Abstract
Bakgrunn
Cisplatin er en potent kreft narkotika, men det kliniske programmet har vært begrenset på grunn av sine uønskede fysio egenskaper og alvorlige bivirkninger. Bedre narkotika formuleringer for cisplatin er sterkt ønsket.
metodikk /hovedfunnene
Heri, har vi utviklet en nanopartikkel formulering for cisplatin med høy innkapsling effektivitet og redusert toksisitet ved bruk av cisplatin-tverrbundet karboksymetylcellulose ( CMC) kjerne nanopartikler fremstilt fra poly (laktid-ko-glykolid) -monomethoxy-poly (polyetylenglykol) kopolymerer (PLGA-mPEG). Nanopartiklene har en gjennomsnittlig diameter på omtrent 80 nm målt ved hjelp av transmisjons-elektronmikroskop (TEM). Innkapslingseffektiviteten av cisplatin i nanopartikler er opp til 72%. I mellomtiden har vi også observert en kontrollert frigjøring av cisplatin i en vedvarende måte og doseavhengig behandling effekten av cisplatin belastede nanopartikler mot IGROV1-CP celler. Videre er den midlere dødelige dose (LD
50) av cisplatin belastede nanopartikler var mer enn 100 mg /kg ved intravenøs administrering, som var mye høyere enn for fritt cisplatin.
Konklusjon
Dette utviklet cisplatin belastet nanopartikkel er en lovende formulering for levering av cisplatin, som vil være en effektiv behandlingsregimer for eggstokkreft uten alvorlige bivirkninger og kumulativ toksisitet
Citation. Cheng L, Jin C , Lv W, Ding Q, Han X (2011) Utvikling av en meget stabil PLGA-mPEG partikler Lastet med Cisplatin for kjemoterapi av eggstokkreft. PLoS ONE 6 (9): e25433. doi: 10,1371 /journal.pone.0025433
Redaktør: Martin W. Brechbiel, National Institutes of Health, USA
mottatt: 28 april 2011; Godkjent: 05.09.2011; Publisert: 26.09.2011
Copyright: © 2011 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenner støtte fra China International Science and Technology Cooperation Foundation (2007DFC30306, https://www.cistc.gov.cn/), og Zhejiang-provinsen Technology Prosjekt Foundation (2009C11122, https://www.zjkjt.gov.cn/html /index.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
cisplatinbasert terapeutiske regimer har blitt etablert som standard førstelinje kjemoterapi for pasienter med eggstokkreft siden midten av 1980-tallet [1] – [3]. Imidlertid har dens anvendelse vært begrenset på grunn av alvorlige bivirkninger og kumulativ toksisitet på viktige organer som lever, nyre, hjerte og nervesystemet ved intravenøs administrering [4] – [7]. I de senere år har tallrike nanostørrelse legemiddelbærere blitt utviklet for å minimalisere bivirkninger av cisplatin og forbedre dens antitumor-virkning gjennom formene av micellene så som poly (asparaginsyre) -poly (etylenglykol) miceller, liposomer som pegylerte liposomer og faste lipid-nanopartikler i løpet av kreftterapi [8] – [13]. Oppløselige legemiddel-polymer-konjugater er også blitt utviklet for å øke løseligheten av cisplatin. Slike konjugater omfatter cisplatin komplekser med polykarboksylater, poly (amidoaminer), polyamidoamin-dendrimerer og polyakryl-kjeder. Disse systemene kan redusere toksisiteten og oppnå ideell effekten av kjemoterapi [14] -. [16]
poly (melke-ko-glykol) syre (PLGA) mikropartikler er også blitt anvendt for cisplatin inneslutning på grunn av sin bioforlikelig og nedbrytbare egenskaper [17], [18]. Avgoustakis K et al. har vist at intravenøs administrering av PLGA-mPEG nanopartikler ladet med cisplatin resulterer i en signifikant forlengelse av cisplatin til stede i blodet hos mus [19]. Imidlertid er innkapslingseffektiviteten av cisplatin fremdeles dårlig under fremstillingen av PLGA-mPEG nanopartikler lastet med cisplatin. Gryparis EC et al. [20] har funnet at nanopartikkel søknad har mulighet til å opprettholde tilstrekkelig eller flere konsentrasjoner av cisplatin i 2 uker, men forholdsvis lav PEG-innhold av PLGA-mPEG kan indusere økning i nanopartikkel størrelse. Videre er det ønskelig å oppnå en varig frigjøring og tilstrekkelig konsentrasjon av cisplatin i kliniske oppsett på grunn av kontinuerlig lav-dose administrering av cisplatin er mer effektive i å indusere apoptose enn et enkelt høy-dose eksponering for cisplatin [21], [22].
hoved~~POS=TRUNC med dette arbeidet er å utvikle en innovativ nanopartikler med høy innkapsling effektivitet og bærekraftig frigjøring av cisplatin. I dette nanopartikkel leveringssystem, har d-alfa tocopheryl polyetylenglykol 1000 succinat (TPGS) som en ny effektiv emulgator gunstig for menneskers helse blitt brukt og de biologisk nedbrytbare PLGA-mPEG nanopartikler med CMC kjerner har blitt utviklet. I mellomtiden har den lasting og innkapsling effektivitet av cisplatin også blitt bestemt. Videre har antitumor effekt av nanopartikler ladet med cisplatin på mus eggstokkreft modell evaluert. I konklusjonen, gir den forbedret cisplatin leveringssystem en rasjonell design for potensiell terapeutisk anvendelse av cisplatin i eggstokkreft.
Resultater
Rational design av CMC og TPGS å forberede PLGA-mPEG nanopartikler med cisplatin
Det er en utfordring å forberede nanopartikler lastet med cisplatin ved hjelp av PLGA-mPEG kopolymerer grunn av sine fysiske og kjemiske egenskaper og tilberednings forhold. I denne studien har vi gjennomført en rasjonell design av nanopartikler som inneholder cisplatin ved å skreddersy komposisjoner, størrelse og form. For det første ble PLGA-mPEG-kopolymerer syntetisert fra laktid og glykolid i nærvær av mPEG
5000, hvis hydroksylgruppe kan initiere ringåpningspolymerisering av laktid og glykolid. Strukturen av det syntetiserte kopolymeren ble påvist ved
1 H NMR in CDCh
3, som vist i figur 1. De topper ved 1,65 og 5,10 ppm tilhørte protonene fra metin (CH) og metyl (-CH
3) grupper av PLGA segmenter, mens toppene methene protoner (-CH
2) i PEG segmenter ligger på 3,65 ppm, og toppene methene protoner (-COCH
2O-) ligger på 4.78 ppm var representasjon av konjugerte segmenter av PLGA og mPEG, slik at ingen andre topper ble oppdaget. Den eneste toppen i GPC-spektrum (figur 2) viste en vellykket syntese av PLGA-mPEG-kopolymerer med høy renhet. Polydispersitetsindeksen (PI) som en måling av fordelingsbredde for molekylvekter var 1,78. På grunnlag av gelpermeasjonskromatografi (GPC), og forholdet mellom
1H topparealene mellom 5,10 og 3,65 ppm, ble den gjennomsnittlige molekylvekt av syntetiserte kopolymerer beregnet til 37 062, som vist i figur 2. Vektprosentandelen av mPEG var 13,5%.
toppene på 1,65 og 5,10 ppm tilhørte protonene fra metin (CH) og metyl (-CH
3) grupper av PLGA segmenter, toppene methene protoner (-CH
2) i PEG segmenter ligger på 3,65 ppm, og toppene i methene protoner (-COCH
2O-) ligger på 4,78 ppm representert konjugerte segmenter av PLGA og mPEG.
toppen representerer den gjennomsnittlige molekylvekt av syntetiserte kopolymerer ble beregnet til å være 37062.
for det andre, et modifisert oppløsningsmiddel fordampning metode basert på vann-organisk fase-vann (W /O /W) emulsjoner multiple blant annet en forholdsvis enkel fremstillingsmetode ble brukt for å øke innkapslingseffektiviteten av cisplatin i nanopartikler. De observerte egenskapene til nanopartikler kan variere i stor grad avhengig av CMC-konsentrasjon, TPGS konsentrasjon og de variable prosesser, inkludert bryter av oppløsningsmiddel tilsetningsrekkefølgen. For å oppnå den optimale CMC konsentrasjonen for høy innkapslingseffektivitet, ble forskjellige tilsetningsmengder av CMC i den indre vandige fase av den doble emulsjonen system utforsket. Den effektive innkapslingen av cisplatin i nanopartikler var høyere enn ikke mengden av CMC, som avslørte belastningshastigheten og innkapslingseffektiviteten av cisplatin var 3,88 og 70,9% (vekt /vekt), respektivt, som vist i tabell 1. Totalt 1,7 mg CMC kombinert med 4 mg cisplatin ble valgt som den optimale indre vandige fasen, og den optimale konsentrasjonen for TPGS ble siktet for å være 0,035% (w /v).
som vist i tabell 2, er den gjennomsnittlige størrelse av preparerte nanopartikler lastet med cisplatin varierte 180-210 nm, og belastningshastigheten av cisplatin var 3.5 til 4.2% (vekt /vekt). PI ble bestemt til å være omtrent 0,3, noe som viste en homogen fordeling i diameter. CMC og PLGA-mPEG-polymerer dratt en negativ ζ-potensialet med en midlere verdi på -10,1 og -9,5 mV i tomme nanopartikler og nanopartikler cisplatin-lastet, respektivt. Ingen signifikant forskjell ble observert i størrelse og ζ-potensialet av nanopartikler med eller uten cisplatin. Figur 3 viser de representative bilder av den ytre struktur av nanopartikler undersøkt av TEM. De fleste nanopartikler var kuleform med mindre diametre enn diametrene bestemt ved dynamisk lysspredning. Morfologi av nanopartikler med eller uten cisplatin avslørte utvisket eller lignende strukturer
(A) tomme nanopartikler.; (B) cisplatin lastet nanopartikler. Prøvene ble farget med 1% fosfowolframsyre (50 000 x).
Til slutt ble den kumulative frigjøringsprofilen av cisplatin fra nanopartikler målt ved hjelp av høytrykks-væskekromatografi (HPLC), som vist i figur 4. Denne analysefremgangsmåten var følsom nok til å måle cisplatin i et bredt konsentrasjonsområde med en deteksjonsgrense på 0,31 ng /ml. En kalibreringskurve ble etablert i hvert eksperiment. Frigjøringskinetikken for cisplatin fra nanopartikler viste en konstant kontrollert frigjøringshastighet som funksjon av tiden. Imidlertid kan den stabile utgaven bli påvirket av CMC-cisplatin konjugering og biologisk nedbrytbare PLGA-mPEG kopolymerer. Likeledes, som vist i figur 4, er innfanging av cisplatin i nanopartikler kan i betydelig grad forsinker frigjøringshastigheten av cisplatin og følgelig fører til en ganske jevn frigjøring over tid.
Cisplatin gitt ut fra nanopartikler som en funksjon av inkubasjonstid i 100 mmol /l natriumklorid-oppløsning ved 37 ° C.
Akutt toksisitet av CMC kjernenanopartikler
for å evaluere cytotoksisiteten av nanopartikler uten lasting av medikamenter, cytotoksisiteten til nanopartikler i doser på 0,005, 0,02, 0,04 og 0,08 mg /mL ble undersøkt ved å bruke 96-brønners mikroplater podet med celler ved en tetthet på 3000 celler /brønn. Cellevekstkurver for kontroll og nanopartikkel-behandlede grupper var like, noe som tyder på at nanopartiklene ved de testede konsentrasjoner fremviste ikke åpenbar toksisitet på celler, som vist i figur 5 (A). I tillegg er den maksimale mengden av nanopartikler (0,08 mg /ml) og tetthet på 3000 celler /brønn var også de optimale betingelser for å evaluere effekten av cisplatin-lastet nanopartikler på cellevekst
in vitro
.
(A) Relativ cellelevedyktighet IGROV1-CP-celler utsatt for tomme nanopartikler i 72 timer med forskjellige doser. (B) Cellevekst-hemming etter eksponering for fri cisplatin (grå histogram) og cisplatin belastede nanopartikler (sort histogram) i 72 timer. Dataene representert som Mean ± SD.
Den anticancer aktivitet gratis cisplatin og cisplatin lastet nanopartikler på IGROV1-CP celler
in vitro
ble bestemt. Som vist i figur 5 (B), ble det ikke observert noen signifikant forskjell i cytotoksisitet mellom cisplatin belastede nanopartikler og fri cisplatin ved de testede konsentrasjoner (
p
0,05). Den cytotoksisitet av både gratis cisplatin og cisplatin lastet nanopartikler var doseavhengig. Derfor kan PLGA-mPEG nanopartikler bidrar til kontrollert frigjøringshastigheten av cisplatin og samtidig bevare effektiviteten av anticancer cisplatin.
For å vurdere for potensielle toksisitetsrisiko, ble ICR-mus injisert intravenøst med cisplatin belastede nanopartikler ved forskjellige doser og endringen i overlevelse av musene ble undersøkt. I alle testede dosenivåer, dødelighet mellom grupper viste en signifikant forskjell i løpet av en to ukers ventetid (
p
0,05). Dødeligheten av cisplatin belastede nanopartikler i en dose på 100 mg /kg (på basis av cisplatin) var 40,0%, men dødsraten i 10 mg /kg cisplatin behandlingsgruppe nådde opp til 62,5%. Ingen forringelse helse ble observert i mus behandlet med tomme nanopartikler i løpet av observasjonsperioden, og den samlede oppførselen til mus behandlet med cisplatin belastede nanopartikler eller tomme nanopartikler har ikke oppviser en tydelig forskjell. LD
50 var 8,6 mg /kg for fri cisplatin og 103,4 mg /kg for cisplatin-lastet nanopartikler, som vist i tabell 3. Derfor, sammenlignet med fri cisplatin, nanopartiklene lastet med cisplatin kan gi økt sikkerhet i klinisk anvendelse .
Sikkerhetsprofilen for CMC kjernenanopartikler i IGROV1-CP xenopodet nakne mus
for å kunne observere forsinket organtoksisitet på mus innenfor en viss behandlingsperiode, store organer inkludert hjerte , lever, lunge, nyre og milt fra BALB /c naken mus administreres med gratis cisplatin og cisplatin lastet nanopartikler ble seksjonert og farget med HE. Ingen åpenbare histopatologisk forandring ble observert i hjerte, lunge og milt av cisplatin belastede nanopartikler behandlede mus, som vist i figur 6. Imidlertid ble hepatisk nekrose og patologisk atrofi av nyrene hos mus behandlet med fri cisplatin observert. Tilsvarende administrering av cisplatin-lastet nanopartikler opp til 3 mg /kg i 5 påfølgende doser ikke føre til en betydelig patologisk forskjell i lever og nyre.
Nude athymiske mus IGROV1-CP xenotransplantater ble behandlet med saltvann ( kontroll), tomme nanopartikler (tomme NPS), cisplatin og cisplatin lastet nanopartikler (NPs-CP) på fem doser hver 4. dag. De organer, inkludert hjerte, lunge, milt, lever og nyre fra mus behandlet med saltvann ble vist i den første raden. Organene fra mus behandlet med tomme nanopartikler ble vist i den andre raden. Organene fra de mus som var behandlet med fri cisplatin ble vist i den tredje raden. Organene fra de mus som var behandlet med cisplatin belastede nanopartikler er vist i den fjerde raden.
For å evaluere effekten av cisplatin belastede nanopartikler på apoptose, ble tumor vevssnitt farget med TUNEL for å evaluere DNA-fragmentering. Opplisting av apoptotiske kjerner (ca. 200 celler ble talt) ble gjort på lysbilder plukket opp tilfeldig av to uavhengige forskere. En klynge av apoptotiske legemer ble gitt som en enkelt telling, og apoptotiske tellinger i forskjellige behandlingsgruppene er vist i figur 7 (A). Xenotransplantater behandlet med cisplatin belastede nanopartikler avslørt høyere apoptotiske nivåer enn kontrollene (saltvann og tomme nanopartikler,
p
0,05). Selv om det totale tellinger av apoptotiske celler i tumorer behandlet med cisplatin belastede nanopartikler var noe høyere enn de i tumorer som ble behandlet med konvensjonell cisplatin ble det ikke observert noen signifikant forskjell i totale tellinger av apoptotiske celler i begge behandlingsgrupper, slik som vist på figur 7 (B) (
p
0,05)
(A) Mikroskopisk vurdering av tumor apoptose ved TUNEL farging.. Athymiske mus IGROV1-CP xenotransplantater ble behandlet med saltvann (kontroll), tomme nanopartikler (tomme NPS), cisplatin og cisplatin lastet nanopartikler (NPs-CP) på fem doser. (B) Den gjennomsnittlige apoptotiske celler ble beregnet på grunnlag av TUNEL farging. Athymiske mus IGROV1-CP xenotransplantater ble behandlet som beskrevet i (A).
Behandling effekt
in vivo
studier
Behandlingen effekten av cisplatin-lastet nanopartikler for IGROV1-CP celle xenograft i BALB /c nakne mus ble evaluert. Etter at det gjennomsnittlige volum av svulstene var opp til 100-130 mm
3 ble de tumor-bærende mus delt inn i fire grupper (n = 8) med minimal forskjell i vekt og størrelse av tumorer blant grupper. I tillegg, ble musene behandlet med følgende regimer, inkludert saltvann, nanopartikler uten cisplatin, fri cisplatin, og cisplatin belastede nanopartikler hver fjerde dag. Den dose av cisplatin-baserte behandlinger var 3 mg /kg kroppsvekt.
Tumor størrelse, kroppsvekt og overlevelse av musene ble deretter fulgt i 21 dager etter begynnelsen av behandlingen. Det midlere tumorvolum ved slutten av behandlingsperioden var 209 ± 25 mm
3 i saltløsning-behandlede gruppen, og 213 ± 19 mm
3 i blank nanopartikkel-behandlede gruppen, som vist i figur 8 (A) . Men i cisplatin-behandlede gruppen, den endelige midlere tumorvolum var 166 ± 16 mm
3, som var betydelig mindre enn den i saltvann-behandlede grupper ved ANOVA-analyse på 95% konfidensintervall. Sammenlignet med den cisplatin-behandlede gruppen, en liten reduksjon av tumorvolumet i cisplatin belastet nanopartikler behandlede gruppe med gjennomsnittlig tumorstørrelse på 146 ± 19 mm
3 ved slutten av behandlingsperioden. En mulig årsak var at den påfølgende intracellulær levering av cisplatin kan bli hindret av MPEG modifisering av nanopartikler, som ikke utviser et betydelig bidrag på tumorreduksjon. På slutten av behandlingsperioden (dag 21), overlevelse av musene i cisplatin belastede nanopartikler-behandlede gruppen, cisplatin-behandlede gruppen, blank nanopartikkel-behandlede gruppen og saltvann-behandlede gruppen var 87,5, 62,5, 75 og 75 %, henholdsvis, slik det er vist på figur 8 (B). Forskjellen i overlevelse fra fire grupper antydet at cisplatin lastet nanopartikler var mye tryggere enn gratis cisplatin. Kroppsvektene til musene viste en gradvis reduksjon med start fra den andre dosen, selv ble ikke observert noen signifikant forskjell i fire grupper, som vist i figur 8 (C).
(A) Virkning av fri cisplatin (3 mg /kg) og cisplatin belastede nanopartikler (NPS-cp, 3 mg /kg på basis av cisplatin) på tumorvekst i atymiske mus som bærer med IGROV1-CP celle xenografter. Musene ble administrert med preparerte formuleringer ved 4-dagers mellomrom i totalbehandlingsperiode på 21 dager. Saltoppløsning ble brukt som kontrollgruppe, og effekten av tomme nanopartikler (tomme NPS) ble også bekreftet. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 8 ved begynnelsen av eksperimentet). (B) Overlevelse av tumor-bærende atymiske mus behandlet med cisplatin (3 mg /kg), NPS-cp (3 mg /kg på basis av cisplatin), tomme NPS og saltløsning (kontroll). (C) Endring i kroppsvekt som den behandlingstid på IGROV1-CP tumor-bærende mus. Barer angitt standardavvik.
Diskusjoner
Fysikalsk-kjemiske egenskapene til cisplatin, slik som dårlig løselighet i vann (1 mg /ml), høy bindende affinitet til plasmaproteiner og nedbrytbarhet, kan begrense den terapeutiske effekten av cisplatin. Cisplatin-baserte hindringer på sin kliniske programmet kan løses ved hjelp av biotilgjengelige polymere nanopartikler. Foreløpig noen typer nanopartikler fremstilt av poly (laktid) -monomethoxy-poly (etylenglykol) (PLA-MPEG) og PLGA-mPEG kopolymerer har fått økende oppmerksomhet. Begrunnelsen for denne studien er å øke lasting og innkapsling effektivitet av cisplatin av nanopartikler, og dermed forbedre stabiliteten av cisplatin. TPGS kan også tilveiebringe et sikkert alternativ av polyvinylalkohol (PVA) eller andre additiver for å forbedre fremstillingen av ensartede nanopartikler fra sats til sats.
ved hjelp av modifisert W /O /W emulsjon dobbel metode som er utviklet av Gryparis EC et al . [20], har vi utviklet en ny begrepet «kjerne-CMC-cisplatin-tverrbinding» som i stor grad kan forbedre effektiviteten lasting av cisplatin. I løpet av tverrbindingen av CMC, kan kloridionet i cisplatin utveksle hydrogenioner med CMC i vann for å danne et kompleks. På grunn av tilbakeholdelse av komplekset i den primære emulsjonen fasen kan cisplatin lastes opp på nanopartikler laget av hydrofobt PLGA med hydrofil metoksypolyetylenglykol kjeder. Lastingen Effektiviteten av cisplatin er forbedret til 3,9 ± 0,3% (vekt /vekt), og innkapslingseffektiviteten er opp til 70,9 ± 2,6%. Videre er det ingen rapporter i forbindelse med anvendelse av CMC-polymerer som en strategi for å forbedre den lasting effektiviteten av cisplatin. Derfor bør cisplatin belastet nanopartikler være effektive stoffet levering bærere for cisplatin
in vivo
studien.
Den høye innkapsling effektivitet av cisplatin er også delvis på grunn av bruk av TPGS emulgator i coordination- indusert nanopartikkel formasjon. TPGS er forskjellig fra tidligere rapportert PVA, natriumcholat eller andre emulgeringsmidler [17], [20]. TPGS, et vannløselig derivat av naturlig vitamin E, er ofte brukt i kosttilskudd og farmasøytiske formuleringer. I denne studien har vi lykkes generert homogene nanopartikler ved hjelp av TPGS. Ingen rusk og aggregering i homogene nanopartikler ble observert av TEM. Monodisperse emulsjonsdråper fremmer koalesens uten TPGS, og nanopartikler er vanskelige å forme. Her blir TPGS brukes med et håp om å fortrenge ovennevnte emulgatorer og unngå deres fjerning trøbbel.
Under evalueringen av cellen levedyktighet og behandlingseffekten av forberedt cisplatin belastede nanopartikler, levedyktigheten til IGROV1-CP celler inkubert med fri cisplatin i konsentrasjonsområdet 8-24 um i tre dager viste en reduksjon fra 79,6% til 14,8%, mens levedyktigheten av cellene behandlet med cisplatin-innkapslet nanopartikler viste en reduksjon fra 76,9% til 10,8%. Videre, cisplatin belastede nanopartikler effektivt hemmet tumorvekst i nakne mus sammenlignet med fri cisplatin i samme dose, noe som tyder på at nanopartiklene ikke avbryte anticancer-effektiviteten av cisplatin
in vivo
. TUNEL analysen bekreftet også forbedret effektiviteten av cisplatin belastede nanopartikler på svulst hemming. Samtidig avslørte histopatologisk undersøkelse levernekrose og atrofi i nyre i gruppen behandlet med gratis cisplatin, men slike histopatologiske endringer ble ikke observert i gruppene behandlet med cisplatin-lastet nanopartikler. I tillegg gjorde andre store organer som hjerte, milt og lunge ikke avsløre unormalt heller. Derfor bør de kjerne-CMC-cisplatin-krysskoblet nanopartikler være mye tryggere og høyere effektivitet enn gratis cisplatin under kreftbehandling.
For ytterligere å forstå bivirkninger av cisplatin-lastet nanopartikler, potensiell akutt toksisitet av cisplatin -loaded nanopartikler ble også evaluert. ICR-mus ble injisert intravenøst med 0,8 ml av cisplatin-lastet nanopartikler ved cisplatin konsentrasjoner på 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 og 3,0 mg /ml, henholdsvis, og overlevelse av musene ble undersøkt. Som forventet, LD
50 av cisplatin belastede nanopartikler avslørte 12 ganger høyere enn for fri cisplatin. Sammenligning av total overlevelsesrate, BALB /c mus viste mer toleranse for cisplatin-lastet nanopartikler enn gratis cisplatin, som indikerte at cisplatin lastet nanopartikler hadde mer sikkerhet enn gratis cisplatin på betingelse av relativt høye administrasjons dose.
generelt har cisplatin belastede nanopartikler blitt utformet og fremstilt. Sfæriske partikler og snever størrelsesfordeling er blitt karakterisert. Vedvarende frigjøring av cisplatin over fem dager fra PLGA-mPEG nanopartikler
in vitro
ble observert. Derfor kan vi konkludere med at nanopartikler har et betydelig bidrag til den kontrollerte frigjøring av cisplatin og ikke skader behandling effektiviteten av cisplatin. Våre funn gi ytterligere evaluering av cisplatin-lastet nanopartikler som en roman kreftbehandling. Imidlertid, for å maksimalisere antitumoreffekt av cisplatin-lastet nanopartikler, er det nødvendig å ytterligere optimalisere administrasjonsdose og injeksjonsregime.
Nåværende strategier, spesielt for fremstilling av slike nanopartikler, en flertrinns-preparat. Som et resultat av dette er fremgangsmåten en iboende ineffektivt system, som kanskje ikke er lett skalerbar og kan resultere i batch-til-batch variasjon. I vårt laboratorium, har vi utviklet en ny fremgangsmåte for fremstilling av nanopartikler med batch-til-batch ensartethet. Det er en enkel, skalerbar, effektiv og kontrollerbar systemet med vårt godt designet formulering strategi. Vår proof-of-concept
in vitro Hotell og
in vivo
Evalueringen viser at PLGA-mPEG nanopartikkel formulering er en potensiell cisplatin levering system for eggstokkreft behandling.
Materialer og metoder
Material
Cisplatin ble kjøpt fra Shandong Boyuan Chemical Co Ltd (Jinan, Kina). CMC ble kjøpt fra Aladdin Reagens Co Ltd (Shanghai, Kina). mPEG (M
W 5 kDa) og TPGS ble oppnådd fra Jiangsu Xixin Vitamin Co. Ltd. revers-fase-kolonne (ZORBAX-NH
2, 250 x 4,6 mm, 5 um) ble innkjøpt fra Agilent Technologies Co . Ltd (USA). Alle reagens vann som brukes i laboratoriet ble forbehandlet med Milli-Q-Plus-system (Millipore Corporation, USA). Alle MPEG-prøver ble dehydratisert ved azeotrop destillasjon med toluen, og deretter vakuumtørket ved 50 ° C i 12 timer før bruk. IGROV1-CP celler ble vennlig levert av Dr. Stephen Collins ved UCSD (CA, USA).
Dyr
Alle dyreforsøk ble gjennomført med godkjenning av Institutional Animal Ethics Committee (IACE) av Research Center of Laboratory Animal Science of Zhejiang Chinese Medical University (Hangzhou, Kina). Tillatelsen tallene er Syxk (zhe) 2008-0115. ICR-mus og BALB /c-mus (4-6 uker gamle og som veide 18-22 g) ble holdt ved dyret midten. Cisplatin-lastet nanopartikler ble administrert med intravenøs injeksjon. På slutten av behandlingsperioder, ble lever, nyre, hjerte, milt og lunge vev samlet i henhold til godkjenning av IAEC.
Syntese og karakterisering av PLGA-mPEG copolymer
PLGA-mPEG -kopolymerer ble fremstilt ved en smelte polymerisasjonsprosess under vakuum ved hjelp av stanno-2-etylheksanoat som katalysator [23]. PLGA (30) -mPEG (5) ble syntetisert med sammensetning LA:GA:EO = 03:01:01, Mw (vektmidlere molekylvekt) = 3,7 x 10
4, PI = 1,8 (LA, GA og EO står for melkesyre, glykolsyre og etylenoksyd-komponentene henholdsvis). Kopolymeren ble preget med
1 H-NMR og GPC.
Utarbeidelse og karakterisering av cisplatin belastede nanopartikler
PLGA-mPEG nanopartikler lastet med cisplatin var forberedt med W /O /W emulsjon fordampning av løsningsmiddel metode som er utviklet av Gryparis EC [20], med bestemte modifikasjoner. I korthet, 5,71 mg /ml cisplatin ble oppløst i 30 mM CMC vandig oppløsning ble emulgert i en organisk fase ved hjelp av ultralydbehandling (bioruptor, modell UCD-200 TM-EX) ved 100 W i 45 sekunder. Den organiske fasen ble i hovedsak sammensatt av kloroform og aceton inneholdende 50 mg PLGA-mPEG. Vann-i-organisk fase-emulsjonen ble tilsatt til en vandig oppløsning av TPGS (0,035%, vekt /volum).
Den resulterende W /O /W-emulsjonen ble deretter microfludized med et minimumstrykk på 12 000 psi, og omrørt med en magnetrører i 3 timer ved romtemperatur inntil fullstendig fordamping av kloroform og aceton. Til slutt ble nanopartikkelsuspensjonen frysetørket og lagret ved 4 ° C inntil senere bruk. For å øke den innfanging av cisplatin i nanopartikler, CMC i den indre vandige fase av W /O /W ble konjugert til cisplatin i 1 ml vann i 3 timer under kontinuerlig forsiktig omrøring. Blanke nanopartikler ble også forberedt med samme metode uten cisplatin.
Partikkelstørrelse og Zeta potensial ble målt ved hjelp av Malvern Zetasizer instrument (13 nedfarter per prøve, NETASIZER NANO S90). Den morfologisk undersøkelse av nanopartikler ble observert i henhold til TEM (JEM-1230, JEOL, Japan). En dråpe av nanopartikkelsuspensjonen ble plassert på et kobbergitter dekket med nitrocellulosemembran og tørkes i åpen luft før negativ farging med fosforwolfram natriumhydroksyd-løsning (1% w /v).
Bestemmelse av lasteeffektivitet og
in vitro
frigjøringshastigheten av cisplatin
lasteeffektivitet av cisplatin i nanopartikler ble bestemt ved hjelp av en direkte prosedyre [24]. Helt 5 mg lyofiliserte nanopartikler ble oppløst i 1 ml av NaOH (0,1 N) og omrørt over natten på en magnetrører ved romtemperatur. Suspensjonen ble sentrifugert ved 18 000 g i 10 minutter, og 90 ul av supernatanten ble brukt for å kvantifisere cisplatin-innhold ved HPLC. Innkapslingseffektiviteten ble beregnet som mengden av cisplatin utvinnes fra nanopartikler i forhold til den opprinnelige mengde av cisplatin anvendt for hvert preparat. I tillegg, for å kvantifisere frigjøringskinetikken av cisplatin fra nanopartikler, cisplatin belastede nanopartikler (5 mg) ble suspendert i 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Suspensjonen ble plassert i et mikrosentrifugerør og deretter satt i en orbital vannbad rysting ved 120 rpm ved 37 ° C. Rørene ble sentrifugert ved angitte tidsintervaller. Etter sentrifugering, ble supernatantene samlet opp for bestemmelse av cisplatin. Etter prøvetaking våre supernatanter, ble inkubasjonsmediet erstattet med fersk PBS og rørene ble plassert tilbake i inkubatoren. Den cisplatin Innholdet av disse oppløsninger ble bestemt ved å måle absorbansen ved 310 nm med en ikke-gradient mobil fase bestående av 0,9% NaCl og metanol (v /v, 25/75) ved en konstant strømningshastighet på 1,0 ml /min.
In vitro
cytotoksisitet studie
MTT analysen ble brukt til å vurdere toksisitet av tomme nanopartikler, cisplatin lastet nanopartikler og gratis cisplatin mot IGROV1-CP eggstokkreft kreftceller [25 ]. Cellene ble sådd i plast 96-brønners plater ved 3 x 10
3-celler per brønn. Tjuefire timer etter utplating, cisplatin, tomme nanopartikler og cisplatin belastede nanopartikler (både suspendert i kulturmedium) ved forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt til brønnene. Totalt 50 ul MTT-løsning (5 mg /ml i PBS, pH 7,4) tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 3 timer. Oppløsningen ble trukket tilbake, og deretter 200 ul av surgjort isopropanol (0,33 ml HCl i 100 ml isopropanol) ble tilsatt og omrørt grundig for å oppløse formazankrystaller. Løsningen ble umiddelbart avlest på en mikroplateleser (TECAN infinit M200, USA) ved en bølgelengde på 490 nm. Eksperimentene ble utført tre ganger uavhengig av hverandre. Cytotoksisitet ble uttrykt som prosent inhibering av cellelevedyktighet.
In vivo
vurdering av akutte toksisitet
ICR-mus ble brukt for å vurdere relative toksisiteten etter intravenøs administrering av cisplatin-lastet nanopartikler .
