks første PDXs var følsomme for cisplatin /gemcitabin kombinasjon, og chemoresistance til ett medikament kan bli overvunnet av andre rusmidler.
Konklusjon
PDX modellene er beskrevet her, viser god korrelasjon med pasienten på det genomiske nivå, og kjent for pasientens respons på behandlingen. Dette støtter ytterligere evaluering av PDXs for sin evne til å forutsi pasientens respons på nye og mer målrettede og kombinasjons strategier for blærekreft
Citation. Pan Cx, Zhang H, Tepper CG, Lin Ty, Davis RR, Keck J, et al. (2015) Utvikling og karakterisering av blærekreft Pasient Avledet xenografter for molekylært Guided Målrettet terapi. PLoS ONE 10 (8): e0134346. doi: 10,1371 /journal.pone.0134346
Redaktør: Chandan Kumar-Sinha, University of Michigan, USA
mottatt: 20 januar 2015; Godkjent: 08.07.2015; Publisert: 13 august 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet: Informasjon om alle blærekreft PDX-modeller er tilgjengelige fra JAX PDX portal arrangert av Mouse Tumor biologi (MTB) database (http : //tumor.informatics.jax.org/mtbwi/pdxSearch.do)
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av: Veteran Administration Career Development Award (PI:. Pan); Veteran Administration Merit (PI: Pan; Grant #: 1I01BA001784); NCI Cancer Center Support Grant (PI: de Vere Hvit, Grant #: 2 P30 CA 0933730); Den Laney Foundation (PI: de Vere White). Ingen finansierende organer hatt noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Blærekreft er blant de ti mest vanlige [1], men den mest studerte og underfinansierte, kreft [2]. Det er to hovedgrupper av blærekreft: non-myoinvasive og avansert kreft. Non-myoinvasive blærekreft (NMIBC) står for 80% av tilfellene ved diagnose. De blir vanligvis behandlet med transuretral reseksjon og, i de fleste tilfeller, intravesikal terapi. Men omtrent 60% av pasientene går igjen i to år, og 25% fremgang for avanserte stadier [3-5]. Det er de 20% tilfeller med avanserte stadier på diagnose og 25% av NMIBC saker som utviklet seg til avanserte stadier som står for den høye dødeligheten av blærekreft. Meget giftig platina-basert kjemoterapi er vanligvis brukes i behandling av avansert blærekreft med en svarprosent på rundt 50% [6]. Selv om cellelinjer blir ofte brukt for prekliniske studier korrelasjonen av medikamentsensitivitet mellom cellelinjer og kliniske studier er generelt dårlig [7]. Så langt er ingen test tilgjengelig for å identifisere effektive kjemoterapi før administrering av behandlingen. Hvis pasienten er diagnostisert med lokalavansert blærekreft uten metastaser, er radikal cystektomi utføres vanligvis som er knyttet til den verste helserelatert livskvalitet på grunn av operasjonen selv og tilhørende postoperative komplikasjoner [8,9]. I tilfelle av tilbakevendende sykdom eller prognose, er det ingen standard andre kjemoterapi. Det er ingen målrettet terapi godkjent av US Food and Drug Administration (FDA), selv om tilbakevendende genetiske avvik er identifisert. Det er ingen vesentlig forbedring i total overlevelse og prognose i løpet av de siste tretti årene [10]. Derfor er det et viktig udekket behov i blærekreft å velge effektiv førstelinje og berge kjemoterapi, og utvikle målrettet terapi.
Dette prosjektet er å utvikle pasient avledet xenografter (PDXs) for å bedre behandlingsresultatene av blæren kreft. Mange dyremodeller er for tiden brukes i kreftforskning, som for eksempel muse xenografter utviklet fra kreft cellelinjer og genmanipulerte musemodeller (GEMM). Selv om disse modellene har gjort fantastiske bidrag til kreftforskning, de bommer i møte den enkelte pasient-spesifikke behov i tid med presisjon medisin. Den siste utviklingen i og konvergens av kreft biologi, «-omics» teknologier, bioinformatikk og narkotika utvikling revolusjonerer målrettet terapi og fører til et nytt nivå av «molekylært guidet målrettet terapi (MTT)», som betyr målrettet målrettet behandling med pasient-spesifikke genetiske avvik i kreft. Men to siste kliniske studier viste at matchende MTT mot pasientspesifikke genetiske avvik var assosiert med skuffende responsrate på 12% og 9% henholdsvis [11,12]. Den lave svarprosent på MTT er delvis tilskrives det faktum at de fleste kreftformer multiple genetiske avvik [13-16], og at dagens databiologi teknologiene er ikke i stand til robust skille driver mutasjoner (de kritiske for kreft celle funksjoner) fra passasjer mutasjoner (de som har lite funksjonell betydning for kreftceller). Vi foreslo at pasientspesifikk PDX plattform utviklet her kan ikke bare potensielt brukes til skjermen for den mest effektive MTT å målrette de molekylære drivere og effektiv førstelinje og berge kjemoterapi, men også for narkotika fornyer og studere sekundære resistensmekanismer å veilede videre personlig terapi og narkotika utvikling.
Metoder
utvikling av pasient avledet blærekreft xenografter
protokollen for å samle kliniske informasjonssystemer og kreftprøver fra pasienter ble godkjent av University of California Davis Institutional Review Board (protokoll nr 218204). Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke før deltakelse i denne studien, og før noen prøver eller kliniske opplysninger ble samlet inn. Dyret protokollen ble godkjent av Jackson Laboratory (JAX) Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, Protokoll nr 12027) og UC Davis IACUC (Protokoll nr 17794).
Ferske kliniske kreftprøver (3 -5mm
3) ble implantert subkutant i flankene av 4-5 uker gamle NOD.Cg-
Prkdc
SCID
Il2rg
tm1Wjl Twitter /SzJ (aka, NSG) mus. For hver pasientprøve ble fem NSG mus implantert og overvåkes for tumorvekst i opp til fem måneder. En orthotopic PDX modellen ble generert via injeksjon av enkeltcellesuspensjon fra subkutane PDXs i musen blæreveggen.
RNA isolering
Hematoxylin og eosin flekken ble utført og lysbildene ble anmeldt for å sikre at minst 85-90% av cellene var i kreftceller før prøvesamling. Total cellulær RNA ble isolert fra enten fersk frosne xenograft tumor stykker ved hjelp av TRIzol Plus RNA Purification Kit (Life Technologies) eller fra formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) prøver (8 x 12-mikrometer seksjoner) med miRNeasy FFPE Kit (Qiagen), i henhold til produsentens protokoller. Totalt RNA ble eluert fra kolonnene i nuklease-fri vann og lagret ved -80 ° C. RNA konsentrasjon og renhet ble vurdert med en Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific) og kvalitetsvurderinger (
e
.
g
., RNA integritet) ble gjort ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) . For miRNA uttrykket profilering, ble totalt cellulært RNA (inkludert små RNA fraksjon) isolert fra FFPE- blærekreft prøver ved hjelp av miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll.
DNA
DNA ble isolert fra fersk frosset eller FFPE pasient tumor og xenograft prøver (5 x 20-um seksjoner) med standard QIAamp DNA eller QIAamp DNA FFPE- Tissue Kits (Qiagen).
transkriptomet profilering av RNA-sekvensering (RNA -Seq)
RNA-Seq bibliotek forberedelse og sekvensering.
transkriptomet profilering av P0 (passasje 0) blærekreft xenografttumorer ble utført av RNA-Seq analyse. RNA-sekvensering (RNA-Seq) bibliotekene ble fremstilt fra en mikrogram total RNA bruker TruSeq RNA Prøvepreparering v2 Kit (Illumina, San Diego, CA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble polyadenylert mRNA ble renset fra total-RNA og ribosomalt RNA ble fjernet ved to runder med binding til magnetiske oligo-dT-kulene etterfulgt av RNA fragmentering, eluering, og priming av inkubering ved 94 ° C i 8 minutter. Dobbeltkjedet cDNA ble deretter generert ved random-primet første-tråd-syntese med Superscript II revers transkriptase og påfølgende syntese av annenkjede med RNase H og DNA-polymerase I. cDNA ble gjort buttendet med T4 og Klenow DNA-polymeraser for å fjerne 3′- -overhangs og fyll i 5′-overheng, fosforylerte med T4 PNK, og deretter 3′-A tailed ved inkubasjon med Klenow fragment (3 «→ 5» exo-) og dATP. Illumina parvise end (PE), ble indeksert adaptere så bundet, etterfulgt av rensing med AMPure XP perler. Biblioteket ble så beriket av high-fidelity PCR forsterkning (15 sykluser) og adapter-spesifikke primere. Den molare konsentrasjon av bibliotekene ble bestemt ved å måle konsentrasjonen med en qubit fluorometer (Invitrogen), bestemmelse av innsatsen lengde med et Agilent 2100 Bioanalyzer, og deretter qPCR-baserte kvantifisering (KAPA Library Kvantifisering Kit). Bibliotekene ble sendt til New York Genome Senter for 100 bp parvise end, multiplex sequencing på et HiSeq 2000 sekvenseringssystem (8 bibliotekene per kjørefelt, 2 baner).
RNA-Seq dataanalyse
.
Bildebehandling, basen ringer, kvalitet scoring (Phred), og prøve demultiplexing ble henrettet av HiSeq Control Software med real Time Analysis (HCS 1,5 /RTA 1.13) og casava 1.8 programvare (Illumina, San Diego, California). Analyse av RNA-Seq data ble utført ved hjelp av en standard Hat-mansjettknapper arbeidsflyt [17]. Sequence leser (FASTQ format) ble klassifisert som menneske (graft) eller mus (host) bruker Xenome [18] og senere justert til referanse menneskelige genom enheten (februar 2009, GRCh37 /hg19) med Hat, noe som åpner for maksimalt to uoverensstemmelser; Hat benytter Bowtie aligner [19], og inkluderer et verktøy for kartlegging spleise veikryss [20] for RNA-Seq lese justering til referanse menneskelige genom sekvens (GRCh37 /hg19). Gen- og karakternivå uttrykk ble grundig kvantifisert med mansjettknapper programvare [21] for
1)
avskrift montering,
2)
identifisering av spleisevarianter, og 3) kvantifisering av normalisert uttrykk som FPKM (fragmenter per kilobase av karakterutskrift per million kartlagt leser) verdier.
hel-exome sekvensering (WES)
Utarbeidelse av hele exome-fangst sekvense biblioteker og sekvensering.
DNA prøvene ble preparert for hel-exome sekvensering på Illumina plattformen anvendelse av atVelg
XT Target Enrichment System (Agilent) i forbindelse med den atVelg
XT Humant All Exon V4 + UTR fange bibliotek. Dette ble utført i henhold til produsentens protokoller og fortsatte i 3 generelle trinnene begynner med DNA-fragmentering, etterfulgt av bibliotek forberedelse og målrettet berikelse for alle eksoner og uoversatt regioner (UTR). Med høy molekylvekt-DNA (3 ug) ble skåret i fragmenter av gjennomsnittlig maksimal størrelse på 150-200 bp ved hjelp av en Covaris S220 fokusert-ultrasonicator og deretter renset ved hjelp av Agencourt AMPure XP magnetiske kuler. Standard protokoller ble benyttet for adapter ligering, indeksering high-fidelity PCR forsterkning. Deretter ble exome berikelse utført av hybrid-fangst med All Exon v4 + UTR fangst bibliotek (789141 biotinylert, ultra-lange RNA oligomertynnfilmer agn) for å fange opp de målrettede sekvenser som spenner over 71Mb av genomet og omfatter over 20,965 gener og 334,378 eksoner. Capture bibliotekene ble forsterket, sammenslåtte, og sendt til New York Genome Senter for 100 bp parvise end, multiplex sekvense på en HiSeq 2000 sekvenseringssystem (4 bibliotekene per kjørefelt).
WES dataanalyse.
Sekundær analyse av WES data besto av lese justering til referansegenomsekvens (GRCh37 /hg19) ved hjelp av Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [22] og påføring av Genome Analysis Toolkit (GATK) [23] for basen kvalitetspoeng rekalibrering, Indel omstilling, duplikat fjerning, og utfører SNV og Indel oppdagelse og genotyping på tvers av alle prøver samtidig ved hjelp av standard hard filtrering parametere eller variant kvaliteten score rekalibrering [24]. Før justering, leser var feil trimmet før forekomsten av en lav kvalitet base (Phred scorer ≤20). I tillegg, for analyse av WES data utledet fra xenograft vev, så vel som pasienttumordata som brukes i sammenligninger, ble Xenome anvendt for human /mus lese klassifisering og bestemmelse av nivåer av musegenomisk forurensning [18]. Resultatstatistikk for neste generasjons sekvensering og påfølgende analyser, inkludert totale antallet leser, prosent kartlegging og menneskelige /mus lese klassifisering, er inkludert i S1 tabell og S2 Table.
Etter påføring av GATK, varianter ble filtrert for de som har bekreftet somatisk mutasjon status og /eller blitt identifisert som en somatisk mutasjon i minst ett tumor ved hjelp av komplett Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) og Kreft Genome Atlas (TCGA) databaser. For ytterligere å definere sannsynligheten for en tidligere bekreftet somatisk variant som en somatiske avvik i disse PDX-tumorer, ble et ekstra filter pålagt for å selektere for variant allel fraksjoner i området fra 10-40% eller 60-90%, og dermed tyder tilstedeværelsen av tumor heterogenitet og at varianten er avledet fra en tumor sub-populasjon. Langs disse linjene, flere varianter med «inferred somatisk» status oppfylte disse kriteriene, og ble også inkludert i resultatene. Selv om disse ikke samsvarer med en eksakt match i COSMIC eller TCGA ble filtrering utført med Oppfinnsomhet Variant Analysis (Qiagen, Inc.) til
1)
utelukke varianter som er forbundet med normal menneskelig genetisk variasjon identifisert fra stor- skala sekvense prosjekter, inkludert 1000 genomer Project, Complete Genomics Public genomer, NHLBI GO Exome Sequencing Project (ESP), og dbSNP, og 2) å identifisere «non-dbSNP» varianter med mellom allelfrekvenser som vil være karakteristisk for varianter presentere i en heterogen tumor i stedet for i germline.
Effekt studie
Denne protokollen ble godkjent av UC Davis Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, Protocol # 17794) før studiestart innvielse. Alle dyrestudier fulgt IACUC retningslinjer. Kvinne NSG mus i en alder av 4-5 uker ble bestilt fra JAX, og fikk minst en uke for å akklimatisere seg til de nye omgivelsene før vi går i studien. Å etablere flere PDXs å tillate effektstudier med flere medikamenter, ble PDXs fra Passage 2-4 hakket inn 3-5 mm
3 og injisert i flere mus enten subkutant på flanken eller orthotopically inn i muskulære laget i blæreveggen. Når subkutane tumorstørrelser nådde ~ 200 mm
3, ble musene behandlet med målrettede terapeutiske midler samsvarte med de genetiske endringer som er identifisert gjennom dyp-sekvensering som beskrevet ovenfor (fig S1). De følgende stoffer ble anvendt i denne studien: sEphB4-HSA ble utviklet gjennom konjugering av oppløselig EphB4 til humant serumalbumin. Det ble levert av Parkash Gill, MD, ved University of South California. Andre legemidler, samt BGJ398 og BEZ235, ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, TX). For hver behandlingsgruppe, ble 8-10 mus brukt til å tillate statistisk analyse. Musene ble overvåket for tumorvekst og forandringer i kliniske parametre, slik som vektendringer, avfallseliminering, frakk tekstur, farge, urin flekker, skorpedannelse rundt øynene, aktivitetsnivå, og holdning. Mus ble avlivet når tumorstørrelsen nådde fem ganger utgangsstørrelse (ca. 1000 mm
3). Flere mus ble avlivet før startet behandling eller under behandlingen for å bestemme nedstrømssignalveien aktiviteter ved bruk av Western blot, immunhistokjemisk farging, eller immunofluorescens farging. Mus ble avlivet ved pentobarbital overdose (180 mg /kg) eller pentobarbital overdose (60 mg /kg) etterfulgt av cervikal dislokasjon.
Statistisk analyse
Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. Statistisk analyse ble utført ved hjelp GraphPad InStatTM programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, California) og ANOVA (variansanalyse) ble utført for å sammenligne forskjellene i de tre behandlingsgruppene. Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil med mindre annet er angitt. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Etablering av pasient avledet xenografter (PDX) fra urothelial karsinom
Til dags dato har vi etablert 22 PDXs fra. pasienter med blærekreft, som representerer 41% av tumorene implantert. Blant disse 22 PDXs ble 13 PDXs avledet fra avansert blærekreft, og 9 PDXs fra NMIBC. De kliniske egenskaper er vist i tabell 1. Median alder for donor pasientene var 74 år (range: 54-83). Fem av de 13 PDXs avledet fra avansert blærekreft tidligere fått neoadjuvant kjemoterapi før implantasjon mens ingen av de NMIBC gjorde det.
Tjueto PDXs ble utviklet, inkludert 13 fra avansert blærekreft og 9 fra ikke-myoinvasive blærekreft .
Morfologisk troskap mellom pasient svulster og tilsvarende xenografter
Vi sammen morfologi av pasientens blære svulster og tilsvarende PDXs på ulike passasjer. Den morfologiske troskap ble opprettholdt fra pasient vevsprøver gjennom passasjen 6 (fig 1A). Morfologi av subkutane og ortotopiske blærekreft PDXs ble også opprettholdt (fig 1A høyre panel). Kreftceller i PDXs ble farget positivt med et anti-human Ki67 antistoff, som bekrefter at kreftcellene i PDXs var faktisk av human opprinnelse. Over 90% av PDX blærekreftceller uttrykt Ki67, en markør for celleproliferering (figur 1B). I samsvar med dette funnet, PDX tumorvolumet dobling tid var mellom 10-20 dager. Selv om PDXs ble utviklet fra inokulering av kliniske prøver som inkluderte bære humane stromale celler, ble det ikke stromale celler i PDXs farget positivt med et anti-humant vimentin-antistoff, hvilket antyder at de stromale celler i PDXs var av mus opprinnelse (figur 1C). Dette er ytterligere validert av observasjon av varierende grad av mus-avledet sekvens leser stede i neste generasjons sekvensering (NGS) data (S2 tabell). Noen humane blærecancerceller og stromale celler i kliniske prøver kreft, samt kreftceller i PDXs, ble farget positivt for human vimentin. Ettersom disse NSG mus ikke har noen art killer (NK) celler, T- og B-lymfocytter, ikke lymfocytter, med morfologi, ble observert i PDXs.
(A) sammenligning av morfologien mellom pasientprøver og PDXs, subkutan og ortotopiske PDXs, av PDX BL0293 og BL0440. Hematoxylin og eosin farging (H 0,5 og deretter sammenlignet mellom prøver på grunnlag av variant typer. Antallet og typen av varianter som forekommer i hver foreldre tumor og i den P0 PDX tumor ble kvantifisert og vist som prosent av bevaring i diagrammet. For alle varianter, ble 91,8% og 97,6% konservert i henholdsvis BL0429 og BL0440,.
Analyse av kjente funksjonelt aktive gener og betydelig muterte gener
Vi neste vurdert mutasjonsstatus av kjente funksjonelt aktive gener og betydelig muterte gener tidligere identifisert fra stor-skala, analyser multisenter av blærekreft [15,25-27], hvorav mange har vist roller i tumor undertrykkelse, kromatin /kromosom dynamikk, transkripsjonsregulering, og signal transduksjon. Siden passet normale vev ikke ble inkludert i denne studien, ble analyser primært rettet mot identifisering av varianter som tidligere har bekreftet somatiske status i en eller flere kreftformer i henhold til den kosmiske og /eller TCGA databaser. For de 236 genene vurderes, totalt 71 ikke-synonyme enkelt nukleotid varianter (SNVs) fører til missense eller nonsense mutasjoner ble identifisert i 51 forskjellige gener, med varierende alternative allel fraksjoner som spenner 0,160 til 0,982 (fig 3, S3 Tabell og S4 Bord). Mens 15 gener ble funnet som skal endres i to eller flere svulster, bare 5 mutasjoner oppsto i mer enn en svulst modell (
ADCY2
p.V147L,
ErbB2
p.I655V,
NCF2
p.H308Q,
SYNE1
p.L885V, og
ZNF814
p.158V). De fleste PDXs inneholdt 3-10 somatiske mutasjoner i (3-10) gener, med unntak av PDXs BL0269 og BL0293 som hadde 13 mutasjoner som hver på 11 og 13 forskjellige gener, respektivt. Spesielt ble mutasjoner i funksjonelt aktive gener identifisert i hvert PDX, inkludert
ARID1A
,
ATM
,
CASP8
,
CDH1
,
KALRN
,
KMT2C
,
NCF2
,
mTOR
,
PIK3CA
,
TSC1
, og
TP53
; 6-10 mutasjoner i blærekreft driver gener ble funnet i fem av åtte modeller (S4 Table). Integrering av RNA-Seq data med disse resultatene antydet at av de 71 mutasjonene funnet, var det ca 29 «uttrykt» mutasjoner i 20 gener (
e
.
g
.,
ARID1A
,
CASP8
,
KLF5
,
MLH1
,
NOTCH1
,
PIK3CA
, og
SYNE2
) som oversteg cut-off med lav /moderat transkripsjon overflod (
i
.
e
., ≥10 FPKM eller fragmenter per kilobase av exon per million fragmenter kartlagt) (S5 Tabell).
WES ble utført på P0 svulster fra hver PDX modell. Deretter ble GATK benyttet for variant deteksjon og funksjonell annotering. Resultatene ble filtrert for somatiske mutasjoner som forekommer i en samlet oversikt over 130 kjente blærekreft funksjonelt aktive gener [27] og betydelig muterte gener [15,25,26]; disse er angitt i høyre sidepanel som
BLCA Driver (IntOGen)
,
TCGA Betydelig Mutert
, eller
BGI Betydelig Mutert
. Somatiske mutasjoner ble funnet i 51 forskjellige gener (angitt langs den side av tabellen) (S3 og S4 Tabell Table). PDX modellnummeret er angitt over toppen av risten. Frekvenser (0,3-1,0) for hver mutant allel er angitt for hver variant, og representerte ved å øke fargeintensiteten.
mutasjonsanalyse av tumorsupressorproteinene trasé
Tre fjerdedeler av blærekreft PDXs inneholdt avvik i en eller flere av tumorsuppressorgener
TP53
,
RB1
, og
CDKN2A plakater (figur 4). Spesielt disse inkludert somatiske mutasjoner av
TP53 plakater (R248Q, R280T, E177 *, og E285K) og
RB1 plakater (R358X), og kopiere antall varianter av
RB1 product: ( i BL0293, BL0429, og BL0479) og
CDKN2A product: (i BL0269, BL0382, BL0429, og BL0479). De fleste av de TP53 somatiske mutasjoner var heterozygote (allel frekvens = 0,5), med unntak av R280T i BL0479 og E177X avkorting mutasjon i BL0382, den sistnevnte ble også ledsaget av en markert reduksjon av
TP53
transkripsjonsnivåer (Fig 4A og 4B). En tilsvarende nedgang i
MDM2
uttrykk ble observert i BL0293 og BL0479 svulster som inneholder R248Q og R280T mutasjoner i
TP53
hhv. Kopier nummer tap eller slettinger, som forekommer på
RB1 Hotell og
CDKN2A
loci, ble validert ved sammenligning med RNA-Seq data som viser en nesten fullstendig fravær av uttrykk i de fleste tilfeller.
(A) Integrert analyse av
mRNA uttrykk
,
Mutasjoner
, og
Kopier nummer
ble utført for gener i
TP53 Hotell og
RB1
tumor suppressor veier. Gen-ekspresjon (FPKM) verdier for spredningsveier medlems gener er presentert og relativ genekspresjon for hvert gen på tvers av panelet av PDX-modeller er angitt med heatmap (grønn = lavere enn medianen, rød = større enn median). Mutasjoner (aminosyre endringer) i
TP53
og
RB1
indikeres. Gene kopiantall presenteres, og varianter angitt som tap (
i
e
, .. 2) eller gevinst (
i
e
, . 2) som er vist ved mørkere nyanser av rødt og grønt, respektive. (B) uttrykk nivåer (FPKM) av tumor suppressor pathway gener i hver PDX er vist i søylediagram.
transkriptomet profilering av PDX svulster
Utover de 20 muterte gener som var funnet å ha i det minste et minimalt nivå av ekspresjon (
over
), videre evaluering av gen-ekspresjon for hele konsolidert liste over 236 blærekreft funksjonelt aktive og betydelig muterte gener viste at 85 til 104 av disse hadde moderat til svært høye nivåer av ekspresjon (FPKM = 15-2,417) i minst ett PDX (figur A i figur S2, S6 tabell). I tillegg har flere stilt universelt høyt uttrykk i PDX-modeller, inkludert
AHNAK
,
BCL2L1
,
CDKN1A
,
CTNNB1
,
HRAS
,
RHOA
, og
YWHAZ
. Tilsvarende evaluering av 291 høy grad av tillit driver (HCD) gener er identifisert via pan-kreft-analyse av TCGA datasett [27], og ved bruk av de samme kriterier for analyse som beskrevet ovenfor, viste at 199 HCD-genene ble uttrykt i panelet (figur B i S2 figur, S7 tabell). Som en tilnærming til å definere stier som driver biologi PDX svulster, funksjonell annotering gruppering av de høyest uttrykte gener (≥50 FPKM) over panel PDXs ble utført ved hjelp av David ressurser bioinformatikk [28]. Dette avslørte involvering av flere grunnleggende cellulære trasé og deres molekylære komponenter, inkludert ubiquitin-proteasome vei, oversettings faktorer, og metabolske enzymer (glykolyse, glukoneogenese, oksidativ fosforylering). Spesielt, gener negativt regulerer apoptose ble også betydelig anriket (25 gener,
p
= 3,95 X 10
-06), for eksempel
DAD1
,
MCL1
,
SOD1
,
TPT1
, og YWHAZ, impliserer tilstedeværelsen av en generalisert overlevelse fordel.
PDX plattform for å veilede molekylært målrettet terapi
et hovedmål driver utviklingen av disse PDX modellene var å etablere en plattform for å bidra til å identifisere den riktige driveren mutasjon og dens matchet målrettet terapi. Basert på hele exome og transkriptom sekvense data, er det mange druggable mål med inhibitorer som er FDA-godkjent eller i kliniske studier (Fig 5A) (S7 Tabell, S8 Tabell og S9 tabell). Vi valgte en undergruppe av disse målene for å informere matchet terapi testing (S1 figur): fibroblast growth factor receptor 3 (
FGFR3
), Efrin type B reseptor 4 (
EphB4
), proto-onkogen tyrosin-proteinkinase
Src
, human epidermal vekstfaktor-reseptor -2 og 3 (
HER2 /3
) og fosfatidylinositol-4,5-bifosfat 3-kinase katalytisk subenhet alfa (
PIK3CA
).
