Abstract
Prostatakreft er en ledende årsak til kreft dødsfall hos menn. Til tross for intensiv investering i å forbedre tidlig diagnostisering, rømming det ofte betimelig deteksjon. Dødeligheten er fortsatt høy i avansert stadium prostatakreft der palliativ omsorg er fortsatt det eneste alternativet. Effektive strategier er derfor nødvendig for å hindre forekomst og progresjon av sykdommen. Plantebaserte forbindelser har vært en viktig kilde til flere klinisk nyttige anti-kreft agenter og tilbyr en attraktiv tilnærming mot prostatakreft. Vi viste tidligere at metanol ekstrakt av maytenus royleanus (MEM) forlater og dens fraksjoner besitter betydelig antioksidantaktivitet med terapeutisk potensial mot frie radikaler tilhørende skader. Den foreliggende studien evaluerte den anti-proliferative aktivitet av MEM i prostata cancer modellsystemet. Analyse av MEM og dens forskjellige fraksjoner viste nærvær av triterpenoids, flavonoider og tanniner, konjugert til en eller flere polare grupper og karbohydratdeler. Videre studier mot kjente standarder etablert eksistensen av koffeinsyre og quercetin-3 rhamnoside i varierende konsentrasjon i forskjellige MEM fraksjoner. Tidsforløpet analyse av MEM behandlede prostata kreftceller er angitt betydelig reduksjon i celleviabilitet, bedømt ved MTT og klonogene overlevelsesanalyser. Dette ble fulgt av G2-fasen arrest av cellesyklus, nedregulering av cyclin /CDK-nettverk og økning av CDK-inhibitorer. MEM behandlede celler viste spaltning av Caspase-3 og PARP, og modulering av apoptotiske proteiner, etablere apoptose som den primære mekanismen for celledød. Spesielt MEM trykt AR /PSA signaliserer både i prostata kreft cellekulturer og i in vivo modell. Intraperitoneal injeksjon av MEM (1,25 og 2,5 mg /dyr) til atymiske nakne mus implantert med androgen sensitive CWR22Rν1 celler viste signifikant hemming i tumorvekst og redusert serum PSA nivå stempel in vitro funn. Til sammen våre data tyder på at MEM kan bli utforsket videre for sine potensielle terapeutiske effekter mot prostatakreft progresjon hos mennesker
Citation. Shabbir M, Syed DN, Lall RK, Khan MR, Mukhtar H (2015) Potent anti-Proliferativ, Pro-apoptotiske aktivitet av maytenus Royleanus Pakk mot prostata kreft celler: Bevis i
in-vitro Hotell og
in-vivo
Models. PLoS ONE 10 (3): e0119859. doi: 10,1371 /journal.pone.0119859
Academic Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN
mottatt: 12 september 2014; Godkjent: 17 januar 2015; Publisert: 23 mars 2015
Copyright: © 2015 Shabbir et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støtte ble gitt av National Institute of Health /National Cancer Institute RO1CA160867. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for fremgang i diagnose og behandling, forblir prostata kreft en av de vanligste helseproblemene som påvirker menn i løpet av livet. Faktisk prostatakreft er den nest største dødsårsaken blant menn i USA og mange vestlige land [1]. Nyere data prosjekt som prostata, lunge og tykktarm kreft vil utgjøre om lag halvparten av alle nydiagnostiserte kreft hos menn i 2014, med prostatakreft alene sto for om lag 1 i 4 tilfeller [2].
androgen reseptor (AR) som hører til kjernefysisk reseptor super familie spiller en viktig rolle i utvikling, funksjon og homeostase av prostata [3]. Tilstedeværelse av en ligand, slik som dihydrotestosteron (DHT) induserer fosforylering og konformasjonsendring i AR, noe som resulterer i sitt atomtrans, hvor det bindes til androgen responselementer på målgener og regulerer transkripsjon. Over-uttrykk for AR og oppregulering av sin transkripsjonen aktivitet er ofte observert i avansert prostatakreft [4, 5]. Androgen deprivasjon terapi er fortsatt den standard behandling for behandling av avansert sykdom. Til tross for en innledende positiv respons, nesten alle pasienter alltid utvikle seg til en mer aggressiv, kastrere bestandig fenotype. Studier av pasientprøver viser at AR er uttrykt i nesten alle kreft i prostata, både før og etter androgen ablasjon [6]. Faktisk har prostata-spesifikt antigen (PSA), som er kodet av en androgen-responsive-genet, blitt påvist i de fleste av hormon ildfast kreftformer, noe som indikerer at AR signalveien er likevel funksjonell i disse kreftformene [7].
Screening for PSA, i kombinasjon med digital rektal undersøkelse, og nål biopsi, har forbedret pasientenes overlevelse ved å tilrettelegge deteksjon av tidlig og lokalisert sykdom. Men det er fortsatt unnvikende kur for avansert og metastatisk sykdom [8]. Nåværende medisinsk behandling tilnærminger inkluderer kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, enten som monoterapi eller i multimodal tilnærming [8]. Rollen til diett i kreft hos mennesker har fått betydelig oppmerksomhet i de siste tiårene, og har resultert i et paradigmeskifte i vår forståelse av kreft forebygging og behandling. Det er nye bevis på at kosthold, fysisk aktivitet og kroppsvekt ofte betegnet energi balanse faktorer er viktige faktorer i å endre kreft progresjon, og kan være knyttet til økt risiko for kreft tilbakefall [9]. I dag er studier som gjennomføres for å øke vår forståelse av forholdet mellom kosthold og prostatakreft. Optimal ernæring kan redusere forekomsten av prostatacancer, og kan bidra til å redusere faren for dens progresjon. Inkludert fargerike, plantebasert mat og opprettholde en sunn vekt har blitt foreslått som viktige ernæringsstrategier for prostata kreft overlevende [10]. En fersk studie viste at lav prostata konsentrasjon av lykopen er knyttet til utvikling av prostatakreft hos pasienter med høy grad av prostata intraepitelial neoplasi [11]. Etterlevelse Middelhavet diett bestående av rikelig frukt, grønnsaker, belgfrukter, nøtter, uraffinert korn, olivenolje og moderate mengder fisk ble forbundet med lav total dødelighet etter diagnose av ikke-metastatisk prostatakreft [12].
maytenus royleanus tilhører familien spolebuskfamilien, en stor familie som består av ca 100 slekter og 1300 arter, utbredt i verden. Flere arter av maytenus har vært brukt i tradisjonell medisin, for behandling av gastrointestinale lidelser, feber, artritt etc. [13, 14]. De biologiske aktivitetene til maytenus arter er knyttet til tilstedeværelsen av forskjellige klasser av sekundære metabolitter slik som fenol-glukosider, flavonoider og triterpener [15]. I våre tidligere studier, viste vi at metanol ekstrakt av maytenus royleanus (MEM) forlater og dens avledede fraksjoner besatt betydelig antioksidantaktivitet med terapeutisk potensial mot frie radikaler tilhørende skader [15]. Her studerte vi effekten av MEM på prostata cancer celleproliferasjon og viser at MEM hemmer vekst og levedyktighet av både androgen sensitive og androgen uavhengig prostatacancerceller og utøver potent inhiberende virkning på AR /PSA aliserte både i in vitro-cellekulturer og i vivo tumorxenotransplantater.
Materialer og metoder
Material
Antistoffer mot CDK2, CDK4, CDK6, cyclin B1, cyclin D1, cyclin D2, cyclin E, p27, p21, PSA, Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), BCL-2, Bax, Bak, BCL-XL og AR ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-mus og anti-kanin sekundært antistoff pepperrot per-oksidase konjugat ble hentet fra Amersham Pharmacia biovitenskap. Bio-Rad DC Protein Assay Kit ble kjøpt fra Bio-Rad, CA. Novex prefabrikerte Tris-glysingeler ble oppnådd fra Invitrogen. Den annexin-V-FLUOS Farging Kit ble kjøpt fra Roche.
Utarbeidelse av planteekstrakt
Tørkede blader av MEM ble først pulverisert etterfulgt av to ekstraksjoner med 95% metanol. Filtrert MEM ble sprøytetørket og suspendert i 50 ml destillert vann, og fraksjoner ble fremstilt i 200 ml løsningsmidler med økende polaritet dvs. n-heksan, etylacetat og n-butanol. Hvert lag ble skilt med kraftig risting og løselig left ble brukt som vandige restfraksjon.
Phytochemical screening
[A] Væskekromatografi massespektrometrisk analyse.
MEM ble analysert ved LC-MS for å generere et fingeravtrykk av fytokjemikalier til stede i anlegget. Tørket prøve av MEM og dens forskjellige fraksjoner ble oppløst i 15 mg /ml metanol. Uoppløste partikler ble fjernet, og 10 ul av prøven ble underkastet kromatografi HILIC i negativ ionisering og revers fase (RP) både i positiv og negativ ionisering måter for å målrette flavonoider og fenoliske syrer. For HILIC separasjon, ble prøver kromatografisk løst med Phenomenex Luna HILIC, 3 um, 2x150mm kolonne på Agilent 1200 HPLC (Agilent, CA) med en auto-sampler holdt ved 5 ° C, ved hjelp av lineær gradient av 10 mM ammoniumformiat (pH = 4,5) i vann og 1 mM ammoniumformiat (pH = 4,5) i 99% acetonitril i løpet av 45 minutter. For positive RP separasjon, ble prøver kromatografisk løst med Agilent ZORBAX 300SB-C18, 1.8μm, 2.1x50mm kolonne på en Agilent 1200 HPLC (Agilent, Palo Alto, California) med en auto-sampler holdt på 5 ° C, ved hjelp av lineær gradient av 0,1% maursyre i vann og 0,1% maursyre i acetonitril over 60 min. For negativ RP separering, ble lignende instrument oppsett for positiv modus anvendt som ovenfor, mens endring av den mobile fasen til en lineær gradient av 10 mM ammoniumformiat (pH 6,5) i vann og 1 mM ammoniumformiat (pH 6,5) i 99% acetonitril i løpet av 45 minutter. Strømningshastigheten for begge separasjons modi var 250 uJ /min.
[B] Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) av planteekstrakt.
250 mg av plantepulver ble ekstrahert med 10 ml av 25% HCl og 25 ml kloroform. Ekstraktet ble filtrert og fortynnet til 100 ml. 10 ul av filtrerte prøver ble injisert i Agilent 1200 HPLC system. Separasjon ble utført gjennom en C18 kolonne utstyrt med et UV-VIS Spectra-Focus detektor, injektor og auto sampler). Trifluoreddiksyre og acetonitril ble anvendt som mobilfaser med strømningshastighet på 1 ml /min. Caffeic syre og quercetin 3-rhamnoside ble brukt som interne standarder for sammenlignende testing innenfor MEM fraksjoner. Kalibreringskurver ble generert for begge standard-forbindelser i området fra prøvemengde (0,02-0,5 ug). Alle forsøk ble utført in triplo.
Behandling av celler
C
4-2 og CWR22Rν1 humane nedbrutt carcinoma-celler ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection). Begge cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 (Life Technologies, NY) supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, med 5% CO
2, ved 37 ° C. MEM løst i DMSO ble benyttet for behandling av cellene. Celler i en sammenflytning på ~ 70% ble behandlet med MEM ved 10-100μg /ml i 24 timer i fullstendig cellemedium hvor den endelige konsentrasjonen av DMSO benyttet for hver behandling var mindre enn 0,1% (v /v).
Celleviabilitet assay
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromide (MTT) assay ble anvendt for å studere effekten av MEM på levedyktigheten til C
4-2, PC3, DU145 og CWR22Rν1cell linjer. Cellene ble sådd ut (1 x 10
4 celler per brønn) i 1 ml fullstendig dyrkingsmedium inneholdende 10-200μg /ml konsentrasjoner av MEM i 24-brønners mikrotiterplater. Etter inkubasjon i en fuktet inkubator i 24 timer ved 37 ° C, 200 ul av MTT (5 mg /ml: 1 x PBS) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i to timer, hvoretter 200 ul DMSO ble tilsatt. Platene ble deretter sentrifugert (1800 x g i 5 min ved 4 ° C). Absorbansen ved 540 nm ble registrert på en mikroplateleser. Effekten av MEM på veksthemming ble beregnet som% celleviabilitet hvor DMSO-behandlede celler ble tatt som 100% kontroll.
klonogene analysen
Effekten av behandlingen på klonogene overlevelse av prostata kreft celler ble bestemt ved anvendelse av kolonidannelse analysen. Både CWR22Rν1 og C
4-2-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner (20, 40 60μg /ml) av MEM i RPMI-1640 komplett medium. Etter behandling ble cellene på nytt platet i triplikat på en 6-brønners vevskulturplate med 5000 celler /brønn og dyrket i 5% CO2 ved 37 ° C i 8 dager med vekstmediet blir erstattet med /uten MEM hver 2 dager. Cellene ble deretter farget med 0,5% krystallfiolett (i metanol: H
2o, 1: 1), og bildene ble tatt med et digitalt kamera. Bildene ble forbedret ved hjelp av Adobe Photoshop for lysstyrke, kontrast og skjerpet for ensartethet av utseende.
Cellesyklus analyse /apoptose ved flowcytometri
CWR22Rν1 og C
4-2 celler behandlet med MEM (20-60μM: 24h) i fullstendig medium ble trypsinert og fiksert i 1% Paraformaldehyde: 1 x PBS i en time og vasket to ganger med kald PBS og sentrifugert. Pelleten ble suspendert i avkjølt 70% etanol og lagret over natten. Deretter ble cellene sentrifugert i 5 minutter ved 1000 rpm, og den oppnådde pellet ble vasket to ganger med kald PBS for å fjerne etanol. Cellene ble merket med FITC og propidiumjodid hjelp av Apo-Direct Kit (BD Pharmagen, CA) som per produsentens protokoll. Analysen ble utført med en FACScan (Becton Dickinson, NJ). Rundt 10.000 celler per prøve ble samlet og DNA-histogrammer ble analysert med ModFitLT programvare (Sannelig programvarehus, ME).
Protein utvinning og Western blot analyse
Etter behandling med MEM iskald lyse -buffer ble tilsatt til cellene (50nmol /l Tris-HCl, 150 mmol /liter NaCI, 1 mmol /liter EGTA, 1 mmol /liter EDTA, 20 mmol /liter NaF, 100 mmol /liter Na3VO4, 0,5% Nonidet P-40, 1% Triton X-100, 1 mmol /liter PMSF, pH 7,4) med proteasehemmere (Calbiochem, Tyskland) som var inkubert over is i 20 min. For vestlige blotting 8-12% poly akrylamidgeler ble brukt til å løse 40μg av protein, overført til en nitrocellulosemembran, undersøkt med passende monoklonale primære antistoffer, og oppdaget av chemiluminescence autoradiografi etter inkubasjon med spesifikke sekundære antistoffer.
genekspresjonsanalyser
Total RNA ble isolert fra celler ved bruk av et kommersielt RNeasy-sett (Qiagen, CA) RNA-konsentrasjonen ble målt spektrofotometrisk ved 260 nm, og cDNA ble gjort, som følge produsentens protokoll. Reaksjonsblandingen ble fremstilt inneholdende 10 ul Faststart Universal SYBR grønn Master (Roche, Tyskland), 6 pm revers primere, og 10 ug cDNA, med RNAase fritt vann tilsatt til et totalvolum på 20 pl. Forsterkningen og sanntids analyse ble utført i 40 sykluser med følgende faktorer; 95 ° C (10min) for å aktivere av Fast Start Taq DNA polymerase; 60 ° C (1 minutt) for forsterkning og sanntids analyse. Genuttrykket nivåer ble bestemt ved hjelp av
-ΔΔCT to. Primer-sekvens som ble anvendt var; AR Sense 5′-CTGGACACGACAACAACCAG-3 «; AR Antisense 5»- CAGATCAGGGGCGAAGTAGA-3 «; GAPDH Sense 5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3; GAPDH Antisense 5»-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 «.
Imunofluorescence mikros
C
4-2 og CWR22Rν1 celler ble sådd på en to-kammer vev kultur glass og behandlet med 40μg /ml MEM ved 70% konfluens i 24 timer. Etter vasking med PBS ble cellene fiksert med 2% paraformaldehyd fulgt av permeabiliseringen med metanol og blokkering med 2% serum. Inkubering med primære antistoffer over natten, etterfulgt av inkubasjon med passende fluoroforen merket sekundære antistoffer. Antifade DAPI (Invitrogen, NY) ble anvendt som monterings- og kontra medium. For analyse ble Bio-Rad Radiance 2100 MP Rainbow system for biologisk avbildning brukes. For å oppdage apoptotiske og nekrotiske celler Annexin-V-Fluos Farging Kit (Roche, Sveits) ble brukt i henhold til produsentens protokoll. Zeiss LSM 410 konfokalt mikroskop ble brukt til å måles fluorescens. Cellene farget med Annexin-V og ufargede celler i et valgt felt ble telt for å fastslå omfanget av apoptose og nekrose.
PSA ELISA
For kvantitativ måling av PSA nivåer i C
4-2 og CWR22Rν1 celler menneskelig PSA ELISA kit (Anogen, Ontario, Canada) ble brukt i henhold til produsentens protokoll.
Etisk erklæringen for dyreforsøk
atymiske nakne mus studier ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av dyr, og ble godkjent av Animal Care og bruk komité, School of Medicine og folkehelse, University of Wisconsin-Madison.
In vivo tumor xenograft modell
atymisk (nu /nu) mannlige naken mus hentet fra NxGen biovitenskap (San Diego, CA) ble holdt under patogen-frie forhold (12h lys /12h mørk tidsplan) og matet med en autoklaveres diett ad lib. Vi valgte CWR22Rν1 celler for bestemmelse av in vivo-effektene av MEM som disse cellene danner rask og reproduserbar tumorer i nakne mus. Implantasjon av CWR22Rν1 celler er også ansvarlig for sekresjon av betydelige mengder PSA i blodet av verten. Tumorxenografter i mus ble etablert ved subkutan injeksjon av CWR22Rν1-celler (1 x 10
6) blandes med Matrigel (Collaborative Biomedical Products, MA) i et forhold på 1: 1. Atten dyr ble tilfeldig valgt ut i tre grupper bestående av seks dyr hver. Den første gruppen av dyr som tjener som kontrollgruppe mottok DMSO intra-peritonealt (i.p.). Dyrene i gruppene 2 og 3 fikk i.p. injeksjon av MEM, 1.25mg og 2,5 mg pr dyr, henholdsvis, to ganger ukentlig og gjennom hele studien kroppsvekt, diett, og vannforbruket ble registrert. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen 0,5238 x L1 L2 x x H (L1 = lang diameter, L2 = kort diameter, og H = høyde av svulsten) og tumorstørrelsene ble målt to ganger ukentlig. Dyrene ble avlivet med CO2 innånding metoden følgende Arac retningslinjer, når tumorvolum nådde til ~ 1200mm
3. Blodprøver ble samlet ved underkjevens utfallende og serum separert fra fullblod ble lagret ved -20 ° C. Serum PSA-nivåene ble analysert ved hjelp av PSA-ELISA-sett som er beskrevet ovenfor. H E beiset lysbilder av lunge, nyre, lever, hjerte og hjerne var forberedt på å undersøke mulige toksiske effekter av MEM behandling
Immunohistochemistry
tumorvev seksjonene ble farget med hematoksylin og eosin for. morfologisk visualisering. Videre ble vev faste i 10% formalin utsatt for immunhistokjemisk analyse. I korthet etter deparaffinization i natriumcitratbuffer ble snittene inkubert over natten med antistoffer mot spaltede Caspase-3 og Histone 3-fosfat (H3-P) [1:75] (cellesignalisering, MA), etterfulgt av inkubasjon med passende HRP-konjugert sekundært antistoffer, diamminobenzidine /DAB (DAKO, CA) farging og teller farging med hematoksylin. Etter montering med Permount, ble deler dekket med dekkglass og farging ble analysert av en erfaren patolog blindet for behandlingsgruppene.
Statistical Analysis
All statistisk analyse ble utført med GraphPad prisme (San Diego , CA) og p-verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Phytochemical analyse av MEM
MEM sammen med n-heksan, butanol, etylacetat og vandige rest fraksjonene ble separert ved LC-MS-analyse. Denne teknikk ble primært anvendt for å generere et fingeravtrykk av fytokjemikalier sammensetningen av MEM. Ekstraktet synes å være en kompleks blanding av ukjente fytokjemikalier som vist i basistopp kromatogrammet for HILIC (-ve) Kromatogrammet (fig. 1). Den HILIC kjøring av MEM viste tilstedeværelse av 164 forbindelser basert på basis topper generert fra molar masse og retensjonstid på forbindelser (figur 1A;. Data vedlagt som S1_Dataset). Strekker seg i samme dataanalyse til de andre fraksjoner i modus HILIC (-ve), n-butanol fraksjonen inneholdt 79 Forbindelsene mens etylacetat og n-heksan-fraksjoner viste 69 og 40 henholdsvis forbindelser. C18 RP (-ve) kromatogram av gjenværende vandige fraksjon viste tilstedeværelse av 84 forbindelser, mens HILIC (-ve) viste 83 forbindelser. Basert på foreløpige bevis hentet fra LC-MS-data, som er skissert ovenfor (Fig. 1A), ble ytterligere analyser utført for å kategorisere konstituerende forbindelser av MEM, ved hjelp av UV-diode array-detektorer. Koffeinsyre og quercetin-3-rhamnoside ble identifisert ved å sammenligne deres UV-og MS-spektrene til de tilsvarende interne standarder. UV-spektra av n-heksan, etylacetat og n-butanol fraksjoner viste nærvær av koffeinsyre og quercetin-3-rhamnoside i varierende konsentrasjoner som indikerer at MEM har et høyt innhold av flavonoider med kjente anti-cancer-aktivitet (figur 1B;. S1 Fig ).
a. Tabellen viser totalt antall forbindelser som finnes i MEM og de forskjellige fraksjoner med HILIC og C18 RP-kromatografi, basert på retensjonstiden og molar masse; Total ionekromatogrammer av forskjellige fraksjoner: etylacetat fraksjonen (-ve HILIC); n-butanol fraksjon (-ve HILIC); n-heksan fraksjon (-ve HILIC); vandig fraksjon (ve HILIC); vandig fraksjon (ve C18 RP). b. UV-kromatogrammer av etylacetat n-heksan og n-butanol fraksjoner av MEM, ved 280, 320 370 nm, med koffeinsyre og quercetin-3 rhamnoside interne standarder.
MEM hemmer vekst og levedyktighet av prostata kreftceller
Siden begge disse forbindelser er kjent for å ha anti-kreft aktivitet spurte vi om uttrekket selv ville være mer effektiv i å hemme vekst og levedyktighet av prostatakreftceller. For å undersøke anti-proliferativ potensialet i MEM, utførte vi 3- (4, 5-dimethythiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse mot androgen-følsomme (C
4-2 og CWR22Rν1) og androgen-uavhengig (PC3 og DU-145) prostatakreftceller. Vi har observert at MEM behandling (10-180μg /ml etter 24 og 48 timer) for å prostatakreftceller forårsaket inhibering av cellevekst på en doseavhengig måte. Tidsforløpet analyse viste at det fantes bare en moderat forskjell mellom reduksjonen i cellelevedyktigheten av celler ved 24 og 48 timer, noe som tyder på at prostata kreftceller svare på MEM behandling innen 24 timer. Som vist i (Fig. 2A), IC
50 verdier av MEM-behandlede CWR22Rν1 var 47,4 42 ug /ml; for C
4-2, 52,8 44,4 ug /ml; for PC3, 61,8 36 ug /ml; og for DU145, 90,6 88,2 mikrogram /ml for henholdsvis 24 og 48 timer. Dataene antydet at androgen-sensitive C
4-2 og CWR22Rν1 celler viste litt bedre følsomhet for MEM behandling enn DU145 og PC3cells (Fig. 2A). Klonogene analysen ytterligere validert disse funnene hvor CWR22Rν1 og C
4-2 celler behandlet i syv dager med MEM på 20, 40 60 ug /ml viste en signifikant doseavhengig inhibering av kolonidannelse i forhold til ubehandlede kontroller (fig. 2B). De forskjellige fraksjoner av MEM separert på basis av polaritet i forskjellige løsningsmidler som n-heksan, etylacetat, n-butanol og vann ble også undersøkt for deres veksthemmende virkning på CWR22Rν1 celler. N-heksan og vandige fraksjoner viste seg å være mer potente til å inhibere proliferasjon av CWR22Rν1 celler (20 66.8μg /ml). (Fig. 2C)
a. Prostatakreftceller ble behandlet med MEM for 24 /48h, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Tabellen viser IC
50 av
CWR
22Rν1, C
4-2, PC-3 og DU145 på 24 og 48 timer. Gjennomsnitt ± SD av eksperimenter utført in triplo er vist. b. Doseavhengig effekt av MEM på clonogenecity av
CWR
22Rν1 og C
4-2 celler som oppdages av kolonidannelse analysen. Detaljer er beskrevet i material metoder. c. Virkning av forskjellige fraksjoner (n-heksan, etylacetat, n-butanol og vandige) på levedyktigheten av
CWR
22R ν1 celler, bestemt ved MTT-analyse. * P 0,05 og ** p. 0,01 ble ansett som statistisk signifikant
MEM induserer G2 fase arrestasjonen av prostata kreft celler
For å vurdere cellesyklusen profilen til MEM-behandlet prostatakreft kreftceller vi utført flowcytometrisk analyse, og observerte effekten av MEM på cellesyklusfordeling. En signifikant doseavhengig økning i cellepopulasjonen i G2-fasen av cellesyklusen ble observert som et resultat av MEM behandling i CWR22Rν1 og C
4-2 celler. G2 cellesyklus fasefordeling for C
4-2 var 25,7%, 44,61%, 59,52% og for henholdsvis CWR22Rν1was 38,6%, 47,72% og 57,72% ved 20, 40 og 60 pm konsentrasjoner av MEM (figur 3A.; S2 fig). Økningen i G2-fasen cellepopulasjonen var ledsaget av en samtidig reduksjon i G0 /G1 og S-fasen cellepopulasjon. Vi neste undersøkt effekten av MEM på cellesyklusregulerende molekyler operative i G2-fasen av cellesyklusen. Immunoblot analyse viste at MEM behandling til C
4-2 og CWR22Rν1 resulterte i redusert proteinuttrykk av CDK 2, 4 6 og Cykliner B1, D1, D2 E sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 3A og 3B;. Fig S3). Dette ble assosiert med merkbar induksjon av p21 og p27 i MEM behandlede celler (figur 3D;. S3 figur).
a.
CWR
22Rν1 og C
4-2 celler behandlet med MEM for 24 timer ble farget med propidiumjodid og analysert ved flowcytometri. Prosentandel av celle-populasjonen i G2-fasen av cellesyklusen er vist i boks av hvert histogram. Gjennomsnitt ± SD av eksperimenter utført in triplo er vist. b-d. Effekt av MEM behandling på cellesyklusregulerende proteiner: Hele cellelysater av
CWR
22Rν1 og C
4-2 celler med /uten MEM (20-60 mikrogram /ml: 24h) ble utsatt for SDS polyakrylamid gelelektroforese. Lik lasting ble bekreftet av reprobing med GAPDH. De immunoblotter vises er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
MEM induserer apoptose gjennom aktivering av indre og ytre vei
For å undersøke om den observerte nedgangen i celle levedyktighet er knyttet til induksjon av apoptose vi utførte Annexin farging av MEM behandlet prostatakreftceller. Vi brukte Annexin V-FITC merket til, som har en sterk og spesifikk affinitet for fosfatidylserin, for å overvåke translokasjon til plasmamembranen. MEM behandlede celler viste en signifikant økning i grønn fluorescens i motsetning til ubehandlede kontroller indikerer at behandling med MEM-indusert apoptose i prostatakreftceller (S4 Fig). Strømningscytometrisk analyse ble så utført for å kvantifisere antallet av celler som gjennomgår apoptose som et resultat av MEM behandling. En signifikant doseavhengig økning i populasjonen av apoptotiske celler ble observert i begge cellelinjer, et resultat av MEM behandling (figur 4A. Fig S4). Immunoblot-analyse ble anvendt ved å studere ekspresjonen av proteiner involvert i cellulær apoptose. Caspase-3 spiller medlem av caspase familien av aspartat-spesifikke cystein proteaser en sentral rolle i gjennomføringen av apoptotiske programmet. PARP-1 er en av flere kjente cellulære substrater av Kaspaser og spalting av PARP-1 ved Kaspaser er ansett å være et kjennetegn på apoptose [16]. MEM behandlede celler viste økt uttrykk av aktivert caspase-3; assosiert med PARP-spaltning (figur 4B;. S5 fig) videre validere at apoptose er den primære mekanismen for MEM-indusert celledød. For å undersøke om MEM indusert apoptose er mediert gjennom aktivering av indre eller ytre trasé vi neste undersøkt uttrykk for Kaspaser -8 og -9 i MEM behandlede celler. Vi har funnet en induksjon av caspase-8 spaltet i celler behandlet med 20, 40 og 60 ug /ml MEM (figur 4C;. S5 Fig). Samtidig reduksjon i pro-form av caspase-9 og bud i CWR22Rν1 og C
4-2 celler, post MEM behandling foreslått aktivering av både ytre og indre trasé av apoptose. Vi vurderte virkningen av ekstraktet på Bcl-2-familien av proteiner som er involvert i apoptose. MEM-behandlede celler viste en økning i ekspresjonen av pro-apoptotiske Bax og Bak og en nedgang i ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-X
L-proteiner (figur 4D;. S5 Fig).
a.
CWR
22Rν1 og C
4-2 celler behandlet med MEM (20-60 mikrogram /ml: 24h) ble merket med FITC og analysert ved flowcytometri. Prosentandel av apoptotiske celler med den tilsvarende dose av MEM er vist i hvert histogram. Gjennomsnitt ± SD av eksperimenter utført in triplo er vist. b-d. Hele cellelysater av
CWR
22Rν1 og C
4-2 celler med /uten MEM (20-60 ug /ml: 24 timer) behandling ble utsatt for SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Effekt av MEM behandling på proteiner som er involvert i apoptose veier. Lik lasting ble bekreftet av reprobing med GAPDH. De immunoblotter vises er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
MEM reduserer AR og PSA uttrykk i prostatakreftceller
Androgener spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av prostatakreft og PSA, er en velkjent androgen-responsive genet for tiden den mest aksepterte markør for vurdering av prostatakreft progresjon hos mennesker [17]. Effekten av MEM behandling på AR og PSA uttrykk ble undersøkt i CWR22Rν1and C
4-2 cellelinjer syssels immunoblotting og RT-PCR. En betydelig reduksjon i AR-protein-ekspresjon ble observert med MEM behandling (fig 5A og 5B,. S6 Fig). Immunfluorescens farging av CWR22Rν1 C
4-2-celler viste nedgang nukleær lokalisering av AR i MEM behandlede celler sammenlignet med kontrollen (Fig. 5B) sikret CWR22Rν1 og C
4-2 prostatakreftceller utviser høy proteinnivåer av intracellulært PSA, så dokumentert av en 34-kDa PSA band (fig. 5A). Den doseavhengig effekt av MEM på CWR22Rν1 og C
4-2-celler resulterte i en signifikant reduksjon i PSA-proteinnivåer på 20, 40 og 60 ug /ml konsentrasjoner (figur 5A;. S6 Fig). Nedgangen i protein uttrykk ble ledsaget av redusert transkripsjonsnivåer av AR i MEM behandlede celler (figur 5C,. S6 Fig). Vi videre fastslått utskilt PSA nivåer i CWR22Rν1 og C
4-2 cellelinjer, ansette den kvantitative sandwich-ELISA-teknikk. En betydelig reduksjon i PSA-nivået ble notert i begge cellelinjer med MEM (40 ug /ml) behandling (fig. 5D).
a. Hele cellelysater av
CWR
22Rν1 og C
4-2 celler med /uten MEM (20-60 ug /ml: 24h) ble underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese. Lik lasting ble bekreftet av reprobing med GAPDH. De immunoblotter vises er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater. b. c. d. e. b. c. d. b. b.
