Abstract
Nyere funn viser at endrede mikroRNA-9 (MIR-9) uttrykk er innblandet i progresjon av magekreft. Men de eksakte roller og underliggende mekanismer for Mir-9 i spredning, invasjon og metastasering av magekreft fortsatt ukjent. I denne studien ble MIR-9 funnet å være nedregulert og inverst korrelert med ekspresjonen av cyclin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (ETS1) i magekreft vev og cellelinjer. Bioinformatikk analyse viste de antatte MIR-9 bindingssteder i 3′-utranslaterte regioner (3′-UTR) av cyclin D1 og ETS1 mRNA. Ektopisk uttrykk eller knockdown av MIR-9 resulterte i responsivt endret uttrykk for cyclin D1, ETS1 og deres nedstrøms mål fosforylert retinoblastom og matriks metalloproteinase 9 i dyrkede mage kreft cellelinjer SGC-7901 og AGS. I luciferase reporter system, MIR-9 direkte rettet 3′-UTR av cyclin D1 og ETS1, og disse effektene ble avskaffet ved mutere Mir-9 bindingssteder. Over-uttrykk for MIR-9 trykt spredning, invasjon og metastasering av SGC-7901 og AGS celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Restaurering av MIR-9-mediert nedregulering av cyclin D1 og ETS1 ved transient transfeksjon, reddet kreftceller fra reduksjon i proliferasjon, migrering og invasjon. Videre anti-MIR-ni inhibitor forfremmet spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, mens banket ned av cyclin D1 eller ETS1 delvis phenocopied effektene av Mir-ni over-uttrykk. Disse dataene indikerer at Mir-9 undertrykker uttrykk for cyclin D1 og ETS1 via bindingsstedene i sin 3′-UTR, og dermed hemme spredning, invasjon og metastasering av magekreft
Citation. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) mikroRNA-9 Undertrykker spredning, invasjon og metastasering av magekreft celler gjennom målretting Cyclin D1 og ETS1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719
Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile
mottatt: 14. september 2012; Godkjent: 29 desember 2012; Publisert: 31 januar 2013
Copyright: © 2013 Zheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av Foundation National Natural Science of China (No. 30600278, nr 30772359, nr 81071997, nr 81072073, nr 81272779), Program for New Century gode talenter i University (NCET-06-0641), Scientific Research Foundation for returnerte Overseas Chinese Scholars (2008-889), og grunnleggende forskning fond for de sentrale universiteter (2012QN224). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen i verden [1]. Til tross for bedring i kirurgisk og multimodal terapi, fortsatt prognosen for avansert magekreft dårlig på grunn av gjentakelse, invasjon og metastasering, med en 5-års overlevelse under 30% [1]. En bedre kunnskap om mekanismene bak tumorprogresjon er berettiget til å oppdage nye paradigmer for diagnostisering og behandling av magekreft [2]. MicroRNAs (mirnas), en nylig identifisert kategori av små og høyt konserverte ikke-kodende RNA, kan delta i post-transcriptional regulering av genuttrykk gjennom delvis komplementær binding med 3-utranslaterte regioner (3′-UTR) av målet mRNA, som resulterer i translasjonell undertrykkelse eller mRNA degradering [3]. Emerging bevis viser at mirnas er involvert i de biologiske prosesser knyttet til apoptose, proliferasjon, differensiering, invasjon og metastasering, mens dereguleringen av noe som er avgjørende for kreft initiering og progresjon [3]. Det er for tiden haster å undersøke rollene til mirnas og deres mål gener i tumorprogresjon ved eksperimentelle modeller.
I human magekreft, har blitt rapportert en rekke mirnas å være abnormt over-uttrykt eller nedregulert i løpet av progresjon av magekreft, inkludert MIR-21 [4], Mir-15b [5], Mir-16 [5], og MIR-101 [6]. Disse mirnas spille onkogene eller kreftundertrykkende roller i regulering av cellevekst, migrasjon og invasjon av undertrykke sine mål gener. For eksempel, er onkogene MIR-21 abnormt over-uttrykt i magekreft, og forbedrer spredning og invasivitet av magecancerceller ved å målrette rever-induserende cysteinrike proteiner med Kazal motiver [4]. I mellomtiden, MIR-15b og MIR-16 er nedregulert i magekreft, og bidra til multimedikamentresistens av magekreftceller ved modulering av apoptose via rettet mot B-celle leukemi /lymfom 2 [5]. MIR-101 er nedregulert i mage kreft vev og cellelinjer, mens ektopisk uttrykk for MIR-101 signifikant hemmer spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller ved å målrette Enhancer av Zeste homolog 2, cytokrom c oksidase subenheten II, og myeloid celle leukemi-sekvens 1 [6]. Derfor har det vært et fokus for å utforske videre uttrykk og funksjon av miRNA i tumorbiologi av magekreft.
mikroRNA-9 (MIR-9) er først identifisert som en av de avgjørende regulatorer for utvikling , fysiologi og patologi av nervesystemet i flere organismer, inkludert
Drosophila
, sebrafisk og pattedyr [7] – [9]. En serie av etterfølgende studier har vist at endrede MIR-9 ekspresjon er assosiert med utvikling og progresjon av kreft [10] – [14]. Tidligere studier viser at MIR-9 er betydelig nedregulert i magekreft, noe som tyder på dets potensielle roller i tumorprogresjon [15] – [18]. Det er også antydet at Mir-9 kan modulere spredning av magekreftceller via målrette haletypen homeobox 2 (CDX2) [19] og NF-kappa B (NF-kB) [16]. Men den eksakte funksjon og underliggende mekanismene for Mir-9 i utviklingen av magekreft fortsatt garanterer videre etterforskning. I denne studien demonstrerer vi for første gang, at MIR-9 direkte rettet mot cyclin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (ETS1), og undertrykker spredning, invasjon og metastasering av magekreftceller
i vitro Hotell og
in vivo
.
Resultater
MIR-9 var nedregulert og omvendt korrelert med uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i mage kreft vev og cellelinjer
For å undersøke MIR-9 uttrykk i magekreft, magekreft vev og tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen ble samlet inn fra 86 primær tilfeller. Real-time kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT-PCR) viste at Mir-9 ble nedregulert i mage kreft vev enn i tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen (
P
= 0,001, Fig. 1a). Mir-9 uttrykk var betydelig lavere i magekrefttilfeller med dypere mageveggen invasjon (
P
0,001), lymfeknutemetastase (
P
0,001), fjernmetastaser (
P
= 0,022), og avansert TNM stadium (
P
= 0,01) (Tabell S1). Derimot ble høyere cyclin D1 og ETS1 transkripsjonsnivåer påvist i magekreft vev (
P
0,0001 og
P
. . 0,0001, henholdsvis figur 1B og figur 1C). Det var en invers korrelasjon mellom MIR-9 uttrykk og cyclin D1 transkripsjonsnivåer i mage kreft vev (
P
. 0,001, figur 1D). I tillegg ble en invers korrelasjon mellom MIR-9 uttrykk og ETS1 transkripsjonsnivåer også bemerket i disse kreft vev (
P
. 0,001, figur 1E). Lavere MIR-9 uttrykk og høyere transkripsjonsnivåer av cyclin D1 og ETS1 ble observert i magekreft cellelinjer enn i normale mage epitelceller GES-1 celler [20] (Fig. 1F). Immunhistokjemisk farging ble utført for å observere den ekspresjonen av cyclin D1 og ETS1 i disse kreft prøver (fig. S1). Nuclear cyclin D1 ble notert i 26/86 (30,2%) tilfeller, mens kjernekraft og cytoplasma farging av ETS1 ble observert i 58/86 (67,4%) tilfeller (tabell S1). Immunreaktiviteten cyclin D1 og ETS1 var betydelig høyere i magekrefttilfeller med dypere mageveggen invasjon (
P
0,001 og
P
= 0,001), lymfeknutemetastase (
P
0,001 og
P
0,001), fjernmetastaser (
P
0,001 og
P
0,001), og avansert TNM stadium (
P
0,001 og
P
= 0,004) (tabell S1). Lavere MIR-9 uttrykk ble observert i mage kreft vev med høyere farging av cyclin D1 (
P
0,0001, figur 1G.) Eller ETS1 (
P
. 0,0001, figur 1 H ). Disse resultatene indikerte at MIR-9 ble nedregulert og inverst korrelert med ekspresjonen av cyclin D1 og ETS1 i magekreft vev og cellelinjer.
A, B og C, i sanntid kvantitativ RT-PCR indikerte at når sammenlignet med tilstøtende ikke-neoplastisk mucosa (n = 86), nedregulering av MIR-9 og høyere transkripsjonsnivåer av cyklin D1 og ETS1 ble påvist i magekreft vev (n = 86). D og E, der var en invers korrelasjon mellom MIR-9 ekspresjon og transkripsjonsnivåer av Cyclin D1 eller ETS1 i magekreft vev. F, lavere MIR-9 uttrykk og høyere cyclin D1 og ETS1 transkripsjonsnivåer ble observert i magekreft cellelinjer (MKN-74, SGC-7901 og AGS), sammenlignet med de i normale mage epitelceller GES-1 celler. G og H, lavere MIR-9 uttrykk ble observert i mage kreft vev med høyere farging av cyclin D1 eller ETS1. Symbolene (* og #) viser en betydelig nedgang, og en betydelig økning fra GES-1, henholdsvis.
MIR-9 nedregulert uttrykk for cyclin D1 og ETS1 via post-transcriptional undertrykkelse
for å undersøke hypotesen om at Mir-9 kan påvirke uttrykket av cyclin D1 og ETS1 i magekreft, ble beregnings forutsigelse utført av miRNA databaser. Potensielle bindingsseter fra Mir-9 med høy komplementaritet ble registrert på baser 2974-2995 av cyclin D1 3′-UTR og 2648-2670 av ETS1 3′-UTR (Fig. 2A). For å undersøke de direkte effektene av MIR-9 på uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i magekreftceller, utførte vi miRNA over-uttrykk eksperimenter. Stabil transfeksjon av MIR-9 forløper til SGC-7901 og AGS celler resulterte i økning av MIR-9 nivåer (fig. S2). Western blot, RT-PCR og real-time kvantitativ RT-PCR viste at over-ekspresjon av MIR-9 resulterte i redusert protein og transkripsjonelle nivåer av cyklin D1 og ETS1 i magekreftceller enn det som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) ( fig. 2B fig. 2C, og fig. 2D). I tillegg, vil nivået av fosforylert retinoblastom (pRB, en nedstrøms effektor av cyclin D1) [21] og matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9, en nedstrøms gen av ETS1) [22] ble redusert i MIR-9 over-uttrykkende kreftceller (fig. 2B fig. 2C, og fig. 2D). For ytterligere å undersøke undertrykkende rolle MIR-9 i uttrykket av cyclin D1 og ETS1, utførte vi Mir-9 knockdown eksperimenter ved transfeksjon av anti-MIR-9 eller negativ kontroll (anti-NC) hemmere i GES-1, SGC -7901 og AGS celler. Transfeksjon av anti-MIR-9-inhibitor åpenbart minsket den endogene MIR-9 ekspresjon (Fig. S3A), og oppregulert proteinnivåer cyklin D1, pRb, ETS1 og MMP-9 enn de som er transfektert med anti-NC (fig. 2E og fig. S4A). Sanntids kvantitativ RT-PCR-analyser viste de forbedrede transkripsjonsnivåer av cyklin D1, ETS1 og MMP-9 i dyrkede celler transfektert med anti-MIR-9-inhibitor, i forhold til de transfektert med anti-NC (fig. 2F og Fig. S4B). Samlet er disse resultatene viste at Mir-ni betydelig hemmet uttrykk for cyclin D1 og ETS1 via post-transcriptional undertrykkelse.
A, ordning av de potensielle bindingsseter fra Mir-9 i 3′-UTR av cyclin D1 og ETS1, finne på baser 2974-2995 og 2648-2670, henholdsvis. B, stabil transfeksjon av MIR-9 forløper resulterte i redusert protein nivåer av cyclin D1, ETS1 og deres nedstrøms mål pRB og MMP-9 i magekreft SGC-7901 og AGS celler enn de transfektert med negativ kontroll vektor (mock). C og D, de transkripsjonsnivåer av cyclin D1, ETS1 og MMP-9 ble redusert i MIR-9 forløper-transfektert SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med de i mock celler. E, transfeksjon av anti-MIR-ni inhibitor (100 nmol /L) resulterte i økte proteinnivåer av cyclin D1, ETS1 og deres nedstrøms mål pRB og MMP-9 i SGC-7901 og AGS celler enn de transfektert med negativ kontroll inhibitor ( anti-NC, 100 nmol /L). F, de transkripsjonsnivåer av cyklin D1, ETS1, og MMP-9 ble økt i SGC-7901 og AGS-celler transfektert med anti-MIR-9-inhibitor (100 nmol /L), når sammenlignet med dem transfektert med anti-NC (100 nmol /L). Symbolene (* og #) viser en betydelig nedgang og en betydelig økning fra uekte eller anti-NC, henholdsvis.
MIR-9 direkte målrettet cyclin D1 og ETS1 i magekreftceller
for å finne ut om MIR-9 kan undertrykke uttrykk for cyclin D1 og ETS1 ved å målrette sine bindingssteder i 3′-UTR, PCR produktene inneholder intakte målområder eller mutasjon av MIR-9 frø gjenkjenningssekvenser (fig. 3A) ble innført i luciferase reporter-vektoren. Plasmidene ble transfisert inn i magekreftceller som er stabilt transfektert med negativ kontroll vektor (mock) eller MIR-9 forløper.
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter normalisert til de av Firefly ble betydelig redusert i SGC-7901 og AGS celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper (Fig. 3B), og disse effektene ble avskaffet av mutere den antatte MIR-9 bindingssteder innenfor 3′-UTR av cyclin D1 og ETS1 (fig. 3B). Videre knockdown av MIR-9 med anti-MIR-ni inhibitor økte luciferasepreparater aktiviteter i GES-en, SGC-7901 og AGS celler (Fig. 3C og S4C fig.), Mens mutasjon av MIR-9 anerkjennelse stedet avskaffet disse effektene (fig. 3C og S4C fig.). Resultatene indikerte at Mir-9 direkte og spesifikt interaksjon med målse i 3′-UTR av cyclin D1 og ETS1.
A, ordning og sekvens av intakt MIR-9 bindingssetet (Wt) og sin mutasjon (Mut) innenfor luciferaserapportørplasmid vektorer. B, stabil transfeksjon av MIR-9 forløper til SGC-7901 og AGS celler resulterte i redusert luciferasepreparater aktiviteter 3′-UTR reporter av cyclin D1 og ETS1 enn de transfektert med negativ kontroll vektor (mock), som ble avskaffet ved mutasjon i antatte MIR-9 bindingssteder. C, transfeksjon av anti-MIR-9-inhibitor (100 nmol /L) inn i SGC-7901 og AGS-celler økte luciferase aktiviteter enn de som er transfektert med anti-NC (100 nmol /L), mens mutasjon av MIR-9-gjenkjenningssete avskaffet disse virkningene. Symbolene (* og #) viser en betydelig nedgang og en betydelig økning fra uekte eller anti-NC, henholdsvis.
MIR-9 trykt
in vitro
spredning av magekreft cellene gjennom målretting cyklin D1
Siden ovennevnte bevis viste at MIR-9 inhiberte cyklin D1 uttrykk, og å kombinere de fakta som Cyclin D1 spiller en kritisk rolle i cellesyklusprogresjon og proliferasjon av kreftceller [21], vi videre undersøkt effekten av Mir-9 over-uttrykk og målet genet restaurering på dyrkede mage kreftceller. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR indikerte at transfeksjon av cyclin D1, men ikke fra ETS1, reddet MIR-9-indusert nedregulering av cyclin D1 (Fig. 4A og 4B fig.). I kolonidannelsesbestemmelsen, MIR-9 over-ekspresjon svekkede veksten av SGC-7901 og AGS-celler, sammenlignet med de som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) (Fig. 4C). Flowcytometri indikerte at Mir-ni over-uttrykk indusert cellesyklus arrest på G
0 /G
en fase i SGC-7901 og AGS celler (fig. 4D). I tillegg transfeksjon av cyclin D1, men ikke fra ETS1, i SGC-7901 og AGS celler restaurert spredning hemming og cellesyklus arrest indusert av over-uttrykk for MIR-9 (fig. 4C og fig. 4D). På den annen side, undersøkte vi effekten av MIR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Innføring av anti-MIR-9-inhibitor inn i disse cellene resulterte i forbedrede egenskaper i proliferasjon (fig. S3b), og cellesyklusprogresjon (fig. S3C). Resultatene indikerte at Mir-9 bemerkelsesverdig undertrykt
in vitro
spredning og cellecyklusprogresjonen av magekreftceller gjennom målretting cyclin D1.
A og B, western blot og real-time kvantitativ RT -PCR indikerte at transfeksjon av cyclin D1, men ikke fra ETS1, restaurert nedregulering av cyclin D1 indusert av MIR-ni over-uttrykk i magekreft SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med de som transfektert med negativ kontroll vektor ( mock). C, i kolonidannelse analysen, MIR-ni over-uttrykk svekkede veksten av SGC-7901 og AGS celler enn for mock celler, som ble reddet av transfeksjon av cyclin D1, men ikke fra ETS1. D, flowcytometri indikerte at Mir-ni over-uttrykk indusert cellesyklus arrest på G
0 /G
en fase i SGC-7901 og AGS celler enn i mock-celler, som ble reddet av transfeksjon av cyclin D1 , men ikke fra ETS1. Symbolet (*) viser en betydelig nedgang fra uekte.
MIR-9 svekket
in vitro
migrasjon og invasjon av magekreftceller gjennom målretting ETS1
siden tidligere studier indikerer de viktige rollene ETS1 i invasjonen og metastasering av kreft celler [23], [24], vi videre undersøkt effekten av MIR-ni over-uttrykk og målet genet restaurering på migrasjon og invasjon av magekreft SGC -7901 og AGS celler. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR indikerte at transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1, reddet MIR-9-indusert nedregulering av ETS1 (Fig. 5A og 5B fig.). I transwell migrasjon assay, gastrisk kreft celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper presentert en nedsatt migrasjon kapasitet enn det som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) (fig. 5C). I Matrigel invasjonen assay, MIR-ni over-uttrykk svekket invasive av SGC-7901 og AGS celler (Fig. 5D). I tillegg transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1, inn SGC-7901 og AGS cellelinjer restaurert Mir-9-meditaed hemming på migrasjon og invasjon (Fig. 5C og Fig. 5D). Videre undersøkte vi effekten av MIR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Transfeksjon av anti-MIR-9-inhibitor resulterte i forbedret migrering og invasjon av disse cellene (fig. S3D og S3E fig.). Resultatene indikerte at Mir-9 bemerkelsesverdig svekket
in vitro
migrasjon og invasjon av magekreftceller gjennom målretting ETS1.
A og B, western blot og sanntids kvantitativ RT-PCR indikert at transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1, restaurert nedregulering av ETS1 indusert av MIR-ni over-uttrykk i magekreft SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med de som transfektert med negativ kontroll vektor (mock). C, i transwell migrasjon analysen, mage kreft celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper presenteres en svekket migrasjon kapasitet enn i mock celler, som ble reddet av transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1. D, i Matrigel invasjonen assay, MIR-ni over-uttrykk svekket invasjonen mulighetene i SGC-7901 og AGS celler enn de av mock celler, som ble reddet av transfeksjon av ETS1, men ikke av cyclin D1. Symbolet (*) viser en betydelig nedgang fra uekte.
MIR-9 svekket vekst og metastasering av magekreftceller
in vivo
Vi neste undersøkt effekten av MIR-9 mot tumorvekst og metastase
in vivo
. Stabil transfeksjon av MIR-9 forløper inn i SGC-7901 eller AGS-celler resulterte i redusert vekst og vekten av subkutane xenograft tumorer i atymiske nakne mus, sammenlignet med de som er stabilt transfektert med negativ kontroll-vektor (mock) (fig. 6A og fig. 6B ). Dessuten ble ekspresjonen av cyclin D1, ETS1 og nedstrøms MMP-9 reduseres med stabil transfeksjon av MIR-9-forløper (fig. 6C). Den CD31-positive midlere fartøyet Tettheten ble redusert i løpet av tumorer som dannes ved injeksjon av kreftceller som er stabilt transfektert med MIR-9-forløper (fig. 6D). I de eksperimentelle metastase studier, SGC-7901 eller AGS celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper etablerte statistisk færre lungemetastatiske kolonier enn mock gruppe (Fig. 6E). Disse resultatene antydet at Mir-9 hemmet vekst og metastasering av magekreftceller
in vivo
.
A og B, sprøyte injeksjon av SGC-7901 eller AGS celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper inn i atymiske nakne mus (n = 5) resulterte i redusert størrelse og vekt av subkutane xenografttumorer enn de som er transfektert med negativ kontroll-vektor (mock, n = 5). C, hematoxylin og eosin (H E) og immunhistokjemisk farging viste at stabil transfeksjon av MIR-9 forløper resulterte i redusert ekspresjon av cyclin D1, ETS1, og MMP-9 i løpet av tumorer. Skala barer: 100 mikrometer. D, den CD31-positive gjennomsnittsfartøyet Tettheten ble redusert i løpet av tumorer dannet av kreftceller stabilt transfekterte av MIR-9 forløper. Skala barer: 100 mikrometer. E, i den eksperimentelle metastaser analysen, kreft celler stabilt transfektert med MIR-9 forløper etablerte lungemetastatiske signifikant færre kolonier (pilspisser) i atymiske nakne mus (n = 6). Skala barer: 100 mikrometer. Symbolet (*) viser en betydelig nedgang fra uekte.
knockdown av cyclin D1 og ETS1 phenocopied MIR-ni over-uttrykk hemming på spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller
in vitro
Siden ovennevnte resultatene indikerte negative regulering av cyclin D1 og ETS1 uttrykk ved MIR-ni, vi hypotese at knockdown av cyclin D1 og ETS1 kan utøve lignende effekter på dyrkede mage kreftceller. De små interfererende RNA (siRNAs) rettet mot koding regionen cyclin D1 og ETS1, si-CCND1 og si-ETS1, ble utformet og transfektert inn SGC-7901 og AGS celler. Transfeksjon av si-CCND1 og si-ETS1 resulterte i redusert ekspresjon av cyclin D1, pRB, ETS1 og MMP-9 i magekreftceller, respektivt, når sammenlignet med de som er transfektert med krafse siRNA (Si-Scb) (Fig. 7A, fig . 7D og S5) fig.. Knockdown av cyclin D1 trykt spredning og indusert cellesyklus arrest på G
0 /G
en fase i SGC-7901 og AGS celler (Fig. 7B og Fig. 7C). I tillegg knockdown av ETS1 i SGC-7901 og AGS celler resulterte i redusert mulighetene til migrasjon og invasjon (Fig. 7E og 7F fig.). Disse resultatene antydet at knockdown av cyclin D1 og ETS1 phenocopied (besatt lignende fenotyper til) MIR-ni over-uttrykk i hemme spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller
in vitro
.
A, transfeksjon av Si-CCND1 (100 nmol /L) i magekreft SGC-7901 og AGS celler resulterte i redusert uttrykk for cyclin D1 og dens nedstrøms mål pRB enn de transfektert med krafse siRNA (si-SCB, 100 nmol /L ). B, knockdown av cyclin D1 trykkes spredning av SGC-7901 og AGS celler enn de transfektert med si-Scb. C, knockdown av cyclin D1 indusert cellesyklus arrest på G
0 /G
1 fase enn de transfektert med si-Scb. D, transfeksjon av Si-ETS1 (100 nmol /L) inn i magekreftceller resulterte i redusert ekspresjon av ETS1 og dens nedstrøms genet MMP-9 enn de som er transfektert med Si-Scb (100 nmol /L). E, migrasjon mulighetene i SGC-7901 og AGS celler ble redusert med transfeksjon av si-ETS1 enn de transfektert med si-Scb. F, invasjonen mulighetene i SGC-7901 og AGS celler ble redusert med transfeksjon av si-ETS1 enn de transfektert med si-Scb. Symbolet (*) viser en betydelig nedgang fra SI-Scb.
Diskusjoner
Det har vært godt etablert at MIR-9 uttrykk profil i kreft er avhengig av vev distribusjon. I primære hjernesvulster, er MIR-9 forhøyet og fungerer som en viktig faktor i nevrale kreftutvikling [10]. MIR-9 er også over-uttrykt i livmorhalskreft [11], noe som tyder på sin svulst promoter rolle i tumorutvikling og progresjon. Imidlertid MIR-9 er nedregulert i flere humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [12], eggstokk-kreft [13] og tykktarmskreft [14], og er forbundet med den ondartede progresjon av brystkreft [25] og kolorektal kreft ( 14). Luo
et al.
Bemerket nedregulering av MIR-9 i 24 magekreft prøver [15], som deretter ble bekreftet i ni [16], 72 [17], og 13 [18] magekreft saker. Men Inoue
mfl.
Rapporterte oppregulering av MIR-9 i 5 magekreftpasienter ved real-time PCR-basert miRNA matriser [26], og dette annerledes funn i MIR-9 uttrykk profil kan skyldes til heterogenitet av begrensede eksemplarer. I denne studien viser vi at MIR-9 er betydelig nedregulert i 86 primærmagekreft prøvene enn i tilstøtende ikke-neoplastiske vev, noe som er i overensstemmelse med tidligere funn [15] – [18]. Viktigere, vi bekrefter også at Mir-9 uttrykk er omvendt assosiert med kliniske stadier, invasjon og metastasering av magekreft. Hos mennesker er moden MIR-9 kodet av tre uavhengige gener, MIR-9-1, MIR-9-2 og MIR-9-3, finne på kromosomene 1, 5 og 15, henholdsvis [27]. Tidligere studier viser at nedregulert MIR-9 uttrykk i magekreft skyldes avvikende hypermethylation av arrangøren regionen MIR-9 kodende genene [17]. Tilsvarende er avvikende hypermethylation av MIR-9 familie gener også rapportert i enkelte primære tumorer med lymfeknutemetastase, som tykktarmskreft, lungekreft, brystkreft, melanom og [14], [28]. Viktigere, denne studien rapporterte invers korrelasjon mellom MIR-9 nivåer og uttrykk for cyclin D1 og ETS1 i mage kreft vev, noe som tyder på at cyclin D1 og ETS1 kan bli negativt regulert av MIR-9.
Funksjonen og målgener av MIR-9 er tumorspesifikke og avhengig av mobilnettet sammenheng. MIR-9 er i stand til å undertrykke E-cadherin ekspresjon i brystkreft [29], noe som resulterer i den nukleære translokasjon av β-catenin og dens binding med transkripsjonsfaktorer T-celle-faktor /lymfoid enhancer faktor 1, og påfølgende oppregulert transkripsjon av gener som letter celleproliferasjon og angiogenese [29]. Tvunget MIR-9 ekspresjon i brystkreftcellelinjer resulterer også i betydelige uttrykk endring av multiple gener i p53-relaterte apoptotiske reaksjonsvei [30]. Gjennom direkte rettet mot NF-kB, ektopisk uttrykk for MIR-9 hemmer
in vitro Hotell og
in vivo
vekst av eggstokkreft celler [31] og vekst og metastasering av melanom [32] . I neuroblatoma, over-uttrykk for MIR-9 hemmer invasjonen, metastase, og angiogenese av tumorceller gjennom målretting matriksmetalloproteinase 14 [33]. Wan
et al.
Rapportert at over-uttrykk for MIR-9 hemmet
in vitro Hotell og
in vivo
veksten av adenokarsinom cellelinje MGC803 gjennom undertrykke NF-kB på post-transcriptional nivå [16]. Men i en fersk undersøkelse, Rotkrua
mfl.
Indikerte at Mir-9 kan være involvert i magekreftutvikling gjennom å nedregulere CDX2, og knockdown av MIR-9 redusert
in vitro
spredning av magekreft MKN-45 celler [19], mens funnene må styrkes ytterligere med MIR-ni over-uttrykk, target genet redning, og
in vivo
studier. I tillegg er det for tiden omstridt hvorvidt CDX2 spiller en onkogen eller tumor suppressor rolle i mave karsinogenese [34], [35]. Dessuten har de potensielle roller MIR-9 i invasjonen og metastasering av magekreft ikke klarlagt så langt. Dermed funksjons og direkte mål av MIR-9 i magekreft garanterer videre etterforskning.
I denne studien, viste vi at overuttrykk av MIR-9 svekket spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, som var lik som cyclin D1 eller ETS1 knockdown, noe som tyder på potensialet anvendelsen av MIR-9 som et mål for terapi av magekreft. I tillegg er våre data bekreftet at Mir-9 direkte målrettet cyclin D1 og ETS1 i magekreftceller gjennom 3′-UTR luciferase reporter analysen. Siden siste bevis viser at visse mirnas kan alternativt modulere genekspresjon ved å samhandle med arrangører [36] – [38], de potensielle roller MIR-9 i regulere transkripsjon av cyclin D1 og ETS1 gjennom samspill med arrangører fortsatt uklare, og garanterer vår videre etterforskning. Cyclin D1 er et proto-onkogen som tilhører familien av G
1 cykliner, og spiller en viktig rolle i cellesyklusen G
1 til S overgang ved å binde sine partnere cyclin avhengig kinase 4 og 6 for å fosforylere og inaktivere RB-proteinet [21]. Over-ekspresjon av cyclin D1 er en tidlig begivenhet i karsinogenese i humane kolorektale, esophageal og galleblæren kreft [39], og er en prognostisk indikator forbundet med dårlig overlevelse i spiserøret, bryst, og urin kreft [39]. Cyclin D1 over-uttrykk i humane kreftformer er belyst ved flere mekanismer, inkludert genomiske forandringer, post-transkripsjonsregulering, og post-translasjonell proteinstabilisering [39]. Nyere funn viser at Mir-16-1 undertrykker cyclin D1 uttrykk på post-transkripsjonsnivået via binding sin 3′-UTR i mantelcellelymfom [40]. I denne studien, våre funn viste at Mir-9-mediert hemming av cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon ble reddet av restaurering av cyclin D1 uttrykk i magekreftceller, noe som tyder på at identifisering av cyclin D1 som MIR-ni mål genet, kan forklare, i det minste delvis, hvorfor over-ekspresjon av MIR-9 undertrykkes spredning av magecancerceller.
ETS1, et medlem av ETS-familien av transkripsjonsfaktorer, bindes til spesifikke DNA-sekvenser som inneholder en GGAA /T kjernemotivet [22], og deltar i tumorinvasjon og metastase ved transkripsjonsregulering av flere gener som er ansvarlige for ekstracellulær matriks remodellering, migrering og invasjon, så som matriksmetalloproteinase og urokinase-plasminogen-aktivator [22]. Til dags dato har et økende antall kliniske studier vist de viktige rollene ETS1 i tumor utvikling og progresjon av ulike solide svulster [23], [24].
