Abstract
En sikker og effektiv kreftmedisin er nødvendig på grunn av den økende bestanden av kreftpasienter med spesielle sykdommer kan ikke helbredes av tiden tilgjengelig behandling . Adenovirus (AD) vektorer representerer en lovende terapeutisk medisin for human kreftbehandling. Imidlertid er flere forbedringer som trengs for at annonsen vektorer å være effektive kreftbehandling, som inkluderer, men er ikke begrenset til, forbedring av cellulært opptak, økt kreftcelle drap aktivitet, og evnen til vektor visualisering og sporing når injiseres i pasienter . For å oppnå dette, forsøkte vi å utvikle en annonse som en multifunksjonsplattform som omfatter målretting, bildebehandling, og terapeutiske motiver. I denne studien vi utforsket nytten av denne foreslåtte plattformen ved å generere en Ad vektor inneholdende poly-lysin (pK), herpes simplex virus type 1 (HSV-1) tymidin-kinase (TK), og den monomere røde fluorescerende protein ( mRFP1) som målretting, tumor celledreping, og bildemotiver, henholdsvis. Vår studie viser her generering av trippel mosaikk Ad vektor med PK, HSV-1 TK, og mRFP1 på karboksyl termini av Ad mindre kapsidprotein IX (pix). I tillegg ble funksjonaliteten av pK, HSV-1 TK, og mRFP1 proteiner på Ad vektoren beholdt som bekreftes ved tilsvarende funksjonelle analyser, som indikerer potensialet multifunksjonelle anvendelsen av denne nye Ad vektor for kreft genterapi. Valideringen av trippel mosaikk Ad vektorer argumenterer også for muligheten av pix modifikasjon som en base for utvikling av multifunksjonelle Ad vektorer
Citation. Tang Y, Wu H, Ugai H, Matthews QL, Curiel DT ( 2009) Utledning av en Triple Mosaic Adenovirus for Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 4 (12): e8526. doi: 10,1371 /journal.pone.0008526
Redaktør: Maciej Lesniak, The University of Chicago, USA
mottatt: 04.10.2009; Godkjent: 07.12.2009; Publisert: 31.12.2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH bevilgning 5R01CA111569 (Dr. DT Curiel) og Juvenile Diabetes Research Foundation stipend 1-2005-71 (Dr. H. Wu). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er fortsatt den nest største dødsårsaken i verden, og sto for ca 7,9 millioner dødsfall (13% av alle dødsfall) i 2007 ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO, «de 10 dødsårsaker») . Genterapi representerer en ny paradigme i behandlingen av humane sykdommer ved innføring av genetisk materiale inn i individets celler for terapeutiske formål [1]. Blant alle behandlingsmetoder for kreft, representerer genterapi en roman molekylære tiltak som har potensial til anti-tumor effekt med selektivitet og sikkerhet [2].
Til dags dato, 65,2% av alle genterapi kliniske studier har målrettet kreft [3]. Blant en rekke kreftgenterapi strategier, men svært få av dem har vist en sterk terapeutisk virkning på humane pasienter. I tillegg til kompleksiteten og tvetydigheten i tumorgenese, andre hindringer som kan stå for svikt i mange kreftgenterapianvendelser er lav transduksjon effektiviteten av anti-kreftmidler, og den manglende evne til å omsette hele tumorcellepopulasjonen; dårlig selektivitet og mangel på langsiktig varighet av anticancermidler i tumorer fører til dårlig terapeutisk effektivitet og sikkerhet. Konseptet med å målrette tumorcelleadresser disse hindringene og kan representere en vesentlig forbedring i utviklingen av genterapi som et anti-cancer terapeutisk. Gitt effektiv målretting, kan det anti-cancer midlet ikke bare oppnå meget selektive og spesifikke tumorcelledrap, men også unngå opptak i normale celler og påfølgende toksisitet. En
in vivo
avbildningsfunksjonalitet, som gir et middel for å studere fordelingen (f.eks akkumulering, spredning, oppbevaring, og så videre) av anti-kreftbehandling, kan adresse sentrale problemstillinger som er grunnleggende for design og test av nye anti-kreft terapi, spesielt for replikative virusbasert legemiddelselskap [4] – [7]. Å kombinere disse funksjonene, og i et forsøk på å skape mer potente og pålitelige anti-kreftbehandling, vi forsøkte å skape et multifunksjonelt adenovirus (Ad) vektor for deteksjon og behandling av kreft. Denne annonsen inneholder målretting, bildebehandling og kreft terapeutiske modaliteter.
Annonse er en av de mest brukte virale vektorer i mange kreft genterapi kliniske studier [3]. I disse studiene, har bruken av første- eller andregenerasjons adenovirus vektorer demonstrerte terapeutisk transgene uttrykk, men den samlede kliniske effekten har vært dårlig på grunn av de ovennevnte begrensninger. For å overvinne begrensninger, er mange anstrengelser vært fokusert på å endre Ad kapsid på individuell krefttype basis. For eksempel endring av Ad kapsid med targeting ligander rettet mot tumorantigener styrket Ad transduksjon i tumorceller
in vitro Hotell og
in vivo product: [8], [9]. Andre tiltak som tar sikte på Ad visualisering og sporing resulterte i merking av Ad kapsid med bioluminesens eller fluorescens. Denne strategien er tillatt for dynamisk og direkte overvåkning av det fysiske plassering og replikasjon av virale partikler
in vivo product: [4], [10], [11]. Videre inkorporering av herpes simplex virus type 1 (HSV-1) tymidin-kinase (TK) på Ad kapsid overflate tillates for direkte funksjonell anvendelse av dette proteinet i selvmord genterapi og microPET avbildning [12].
Vårt lab og andre har validert den mende rolle Ad type 5 mindre kapsidprotein IX (Pix) for innarbeidelse og funksjonell fremvisning av heterologe polypeptider og proteiner, slik som poly-lysin (pK) [13], grønn og rød fluorescens proteiner (GFP og RFP) [4], [10], [11], eller HSV-TK 1 [12], [14]. Vi har ytterligere demonstrert muligheten for å skape en trippel mosaikk annonse ved å presentere tre forskjellige heterologe epitoper på pix steder på en enkelt annonse vektor ved hjelp av genetiske eller ikke-genetiske modifikasjoner [15]. I denne studien utforsket vi pix å vise tre funksjonelle epitoper – pK (for målretting), monomere RFP (mRFP1) (for bildebehandling), og HSV-1 TK (for terapeutisk) på en enkelt annonse vektor i vår innsats for å generere multifunksjonelle annonse vektorer.
Materialer og metoder
antistoffer
PIX-spesifikt antistoff var en slags gave fra Dr. I. Dmitriev (Gene Therapy Center, University of Alabama i Birmingham) . Kaninen polyklonale anti-TK antistoff var en slags gave fra Dr. J. M. Mathis (Gene Therapy Program, Institutt for cellebiologi og anatomi, LSU Health Sciences). Musen anti-His
6 monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Qiagen (Valencia, CA.). Den geitepolyklonalt anti-His
6 antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA.). Den anti-Flag M2 monoklonalt antistoff og kanin polyklonalt anti-c-myc-antistoff ble levert fra Sigma (St. Louis, MO.). Kaninen polyklonale anti-RFP antistoff ble kjøpt fra Chemicon (Temecula, CA.). Pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-mus og geite-anti-kanin sekundære antistoffer, alkalisk fosfatase (AP) -konjugert geit anti-mus, geit anti-kanin sekundære antistoffer, og elektronmikroskopi (EM) karakter 18 nm kolloidalt gull- konjugert esel anti-geit antistoff ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (West Grove, PA.). EM grade 10 nm gull-konjugert esel anti-mus, og EM klasse 25 nm gull-konjugert esel anti-kanin sekundære antistoffer ble kjøpt fra Elektronmikros Science (EMS, Ft. Washington, PA.).
Cells
De humane embryonale nyreceller (293), menneskelige lungekarsinom celler (A549), og menneskelig brystkreft celler (AU-565) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator. AU-565-celler ble dyrket i RPMI-1640 (2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 4,5 g /l glukose, 1,5 g /l natriumbikarbonat, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 10% føtalt bovint serum). Alle andre cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium-Hams F12 (50/50) medium (Sigma) inneholdende 10% føtalt kalveserum (HighClone, Logan, Utah), 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 100 mikrogram /ml streptomycin.
Bygging av rekombinante plasmider
Generering av transporttjenester plasmider. Alle foreldre plasmider ble kjøpt fra kommersielle kilder eller har vært preget tidligere: pShlpIXNhe [13], pShuttle-IX-mRFP1 [4], pShuttle-IX-flagg-sr39tk [12], pShuttle-CMV og pAdEasy-en (Stratagene, La Jolla, CA). Shuttle plasmider ble konstruert ved hjelp av begrensning og PCR kloning som følgende. pShldpIX = pShlpIXNhe /BglII /NheI /sløv /SL (selvligering); PCR-produktet (pcrIXpK) inneholdende den kodende sekvensen til PIX-pK-fusjonsprotein ble generert ved hjelp av pShlpIXNhe som et templat og primere 5′-GGGGTACCGGGCGTGGTTAAGGGTG og 5′-GGGGTACCTTTATTTATGTTCTTGTCATCGTCATCCTTATAATC; pShlpIXflagpK = pShldpIX /KpnI + pcrIXpK /KpnI. PCR-produktet (pcrH6TK) inneholdende den kodende sekvensen til H6-sr39tk protein ble generert ved hjelp av pShuttle-IX-flag-sr39tk som et templat og primere 5′-CTAGCTAGCCACCATCACCATCACCAT CTAGCCGGATCCGGTTC og 5′-CTAGCTAGCTCAATTAGCCTCCCCCATC; pShlpIXH6TK = pShlpIXNhe /NheI + pcrH6TK /NheI. PCR-produktet (pcrMycmRFP1) inneholdende den kodende sekvens av c-myc-mRFP1 protein ble generert ved hjelp av pShuttle-IX-mRFP1 som et templat og primere 5′- CTAGCTAGCGGCGG AGGGAGCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGGAAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCAT og 5′- CTAGCTAGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG; pShlpIXmycmRFP1 = pShlpIXNhe /NheI + pcrMycmRFP1 /NheI. Alle kloner ble verifisert ved restriksjons fordøyelsen og sekvensering.
Generering av PIX-modifiserte adenovirus genomer av homolog rekombinasjon i
Escherichia coli product: [16]. Shuttle vektorer pShlpIXflagpK, pShlpIXH6TK, og pShlpIXmycmRFP1 ble linearisert med PmeI restriksjonsenzym og homologously saman med pAdEasy-1 i elektrokompetente BJ5183-AD1 (Stratagene, La Jolla, CA). Den genererte adenovirus genom inneholder IX-PK, IX-sr39tk, eller IX-mRFP1 modifisert Pix-genet i slettet E1 regionen. Konstruksjonene av resulterende Ad plasmider pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, og pAdpIXmycmRFP1 ble bekreftet ved restriksjons fordøyelsen og sekvensering.
Virus Rescue, Propagation og rensing
pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK og pAdpIXmycmRFP1 plasmider ble linearisert med paci restriksjonsenzym og transfektert inn i 293-celler dyrket i 25-cm
2-kolber ved bruk av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cellene ble samlet opp ved tydelig cytopatisk effekt (CPE) ble observert fulgt av forstyrrelser ved hjelp av fire fryse og tine sykluser. Lysatene ble sentrifugert ved 3000 x g i 5 min ved 4 ° C for å fjerne cellerester. De frigitte virus i supernatanten ble deretter anvendt for ytterligere formering inntil en tilstrekkelig mengde av 293-celler ble infisert (ti 175-cm
2 kolber). Annonse i infiserte celler ble renset i hovedsak som beskrevet tidligere [15]. I korte trekk ble cellene lysert ved fire fryse og tine sykluser og sentrifugert ved 3800 x g i 30 minutter ved 4 ° C for å fjerne cellerester. Celleekstrakter inneholdende virus ble lastet på toppen av et 1,33 /1,45 CsCl trinngradient og sentrifugert ved 55 000 x g i 3 timer ved 4 ° C. Den nedre band, som inneholder infeksiøse viruspartikler, ble re-sentrifugert på en annen 1,33 /1,45 CsCl trinngradient ved 100.000 x g over natten ved 4 ° C. Det resulterende bånd av adenoviruser ble oppsamlet og dialysert mot fire ganger 500 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 10% glyserol, 2 timer hver gang. De genererte annonser ble utpekt som Ad-IX-flagg-PK, Ad-IX-H6-sr39tk, og Ad-IX-myc-mRFP1. Viral partikkel (VP) titere ble bestemt ved spektrofotometri ved OD260 ved hjelp av standard prosedyrer [17].
Generering av Triple PIX-Modified Annonse fra Co-infeksjon
Ten 175-cm
2 kolber av 293 celler ble infisert med Ad-IX-flagg-pK, Ad-IX-H6-sr39tk, og Ad-IX-myc-mRFP1 til en samlet MOI på 200-300 VP /celle. De infiserte celler ble samlet inn for Ad rensing som beskrevet i ovenfor.
Protein elektroforese og Western blotting
5 × 10
9 VP av rensede virus ble kokt i Laemmli-prøvebuffer i 5 min og separert på 4 til 15% gradient natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Separerte proteiner ble så overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, som ble blokkert i 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween-20 (TBS-T), etterfulgt av inkubering med primære antistoffer (mus anti-Flag, 1 :1000, kanin anti-TK, 1:500, kanin anti-RFP, 1:500). Etter vasking og re-blokkering, ble membranen inkubert med de passende sekundære antistoffer konjugert til pepperrot-peroksidase (HRP) ved 1:1000 fortynning. HRP signal ble utviklet med ECL pluss Western blotting deteksjonssystem (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), og deretter oppdaget med Biomaks MR vitenskapelig bilde filmer (Kodak, Chalon-sur-Saone, Frankrike) og en medisinsk film prosessor SRX-101A (Konica, Tokyo, Japan).
ELISA
Solid-fase bindende enzymbundet immunosorbentanalyser (ELISA) ble utført i hovedsak som beskrevet tidligere [18]. I korthet, 10
9 VP av virus ble underkastet seriefortynning (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128) i 100 ul 100 mM karbonatbuffer (pH 9,5), og immobilisert i triplikat i en 96-brønners plate (Nunc Maxisorp) ved inkubering over natten ved 4 ° C. Etter 4 vaskinger med TBS-T og blokkering med TBS-T inneholdende 2% bovint serumalbumin (BSA), ble virus probet med primært antistoff, og deretter AP-konjugerte sekundære antistoffer i TBS-T inneholdende 0,5% BSA ved romtemperatur i 2 timer, med omfattende vasker og blokkering i mellom.
p
-nitrofenylfosfat (Sigma) ble anvendt for fargeutvikling, som beskrevet av produsenten, og lys absorbans (405 nm) ble oppnådd ved en mikroplateleser (POWERWAVE HT 340, BioTek, Winooski, VT.) Etter inkubering i 150 min ved romtemperatur.
immunelek- mikros~~POS=TRUNC
immunelek- mikroskopi ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [15]. Kort fortalt ble virus levd opp til 400-mesh nikkel nett støttes med karbon-belagt Formvar film (EMS). Etter vask med 1% BSA /PBS to ganger i 10 minutter hver, rutenett ble undersøkt med 1% BSA /PBS fortynnet primære antistoffer (1:200 M2 anti-Flag, geit anti-His
6, og kanin anti-c- myc) og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter 2 runder med 1% BSA /PBS vasker, rutenett ble inkubert med 1:10 utvannet sekundære antistoffer (10 nm gull-esel anti-mus, 18 nm gull-esel anti-geit, og 25 nm gull-esel anti-kanin) ved romtemperatur i 45 min. Etter fiksering med 1% glutaraldehyd /PBS i 20 min, gitrene ble underkastet negativ farging i 2% uranylacetat i 12 sekunder og undersøkt under transmisjons-elektronmikroskop ved 60 kV i UAB High Resolution Imaging Facility.
Cell binding hemningsmetoden
bindingsinhibisjonsaktivitet analysen ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [13]. AU-565-celler ble frigjort fra kolbene ved hjelp Versene, vasket en gang med PBS og pelletert og resuspendert til 0,5 x 10
7 celler /ml i bindingsbuffer (DMEM /F12 med 1% BSA). 100 ul celle aliquoter ble overført til hver 5 ml prøverør, og ble tilsatt med 50 ul av en inhibitor (løselig CAR (arr), heparin, eller PBS). Etter 30 minutter risting ved 4 ° C, ble virus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 500 VP /celle i 50 ul bindingsbuffer tilsatt til hvert rør, og de ble ristet ved 4 ° C i 1,5 timer. Cellene ble vasket en gang med 4 ml bindingsbuffer, og deres totale DNA ble ekstrahert og underkastet kvantitativ real-time PCR (TaqMan®) for å måle Ad5 E4 kopiantall. Total-DNA i hver prøve ble kvantifisert ved OD260.
Cell Killing Assay
celledrepende Analysen ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [12]. De lungekarsinom A549-celler ble sådd på en 96-brønns plate ved en densitet på 10.000 celler /brønn en dag før infeksjon Ad. Ad vektorer som bærer PIX-TK-fusjonsproteiner i forskjellige måneder ble deretter anvendt for å infisere A549-celler. Etter 2 timer eller 12 timer med inkubering, prodrug, ganciclovir (GCV) (GYTOVENE-IV, Roche Laboratories, Nutley, NJ), ble tilsatt til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Etter 24 eller 48 timers inkubering, ble levedyktigheten til A549-celler evaluert ved å bruke CellTiter 96® AQ
ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI) og en mikroplateleser (POWERWAVE HT 340, BioTek, Winooski , VT) i samsvar med manufakturer «instruksjon.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av to-tailed uparede Student
t
-UNDERSØKELSER mellom grupper.
P
verdier. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Generering av et Triple PIX-Modified Annonse fra Co-infeksjon
For å generere trippel PIX-modifisert bærer Ad poly-lysin (pK), HSV-1 tymidinkinase mutant (HSV-1 sr39tk), og monomert rødt fluorescerende protein (mRFP1) ved ko-infeksjon, ble tre foreldrevirus generert først: Ad- IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, og Ad-IX-myc-mRFP1. Disse tre virus uttrykke PIX-PK, PIX-TK, eller PIX-mRFP1 fusjonsprotein med flagg, Hans
6, eller c-myc tag, henholdsvis (Fig. 1a). Hvis ikke spesifisert, er alle virusene som brukes i undersøkelsen er replikasjon-inkompetente (E1 /E3 slettet), og transkripsjonen av modifiserte pix gener i hver foreldrevirus ble drevet av den endogene promoter PIX. I tillegg PIX-modifisert annonser bare uttrykke PIX fusjonsprotein siden de innfødte Pix gener har blitt erstattet med de modifiserte pix gener. De tre foreldre virus ble brukt til å co-infisere 293 celler som støtter Ad replikering å generere trippel PIX-modifiserte virus. Ettersom de tre forskjellige Pix fusjonsproteinene ble alle uttrykt og kan settes sammen til hver viral partikkel, ble de resulterende virioner forventes å inneholde en blanding av tre typer Pix fusjonsproteiner (fig. 1B). De genererte og CsCl-renset Ad progenies (betegnet som coAdpIXPTM # 1) hadde en normal avkastning i forhold til enkelt PIX-modifiserte Annonser i vårt laboratorium (data ikke vist). Inkorporering av PIX fusjonsproteiner ble analysert ved Western blotting med anti-Flag, anti-RFP, og anti-TK-antistoffer. Påvisning av PIX fusjonsproteinbånd med forventede molekylmasser bekreftet at tre Pix fusjonsproteiner (dvs. PIX-PK, PIX-TK, og PIX-mRFP1) ble inneholdt i viruspartikler av renset viral basseng (Fig. 1C).
(A) konstruksjoner av de modifiserte Pix gener i genomet til tre foreldre virus: Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, og Ad-IX-myc-mRFP1. Modifiserte Pix gener (merket med flagg, Hans
6, og c-myc, henholdsvis) ble drevet av den opprinnelige PIX promoter. (B) Strukturelle diagram av trippel PIX-modifisert Ad (coAdpIXPTM 1 #) genereres av co-infeksjon strategi. PK, TK, og mRFP1 peptider /proteiner ble innlemmet i C endene av pix. (C) Western blotting-analyse av Ad vektor som inneholder trippel Pix modifikasjoner. 5 x 10
9 vps av CsCl-rensede kontroll Ad5 (kolonne 1) og trippel PIX-modifisert coAdpIXPTM # 1 (kolonne 2) ble underkastet SDS-PAGE. De separerte proteinene ble farget med Gelcode Blå (Pierce, Rockford, IL.) For å oppdage den totale virale proteiner (venstre panel) eller undersøkt med anti-Flag, anti-RFP, eller anti-TK antistoff (høyre panel).
Surface Visning av Modified pixs i Ad Partikler
for å teste hvorvidt polypeptider /proteiner innlemmet i C-terminalen av pix ble presentert på viral overflaten og tilgjengelig for antistoffer, vi utførte enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). I ELISA-forsøket, anti-Flag, anti-His
6, og anti-c-myc-antistoffer ble brukt til å detektere de tre typer av modifiserte pixs. Kontrollen Ad5 inneholder villtype Pix ble ikke anerkjent av noen av disse antistoffene. De coAdpIXPTM # 1 virus ble gjenkjent av anti-Flag, og anti-c-myc antistoffer (fig. 2). Imidlertid virus ble ikke gjenkjent av enten anti-His
6-antistoff (fig. 2) eller anti-TK-antistoff (data ikke vist). Dette resultatet tyder på at pK og mRFP1 ble innlemmet i trippel PIX-modifiserte Ad vektorer. Den ubetydelige binding av anti-His
6 eller anti-TK-antistoff til virus indikerer at TK var heller ikke effektivt overflate eksponert på den virale kapsider eller tilgjengeligheten til disse to antistoffer mot TK proteinene i en slik konfigurasjon var utilstrekkelig til å bli oppdaget i ELISA.
ELISA analyse av Ad vektor som inneholder trippel Pix modifikasjoner. 10
9 vps av CsCl-rensede Ad5 (negativ kontroll) eller coAdpIXPTM # 1 ble utsatt for en seriell fortynning (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1 /64, 1/128) og immobilisert på en ELISA-plate. Virusene ble probet med anti-Flag (1:2000), anti-His
6 (1:1000), og anti-c-myc antistoff (1:1000), etterfulgt av inkubering med alkalisk fosfatase-konjugerte sekundære antistoffer (1:1000). Etter fargeutvikling, ble det lysabsorbans målt og plottet på Y-aksen mot de virale konsentrasjoner. Hvert punkt representerer middelverdien og standardavvik (SD) av tre bestemmelser. Noen feilfelt som stiller til SD er mindre enn deres symboler.
Mosaikk av Triple PIX-Modified Ad
Western blotting og ELISA analyse av de rensede viruspartikler viste at tre typer PIX fusjonsproteiner ble innlemmet i annonse partikler produsert av co-infeksjon (fig. 1). For å undersøke om en enkelt annonse viral partikkel kan vise alle tre typer funksjonelle proteiner, utførte vi en immunelektronmikroskopi for å direkte visualisere PIX-modifiserte Ad partikler. Anti-Flag, anti-His
6 og anti-c-myc-antistoffer ble brukt til å påvise PIX-pK, PIX-TK og Pix-mRFP1 proteiner i viruspartikler, henholdsvis, etterfulgt av tre tilsvarende sekundære antistoffer konjugert med 10 , 18, og 25 nm gull-partiklene, respektivt. Som vist i figur 3, ble ikke noe gull partikkel er bundet til kontroll Ad5 viser villtype-Pix, mens Ad viruspartikler inneholdende en enkelt Pix-fusjonsprotein (Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, og Ad -IX-myc-mRFP1) ble farget av tilsvarende gullpartikler. Trippel modifiserte coAdpIXPTM # 1 virus ble gjenkjent av anti-Flag, anti-His
6 og anti-c-myc antistoffer og merket med 10, 18 og 25 nm gullpartikler. Resultatene viste at tre typer av Pix fusjonsproteiner kan eksistere på en enkelt viral partikkel og ble eksponert på virusoverflaten.
Kontroll eller PIX-modifiserte Ad vektorer ble lastet på EM-gittere, probet med gull nanopartikkel-antistoffer konjugert og observert etter elektronmikroskop ved 60 KV. Mouse anti-Flag, geit anti-His
6, og kanin anti-c-myc primære antistoffer ble brukt for å påvise tre typer koder på PK, HSV-1 TK, og mRFP1 hhv. 10 nm gull-esel anti-mus, 18 nm gull-esel anti-geit, og 25 nm gull-esel anti-kanin sekundære antistoffer ble brukt for etterfølgende gull merking av Ad partikler. Solid tynne piler indikerer 10 nm gullpartikler, tomme piler indikerer 18 nm gullpartikler, og solide tykke piler indikerer 25 nm gullpartikler. Målestokken i hvert panel representerer 50 nm i lengde.
Det er bemerkelsesverdig at, selv om det er 240 eksemplarer av Pix molekyler i hver viral partikkel, ble bare noen få gull partikkel-konjugerte antistoffer bundet på PIX-modifisert Ad viruspartikler. Disse data var i overensstemmelse med tidligere rapporter [15], [19], [20]. Dette er sannsynligvis på grunn av den relative lave tilgjengelighet av pix fra kapsidet overflaten [20] – [22] og romlig hindring effekt av antistoff-konjugert gullpartikler mot hverandre under farging. Vi valgte større gullpartikler for lettere å skille mellom tre epitoper, som har enda høyere antistoff /gull-forhold og en høyere romlig hindring effekt enn på små gullpartikler som er vanlig brukt. I tillegg er anti-His
6-antistoffet ikke effektivt binder PIX-TK som vist på figur 2. Videre kan den lave effektivitet av trippel-farging være en annen grunn av den spredte fargemønsteret vist i figur 3. Det er derfor ikke overraskende at hyppigheten av triply-merkede annonser er lav -. bare ca 1% viruspartikler ble farget med alle tre typer gullpartikler (tabell 1)
Målrette aktivitet av Incorporated Poly-lysin på Triple PIX Mosaic Ad
Ad5 har vist seg å binde sin primære cellulære reseptor, coxsackie B virus og adenovirus reseptor (CAR), som første skritt for smitte via sin fiber knott protein [23]. Poly-lysin (PK) innlemmet i Pix steder i AdLucIXpK har vist seg å megle Ad samspill med mobilnettet heparansulfat proteoglykaner (HSPGs), noe som resulterer i CAR-uavhengig virus-cell binding og transduksjon [13]. Derfor, for å undersøke om PK peptider innlemmet i trippel PIX mosaikk Ad vektor hadde lignende målretting aktivitet til HSPGs, vi utførte cellebinding og hemming analyser med CAR-mangelfull (lavt nivå av CAR) AU-565 celler i nærvær eller fravær av heparin eller løselig CAR (SCAR) protein
en annen versjon av triple PIX-modifiserte Ad vektor ble opprettet ved hjelp av tre tidligere karakteriserte foreldre PIX-modifiserte virus:. AdLucIXpK [13], Ad-DE1-IX sr39tk [12], og Ad-IX-mRFP1 [4] (Flag tags var til stede i alle tre pix fusjonsproteiner). Innlemmelsen av PIX-PK, PIX-TK, og PIX-mRFP1 proteiner på utledet trippel mosaikk Ad (utpekt som coAdpIXPTM # 2) ble verifisert ved Western blotting på de rensede virus ved hjelp av anti-Flag, anti-RFP, og anti- TK-antistoffer (fig 4C.)
(A) konstruksjoner av de modifiserte Pix gener i genomet til tre foreldre virus:. AdLucIXpK, Ad-DE1-IX-sr39tk, og Ad-IX-mRFP1. Modifiserte Pix gener (merket med flagg) ble drevet av den opprinnelige PIX promoter. (B) Strukturelle diagram av trippel PIX-modifisert Ad (coAdpIXPTM # 2) som genereres av co-infeksjon strategi. (C) 5 x 10
9 vps av CsCl-rensede kontroll Ad5 (kolonne 1) og trippel PIX-modifisert coAdpIXPTM # 2 (kolonne 2) ble underkastet SDS-PAGE. De separerte proteinene ble farget med Gelcode Blå (til venstre) eller undersøkt med anti-Flag, anti-RFP, eller anti-TK antistoff. En lang eksponering av anti-Flag Blottet ble tatt med for å vise PIX-pK-protein, som er innlemmet i Ad partikler på et meget lavt nivå. Den «*» stjernene indikerer nedbrytningsprodukter av PIX-mRFP1 fusjonsprotein.
Det ble observert at den positive kontroll AdLucIXpK, hvor alle pix molekyler ble endret av PK, utstilt så mye som to ganger av celle bindende for BIL-mangel AU-565 celler sammenlignet med villtype Ad5. Den triple mosaikk Ad5 (coAdpIXPTM # 2), i hvilken bare en del av pix molekyler inneholdt pK modifikasjon, viste omtrent 1,5-ganger høyere cellebindingsaktivitet sammenlignet med vill-type Ad5 (fig. 5). I tillegg ble mer enn 90% cellebindende evne AdLucIXpK og 50% av den coAdpIXPTM # 2 inhiberes av fri heparin til en endelig konsentrasjon på 500 ug /ml, mens det cellebindende av styre Ad5 ble ikke signifikant påvirket (fig. 5). Tilsetningen av 200 ug /ml arr hemmes mer enn 80% cellebindende av kontroll Ad5, samtidig som de har en forholdsvis beskjeden effekt på AdLucIXpK (60%) og coAdpIXPTM # 2 (25%) (fig. 5). Sammen våre data tyder på at PK peptider som vises på coAdpIXPTM # 2 capsids kunne megle CAR-uavhengig celle målretting gjennom samspill med mobilnettet heparansulfat reseptorer.
AU-565 celler ble inkubert med Ad5, AdLucIXpK, eller coAdpIXPTM # 2 ved en MOI på 500 VP /celle i nærvær av 500 ug /ml heparin eller 200 ug /ml arr protein ved 4 ° C. Bundet Ad partiklene ble kvantifisert ved kvantitativ real-time PCR og normalisert med totalt cellulært DNA. Hver søyle representerer gjennomsnittet og SD av tre bestemmelser, og stjernene indikerer signifikant forskjell mellom spesifiserte grupper.
enzymatisk aktivitet av Incorporated TK på Triple PIX Mosaic Ad
HSV-1 TK protein genetisk kan innlemmes i Ad ved Pix steder med sin opprinnelige enzymatiske aktivitet beholdes, som kan brukes for kreft genterapi med prodrug ganciclovir (GCV), og kan utnyttes for
in vitro
og
in vivo
bildebehandling når kombinert med microPET system [12], [14]. For å undersøke om PIX-TK fusjonsproteiner kan fungere normalt, evaluert vi TK-indusert cytotoksisitet i nærvær av GCV på en farmakologisk konsentrasjon av MTS analysen. For å evaluere PIX-TK fusjonsprotein direkte løslatt fra Ad partikler etter vellykket cellular oppføring, ble lungekarsinom A549 celler brukes, der replikasjon av ikke-replicative Ad og PIX genuttrykk er minimal. A549 celler ble infisert med enkelt PIX-modifisert Ad (Ad-DE1-IX-sr39tk) eller trippel Pix mosaikk Ad (coAdpIXPTM # 2) på ulike Mois. GCV ble tilsatt i infiserte celler to timer etter infeksjon, og den celledød mediert av PIX-TK-fusjonsprotein ble evaluert ved MTS-analysen 24 timer senere. Dataene antydet at det var signifikant GCV-assosiert cytotoksisiteten indusert av enten Ad-DE1-IX-sr39tk eller coAdpIXPTM # 2 infeksjon ved en høy MOI (10000 VP /celle) (Fig. 6A). Men på et lavere MOI (5000 VPS /celle), bare Ad-DE1-IX-sr39tk infeksjon viste GCV-indusert betydelig cytotoksisitet. Dette indikerte at PIX-TK aktivitet i trippel PIX-modifisert Ad var lavere enn for ett PIX-TK-modifisert Ad, som kan skyldes kopiantallet forskjeller i PIX-TK innlemmet i viruspartikler.
(A) A549 celler ble infisert med Ad5 (negativ kontroll), Ad-DE1-IX-sr39tk, eller coAdpIXPTM # 2 på ulike mois. 2 timer senere ble prodrug GCV lagt inn på celler med sluttkonsentrasjon på 1 mM. 24 timer senere ble celledreping aktivitet indusert ved konvertert GCV mediert gjennom PIX-TK evaluert av MTS-analyse. Celler infisert med virus ble normalisert med den for ikke-infiserte celler som relativ celleoverlevelse. (B) A549 celler ble infisert med enkelt PIX-modifisert Ad-DE1-IX-sr39tk eller coAdpIXPTM # 2 på ulike Mois. 12 timer senere, GCV ble tilsatt til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM. 48 timer senere ble celledrepende aktivitet av TK /GCV evaluert som samme som beskrevet ovenfor.
