Abstract
Kliniske studier har bekreftet sikkerhet selektivt onkolytiske adenoviruses for behandling av avansert kreft. Imidlertid kan stadig mer effektive virus resultere i mer toksisitet og derfor ville det være nyttig om replikasjon kan bli motvirket ved behov. Vi analyserte virus inneholdende den syklooksygenase-2 (COX-2) eller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) promoter for å kontrollere replikasjon. Anti-inflammatoriske midler kan senke Cox-2 protein nivåer, og derfor har vi en hypotese om at også arrangøren kan bli påvirket. Som Cox-2 modulerer uttrykk for VEGF, også VEGF arrangøren kan være kontrollerbar. Først vurderte vi effekten av anti-inflammatoriske midler på promoter aktivitet eller adenovirus smittsomhet
in vitro
. Videre, vi analyserte onkolytisk potens av virus
in vitro
og
in vivo
med og uten reagensene. Dessuten ble effekten av den virusreplikasjon analysert. Vi fant ut at RGD-4C eller Ad5 /3 modifiserte fibre forbedret onkolytiske potens av virus
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi har funnet at begge promotorer kan bli nedregulert med deksametason, natriumsalicylat, eller salisylsyre. Onkolytiske effekt korrelert med arrangøren aktivitet og
in vitro
virusproduksjon kan bli opphevet med stoffene.
In vivo
, så vi god terapeutisk effekt av virus i en modell av den intravenøse behandlingen av metastatisk kreft i livmorhalsen, men den hemmende effekten av deksametason var ikke sterk nok til å gi signifikante forskjeller i en kompleks
in vivo
miljø. Våre resultater tyder på at anti-inflammatoriske legemidler kan påvirke replikering av adenovirus, som kan være relevant i tilfelle replikering forbundet bivirkninger
Citation. Kanerva A, Lavilla-Alonso S, Raki M, Kangasniemi L, Bauerschmitz GJ, Takayama K, et al. (2008) Systemisk Terapi for livmorhalskreft med Potensielt regulerbar Onkolytiske adenovirus. PLoS ONE 3 (8): e2917. doi: 10,1371 /journal.pone.0002917
Redaktør: Alfred Lewin, University of Florida, USA
mottatt: 5 mai 2008; Godkjent: 07.07.2008; Publisert: 13 august 2008
Copyright: © 2008 Kanerva et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av EU FP6 THERADPOX og APOTHERAPY, Huch forskningsmidler (EVO), Sigrid Juselius Foundation, Academy of Finland, Emil Aaltonen Foundation, finsk Kreftforeningen, Universitetet i Helsinki, Sohlberg Foundation, Instrumentarium forskningsfond, finsk Oncology Association, Helsinki Biomedical Graduate skole, Helsinki Graduate school i bioteknologi og molekylærbiologi, finsk Cultural Foundation, stiftelsen av Bayer Schering Pharma, Deutsche Forschungsgemeinschaft /DFG og Biocentrum Helsinki Research. A.H. er K. Albin Johansson forskningsprofessor det finske Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
patogenesen av livmorhalskreft er preget av vedvarende infeksjon med høyrisiko humant papillomavirus (HPV), allment akseptert som kreves for livmorhalskreft innvielse. I en brøkdel av pasientene utvikler HPV infeksjon fra dysplasi og carcinoma
in situ
til invasiv kreft og metastatisk sykdom [1]. Bare noen få virusstammer er spesielt ansvarlig for livmorhals neoplasmer, hvorav HPV16 står for mer enn halvparten av anmeldte saker. Dessverre har verken forbedringer i kirurgi eller strålebehandling betydelig redusert dødelighet av pasienter med lokalavansert, residiverende eller metastatisk sykdom. The American Cancer Society anslår ca 9 700 nye tilfeller og 3 700 dødsfall i livmorhalskreft i 2006 [2]. Imidlertid gjenstår livmorhalskreft den ledende årsak til gynekologisk kreftdødelighet i verden med over 270 000 dødsfall i 2002 [3].
Adenoviral genterapi har blitt foreslått som en ny behandling alternativ for avansert kreft [4]. Imidlertid fortsetter effektiv tumor transduksjon å være det begrensende trinn for å oppnå kliniske resultater. Onkolytiske adenoviruser kan vise seg å være nyttig i denne forbindelse [5]. Disse virusene har en cytolytisk natur,
vil si.
Den replikative livssyklus viruset fører til vertscellen ødeleggelse. Modifikasjoner i det virale genomet redusere replikasjon i normale vev, mens tumorceller fortsetter å tillate produktiv replikasjon fører til kreftcellelyse (oncolysis). Type I onkolytiske adenoviruser har tap-av-funksjon mutasjoner i virusgenomet, som kompenseres ved mutasjoner i kreft, men ikke normale celler. Dette kan oppnås ved å inkorporere delesjoner i de tidlige adenovirus genene resulterer i mutante proteiner E1 ute av stand til å binde cellulære proteiner nødvendig for virusreplikasjon i normale celler, men ikke i kreftceller. I type II virus, svulst eller vev bestemt arrangører erstatte endogene viruspromotere som E1A promoter, for å begrense virusreplikasjon for å målrette vev uttrykker arrangøren.
Selv om kliniske studier har bekreftet sikkerhet onkolytiske adenoviruses for behandling av avansert kreft [6] – [9], de fleste studier har omtalt relativt svekkede virus. Således kan i økende grad effektive midler resultere i mer toksisitet og derfor ville det være nyttig om replikasjon kan bli motvirket ved behov. Genuttrykk fra enkelte arrangører kan reguleres. For eksempel, den tidlige vekstrespons gen 1 (
egr
-1) enhancer /promoter, har vært brukt som en regulerbar promoter for spesifikk ekspresjon av HSV-TK i glioma celler og kan induseres ved stråling [10] . En annen regulering strategi er bruken av hypoksi-induserbare promotorer [11]. Videre kan regulering oppnås med kjemisk induserbare promotere. For eksempel kan en tetracyklin-aktivert promoter brukes til å regulere genekspresjon og påfølgende proteinproduksjon ved oral tetracyklin. Tilbaketrekking av medikamentet hurtig opphever genekspresjon [12].
COX-2 er det hastighetsbegrensende enzym i prostaglandinsyntesen, og det er involvert i kontrollen av inflammatoriske reaksjoner som respons på skade eller infeksjon. Bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) har indikert at aktiviteten og også nivået av Cox-2 protein kan reguleres. Selv om andre faktorer enn promoteraktivitet ofte ha en rolle i protein ekspresjonsnivåer, har studier vist at aktiviteten av COX-2-promoteren korrelerer godt med proteinekspresjon [13]. Videre er aktiviteten av COX-2-promoteren i de fleste friske normale vev lav, med mindre den er indusert av vekstfaktorer (slik som VEGF), cytokiner eller tumor-spesifikke faktorer [14]. Når det gjelder adenovirus, den mest relevante organ for toksisitet er leveren. Derfor er det nyttig at hepatisk ekspresjon av COX-2 er lav, [15], [16]. Cox-2 kan ha en rolle i kreftutvikling av mange epiteliale kreftformer, og ekspresjonsnivåene har vært knyttet til tumor invasivitet og angiogenese [14]. Disse årsaker har ført til utnyttelse av Cox-2-promoteren som en tumorspesifikk promoter for kreft spesifikk ekspresjon [15] – [20]
VEGF har en viktig rolle i induksjon av tumor-assosiert angiogenese, som. det er en mediator av endotelial celleproliferasjon, differensiering og vaskulær permeabilitet [21]. VEGF er allment uttrykt ved tumordannelse, og det er oppdaget i de fleste ondartede epiteltumorer [18], [19], [21] Cox-2 eller vekstfaktorer som TGF-β1 kan regulere VEGF [22], [23]. Videre, voluminøse faste tumormasser inneholde hypoksiske områder, som har høye nivåer av HIF-1-transkripsjonsfaktor, som i sin tur induserer VEGF og Cox-2-ekspresjon [23]. Således blir reguleringen og ekspresjonen av COX-2 og VEGF koblet. Følgelig er det ikke er helt overraskende at også VEGF-promoteren har vist verktøy for tumorspesifikk ekspresjon [18], [19], [24]. En hittil uutforsket mulighet er regulering av Cox-2 og VEGF-promotorer av anti-inflammatoriske midler. Dette kan gi en sikkerhetsbryter i tilfelle av promoter-medierte bivirkninger i kliniske forsøk.
Kliniske livmorhalskreft prøvene uttrykker høye nivåer av COX-2, mens det er umulig å oppdage i normal epitel slimhinnen i livmorhalsen. Videre er det en progressiv økning av COX-2-nivåer avhengig av stadium av sykdommen, og også tumor størrelse. Cox-2 uttrykk er også en negativ prediktiv faktor for overlevelse [25], [26]. Med hensyn til VEGF og livmorhalskreft, har et høyt forbehandling nivå er funnet å assosiere med store svulster, stromal invasjon og bekken lymfeknutemetastase. VEGF ekspresjon korrelerer også med dårlig prognose [27] – [29]. Derfor er både arrangører tiltalende kandidater til livmorhalskreft spesifikke genterapi tilnærminger.
Sodium og salisylsyre er NSAIDs, som enzymatisk hemmer COX-2. Videre er det blitt rapportert at disse forbindelsene redusere COX-2-mRNA-nivåer, som kan bli formidlet gjennom modulering av promotoraktivitet [13], [30]. Deksametason er en anti-inflammatorisk steroid som inhiberer ekspresjon av begge Cox-2-mRNA og protein [30]. Videre kan post-transcriptional mRNA destabilisering være en viktig mekanisme i handlingen av deksametason [31]. TGF-β1 er et peptid vekstfaktor og anti-inflammatorisk cytokin som er produsert av mange celler, men er funnet mest konsentrert i pattedyrblodplater. Det kan modulere ved for eksempel celleproliferasjon og differensiering, angiogenese og metastase, og har vist seg å ha en virkning på COX-2-nivåer [32].
Vi antok at det kan være mulig å redusere adenovirus replikasjon med farmakologisk intervensjon. Nærmere bestemt, analyserte vi onkolytiske virus inneholdende den syklooksygenase-2 (COX-2) eller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) promoter kontrollerer ekspresjon av
E1A
, og evaluerte effekten av anti-inflammatoriske reagenser [natriumsalicylat, deksametason, salisylsyre og transformerende vekstfaktor-β1 (TGF-β1)] på oncolysis og replikering
in vitro Hotell og
in vivo
effekt. Som kontroller vi inkludert en Retinoblastoma (Rb) -p16 sti selektiv Δ24 basert type I onkolytiske virus [33] og en villtype adenovirus. Videre, som det har blitt tydelig at veldig avgjørende for effekten av replikere adenoviruses er genet levering effekt [34], vi utnyttet fiber modifisert, smittsomhet forbedret virus.
Resultater
smittsomhet av menneskelig livmorhalskreft cellelinjer
in vitro
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP cellelinjer C33A ble Siha, Caski og HeLa infisert med isogen luciferase uttrykker virus med enten adenovirus serotype 5 kapsid (Ad5luc1), en kimære kapsid med knott domene fra serotype 3 (Ad5 /3luc1) eller RGD-4C hovedkapsidproteinet modifikasjon (Ad5lucRGD). I tre av fire cellelinjer, infeksjon med Ad5 /3luc1 resulterte i 6 til 14 ganger høyere luciferase-ekspresjon i forhold til Ad5luc1 (5 000 viral partikkel (vp) /celle, Fig. 1 b-d). Men med C33A celler, som har høy uttrykk for Coxsackie-adenovirus reseptor [19], [35], Ad5luc1 var mest effektive (7-fold, Fig. 1a). Ad5lucRGD økte ikke smittsomhet av livmorhalskreftceller
in vitro
, unntatt i Siha celler (2,5 til 5,5 ganger ekstrautstyr, Fig. 1b).
(a-d) cellelinjene ble infisert med Ad5luc1, Ad5 /3luc1, og Ad5lucRGD. Luciferase-aktivitet er uttrykt som relative lysenheter (RLU) normalisert til total proteinkonsentrasjon. (E-h) Effekten av anti-inflammatoriske reagenser på transduksjon effekt av kapsidbindende modifisert adenovirus. Celler ble infisert i nærvær av stoffer. Verdien uten reagenser ble satt til en, og relative luciferase-verdiene er vist. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av tre forsøk ± standardfeil. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,0001
versus
Ad5luc1
effekten av anti-inflammatoriske reagenser på transduksjon effekt av kapsid modifisert adenoviruses
livmorhalskreft cellelinjer ble infisert med kapsidbindende modifiserte adenovirus i nærvær av stoffer. Som vist på fig. 1e-h, deksametason økt effektivitet transduksjon med alle virusene på Siha og Caski cellelinjer. Andre analyserte stoffene hadde bare mindre effekt.
Regulering av Cox-2 og VEGF arrangører med anti-inflammatorisk reagenser
transkripsjonen aktivitet av Cox-2 og VEGF arrangører ble evaluert i livmorhalskreftcelle linjer med og uten anti-inflammatoriske reagenser natriumsalicylat, deksametason, salicylsyre og TGF-β1 (fig. 2a-h). Ad5luc1, som inneholder en meget sterk CMV-promoter, ble anvendt for sammenligning, og relative luciferase-aktivitet er vist. Totalt sett, VEGF-promoteren induseres et høyere nivå av transgen ekspresjon enn Cox-2 (fig. 2b, d, f, h). Arrangøren uttrykk var godt i samsvar med tidligere data på Cox-2 og VEGF mRNA uttrykk i disse cellelinjer [19]. Selv om begge promotorer kan bli nedregulert med antiinflammatoriske substanser, VEGF var mer regelmessig påvirkes (fig. 2b, d).
Monolag ble preinkubert med reagenser, og C33A (a, b), Siha (c, d ), Caski (e, f) og HeLa (g, h) celler ble infisert med 1 000 viruspartikler (VP) /celle av Ad5luc1 (med CMV-kontrollerende luciferase), ble Adcox-2Mluc eller AdVEGFluc, og luciferase-ekspresjon analysert. Transgen ekspresjon nivå med COX-2 og VEGF-promotorer i forhold til CMV-promoteren (%). Hvert punkt representerer gjennomsnittet av fire forsøk ± standardfeil. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,0001
versus
ingen substans
onkolytiske adenoviruses vises effektiv avliving av livmorhalskreftceller
in vitro
monolag av livmorhalskreftceller ble infisert med onkolytiske adenovirus, vill-type virus og Ad5luc1, en
E1
-deleted kontrollvirus (fig. 3a-d). I alle cellelinjer, den kvantitative celledrepende analyse viste cytolyse med onkolytiske virus og villtype-virus, mens Ad5luc1 forårsaket minimal celledreping. På de fleste cellelinjer, oncolysis ble betydelig forbedret med replikerende virus i forhold til Ad5luc1. Videre oncolysis forårsaket av RGDCRADcox-2R var signifikant også på C33A og Caski cellene når en dose på 10 vp /celle ble anvendt (Fig. 3a, c). På alle cellelinjer, celledrepende med Ad5-Δ24RGD var sammenlignbare med vill-type adenovirus, mens effekten av RGDCRADcox-2R og Ad5 /3VEGF-E1 var svakere.
(a-d) Monolag ble infisert med RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD, vill-type adenovirus og Ad5luc1 (
E1
-deleted kontroll virus). Cellelevedyktigheten ble målt med MTS analysen. OD
490 verdier av uinfiserte celler ble satt som 100%. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av kvadruplikat-eksperimenter. (E-f) C33A celler ble injisert subkutant i nakne mus og avanserte tumorer fikk lov til å utvikle seg. Musene ble behandlet med enten (e) tre intratumorale injeksjoner av 1 x 10
9 virale partikler (VP) av Ad5luc1, villtype-virus eller onkolytiske adenoviruser på tre påfølgende dager, eller med (f) en enkelt intravenøs injeksjon av 1 × 10
11 vp. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,0001
versus
Ad5luc1. Linjene indikerer standard feil.
Onkolytiske adenoviruses levert terapeutisk effekt i murine livmorhalskreft modeller
in vivo
Avanserte subkutane C33A svulster ble behandlet med tre intratumorale injeksjoner av 1 × 10
9 vp av Ad5luc1, vill-type virus, Ad5 /3VEGF-E1, RGDCRADcox-2R eller Ad5-Δ24RGD på tre påfølgende dager, eller med en enkelt intravenøs injeksjon av 1 x 10
11 vp av samme virus. Behandling med onkolytiske virus ga betydelig terapeutisk effekt i begge modellene (figur 3e, f:
P
0,0001 for RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 eller Ad5-Δ24RGD
versus
Ad5luc1. ). Villtype adenovirus ikke vise en signifikant effekt på tumorvekst (
P
= 0,1471 og 0,8297
versus
Ad5luc1 for intratumorale og intravenøs modeller, henholdsvis).
Anti- inflammatoriske reagenser redusert oncolysis forårsaket av Cox-2 og VEGF promoter drevet onkolytiske adenovirus og villtype adenovirus
effekten av anti-inflammatorisk agenter på onkolytiske adenovirus og villtype virus ble analysert på C33A og Siha cellemonolagene. Ingen av de analyserte reagenser (deksametason, salisylsyre og natrium salicylate) forårsaket betydelig celle drap på egen hånd eller i kombinasjon med replikering mangel
E1
-deleted Ad5luc1 (Fig. 4a, e). Det celledrepende effekt av replikerende virus ble redusert med deksametason (fig. 4b, c, f-h), salisylsyre (fig. 4c) og natriumsalicylat (fig. 4f, g).
(a- h) cellemonolag ble preinkubert med stoffer, og C33A (a-d) og Siha (e-h) celler ble infisert med Ad5luc1, vill-type virus, Ad5 /3VEGF-E1 og RGDCRADcox-2R. Celledrepende effekt av replikerende virus ble redusert med deksametason (b, c, f-h) og natriumsalicylat (c, f, g). For å vise effekten av stoffene
per se
på celleoverlevelse, har en andre mock blitt lagt i paneler en og e. Y-aksen krysningspunkt indikerer celleviabilitet uten virus eller stoffer, mens «0» til høyre for det indikerer celle overlevelse uten virus, men med stoffer.
in vivo
effekten av deksametason på terapeutisk effekt av onkolytiske eller vill-type adenovirus. (I) Subkutan C33A livmorhalskreftsvulster fikk lov til å etablere og mus ble behandlet med en enkelt intravenøs injeksjon av 1 x 10
11 viruspartikler (VP) av onkolytiske virus eller ingen virus. I de RGDCRADcox-2R-grupper, ble 3 x 10
8 vp injisert intratumorally på dag 1, 3 og 5. I tillegg mottok musene intraperitoneal deksametason eller PBS. (J) human ovarian cancer (Hei) tumorer ble etablert i nakne mus, og behandlet med intratumorale injeksjoner med 3 x 10
8 vp av RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD eller ingen virus på dag 1 , 3 og 5. Musene fikk intraperitoneale injeksjoner av PBS eller deksametason daglig. Linjene indikerer standardfeil. Til tross for en tankevekkende trend på noen tidspunkter, fikk deksametason ikke påvirke veksten av svulster betydelig i overordnet analyse av enten modell. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,0001
versus
ingen substans. Linjene indikerer standard feil.
in vivo
effekten av deksametason på terapeutisk effekt av onkolytiske eller villtype adenovirus
Subkutan C33A livmorhalskreftsvulster fikk lov til å utvikle og musene ble behandlet med en enkelt intravenøs injeksjon av 1 x 10
11 vp av Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD eller ingen virus. I de RGDCRADcox-2R-grupper, ble 3 x 10
8 vp injisert intratumorally på dag 1, 3 og 5. Deretter ble musene randomisert til intraperitoneal deksametason eller PBS behandling (fig. 4i). Ad5-Δ24RGD ble anvendt som en modell av et onkolytisk viruset uten en vevsspesifikk promoter. Villtype virus kunne ikke brukes fordi den ikke gi noen effekt i modellen (Fig. 3). Til tross for noen lovende riktignok mindre trender, gjorde deksametason ikke påvirke tumorvekst signifikant (
P
= 0,5726 til 0,9909
versus
virus bare). Men alle onkolytiske adenoviruses fortsatte å vise anti-tumor effekt som i forrige eksperiment (alle
P
0,0001
versus
mock)
For å se om vi kunne. erte ut replikering dempe effekten av deksametason i et raskt voksende og svært aggressiv subkutan modell, brukte vi Hey eggstokkreft celler (fig. 4J). Tidligere arbeid antydet at virusene som brukes her vil replikere i Hei-celler [36], [37]. Xenotransplantater ble behandlet med intratumorale injeksjoner med 3 x 10
8 vp av virus eller ingen virus på dagene 1, 3 og 5. mus mottok intraperitoneale injeksjoner av PBS eller deksametason daglig, og tumorvekst ble fulgt. Igjen, selv om det var et forslag fra demping av virusreplikasjon (
dvs.
Større svulster), deksametason hadde ingen signifikant effekt på terapeutisk effekt av analysert virus (
P
= 0,8897 til 0,9441). Den antitumor effekt av onkolytiske adenoviruses fortsatte å være vesentlig i forhold til mock-behandling (alle
P
0,0001)
Effekten av deksametason på replikering av Cox-2 og VEGF promoter drevet onkolytiske. adenovirus og villtype adenovirus om livmorhalskreftceller
in vitro
Vi analyserte
in vitro
produksjon av viruspartikler av RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 og vill -type adenovirus i Siha-celler med og uten deksametason behandling (fig. 5a-c). Totalt sett deksametason redusert replikering av analysert virus. Replikering av RGDCRADcox-2R ble redusert 2-, 7- og 10-fold på 24, 60 og 96 h, henholdsvis (fig 5a:
P
0,0001 ved 60 h.). En lignende, men svakere effekt ble sett med Ad5 /3VEGF-E1 (fig 5b. 01.05 til 03.05-fold,
P
= 0,0640 ved 96 h). Replikering av en villtypevirus ble betydelig redusert ved 96 h (fig 5c: 40 ganger
P
0,0001.)
(a-c) Siha livmorhalskreft monolag var. infisert med virus alene (10 viral partikkel (vp) /celle) eller i kombinasjon med deksametason, og virusproduksjon ble analysert ved hjelp av plakk-analyse. Til tross for en klar trend på tidlige tidspunkter, var det ingen statistisk signifikant effekt av deksametason på
in vivo
replikering grunn av større variasjon
in vivo
(d-f). Humane eggstokkreft tumorer ble etablert i nakne mus og behandlet med en enkelt intratumoral injeksjon av 3 x 10
8 vp. Mus mottok intraperitoneale injeksjoner av deksametason eller PBS daglig. Fire tumorer /gruppe ble høstet på dagene 2 og 4, og mengden av infeksiøse partikler ble analysert ved TCID
50. ***
P
0,0001
versus
virus alene. N.A. = ikke analysert. Linjene indikerer standard feil.
Effekten av deksametason på replikering av Cox-2 og VEGF promoter drevet onkolytiske adenovirus og villtype adenovirus på kreftceller
in vivo
Regulering av replikasjon av deksametason
in vivo
ble analysert med subkutane menneskelige eggstokkene Hey adenokarsinom svulster behandlet med intratumorale injeksjoner på dag 0. Halvparten av musene fikk intraperitoneale injeksjoner av deksametason daglig. Tumorer ble analysert på dagene 2 og 4. Selv om deksametason redusert replikasjon av Ad5 /3VEGF-E1 og villtypevirus ved tidlig tidspunkt, var forskjellen ikke statistisk signifikant (fig. 5d-f, all
P
= 0,1283 til 0,6144).
Diskusjoner
Fordi det primære adenovirus reseptoren kan være ofte fraværende eller uttrykt abnormt i avanserte svulster [34], vi først analysert
in vitro
transduksjon effekt av fiber modifisert, infektivitet forbedret adenovirus-vektorer som uttrykker den luciferase-transgenet (fig. 1). RGD-4C modifikasjon ikke synes å være svært effektive i å øke genoverføring, men AD3 reseptoren målrettet på nytt virus var ganske effektiv i tre av fire cellelinjer (Fig.1a-d). Videre vurderte vi effekten av anti-inflammatorisk reagenser på transduksjon effekt, og funnet noen økning i transgene uttrykk etter behandling med deksametason på to av fire livmorhalskreft cellelinjer (figur 1 f, g) Som en viktig faktor for effekten av onkolytiske adenoviruser er infektivitet [34], benyttet vi genetiske fiber modifikasjoner for å forbedre celledrepende effekt. Vi har evaluert
in vitro
cytolytisk styrken av disse onkolytiske adenoviruses i livmorhalskreft cellelinjer, og funnet sammenheng mellom onkolytiske potens, genet levering og promoter aktivitet,
dvs.
sterkere arrangøren og høyere smittsomhet, jo sterkere var onkolytiske potens (fig. 3a-d).
Enda viktigere, alle de analyserte onkolytiske adenoviruses hadde statistisk signifikant terapeutisk effekt i både lokale og systemiske behandlingsskjemaer av murine livmorhalskreft xenografter (fig. 3e, f). Noe variasjon i effekt ble sett mellom
in vitro Hotell og
in vivo
resultater med noen av virus. Dette kan komme senere funn som tyder på at mens genet levering
in vitro
meste avhenger primære adenovirus reseptorer, biotilgjengelighet problemer ser ut til å dominere med hensyn til
in vivo
effekt. For eksempel er det i økende grad akseptert at mens binding til CAR er en viktig faktor for transduksjon
in vitro
, andre regioner av fiber kan være enda mer relevant
in vivo product: [38]. Parallelt med tidligere funn med andre cellelinjer [37], [39], villtype adenovirus var ikke effektive på C33A celler
in vivo
, til tross for aktivitet
in vitro
. Selv om vi antar at dette er relatert til forskjeller mellom
in vitro Hotell og
in vivo
miljøer (f.eks. Stroma, blodkar, reseptor uttrykk), ytterligere arbeid er nødvendig for å avklare saken.
Når Cox-2 og VEGF promoter drevet transgene uttrykk ble evaluert, både arrangører ble funnet aktiv i livmorhalskreft cellelinjer. Totalt sett VEGF promoter aktivitet var høyere enn Cox-2 i alle cellelinjer, og kan sammenlignes med tidligere data [19]. Viktigere, har tidligere studier har rapportert at normale leverceller ikke uttrykke VEGF [40]. Også COX-2 nivåer sett i livmorhalskreftcellene var høyere enn det som er blitt rapportert for leveren tidligere [16]. Betydelig reduksjon av VEGF-promoteren mediert luciferase-ekspresjon ble observert med natriumsalicylat, deksametason og salisylsyre (fig. 2b, d). Natriumsalicylat også redusert Cox-2 promoter styrt transgene ekspresjon (Fig. 2e).
Når celledrepende forsøk ble utført i nærvær av antiinflammatoriske midler, dexametason og natriumsalicylat var effektive i å redusere oncolysis (fig. 4). Interessant nok effekten ble ikke begrenset til onkolytiske adenovirus, men også villtypevirus som vises svakere cytolyse når deksametason var til stede. Dermed kan effekten ikke være helt knyttet til promoteren styring av replikasjon, men et mer generelt fenomen i viral replikasjon kan også involvert. En årsak til redusert replikasjon kan være nedregulering av de relevante reseptorer som er nødvendige for infeksjon. Tidligere har vi og andre analyserte modulering av adenovirus primær reseptor ekspresjon på celleoverflaten ved hjelp av forskjellige substanser inkludert et antall av kjemoterapeutiske og anti-inflammatoriske reagenser. Vi fant ingen effekt på reseptor nivå, som vurderes av flowcytometri analyse, etter deksametason behandling, mens andre oppdaget en liten reduksjon i nivået på både primær reseptor og a
vp inte [41], [42].
virkningen av deksametason på serotype 3-reseptoren ikke var blitt undersøkt, og heller ikke hadde cellelinjene som brukes her er undersøkt før med hensyn til de andre relevante adenovirus-reseptorer. Vi analyserte derfor effekten av substansene på genavlevering og funnet at i noen tilfeller luciferase-ekspresjon ble øket (fig. 1E-h). Dermed reduseres replikering sett her var nok ikke på grunn av reseptor downregulation.
En annen mekanistisk mulighet kan innebære induksjon av Cox-2 av virusreplikasjon
per se
. Med hensyn til herpes, cytomegalovirus, og andre DNA-virus, er det blitt vist at virus infeksjon induserer Cox-2 [43], [44]. Videre er det funn at inhibering av COX-2 reduserer replikasjon av disse virusene antyder at Cox-2-induksjon er gunstig for virus forplantning. Disse virusene kan utnytte den anabole effekten av Cox-2 for optimalisering av deres replikering effekt. Foreløpige data tyder på at det samme kan også være tilfelle for adenovirus, som kan hjelpe til å forklare hvorfor den onkolytisk effekten av vill-type adenovirus ble dempet ved deksametason [45].
Selv om oncolysis er sannsynlig å korrelere med replikasjon av virus, vi undersøkte dette separat. Som ventet ble virusreplikasjon redusert med deksametason behandling
in vitro plakater (Fig. 5a-c). Dette synes å støtte den teoretiske antagelsen om at oncolysis er tett knyttet til virusreplikasjon. Som menneskelige adenovirus ikke replikere produktivt i murine normalt vev [46], menneske xenograft i mus ble benyttet for replikering demping
in vivo
studier. I disse modellene, hvis replikasjon og /eller celledrepende effekt er redusert
in vivo
med deksametason, svulster i mus behandlet med virus og deksametason ville være større enn virus bare behandles. I begge modellene studert Deksametason ikke i betydelig grad redusere den antitumor effekt av de analyserte onkolytiske adenoviruser, til tross for en trend i den retningen (fig. 4i-j, alt
P
≥0.1654). Til slutt, analyserte vi mengden av infeksiøse partikler i subkutane tumorer med og uten deksametason behandling (fig. 5d-f). Til tross for en trend fremtredende på tidlige tidspunkter, ble ingen signifikante forskjeller sett, noe som kan være forårsaket av varierende typisk for
in vivo
eksperimenter.
Den mest sannsynlige årsaken til avviket mellom den observerte
in vitro Hotell og
in vivo
effekten av deksametason på onkolytiske potensialet av virus kan relateres til høyere kompleksitet
in vivo
modeller. Disse kompleksiteten ble godt demonstrert i en fersk studie hvor en økning i VEGF nivåer i Cox-2 positive og COX-2 negative kreft i bukspyttkjertelen celler ble observert etter behandling med høye konsentrasjoner av COX-2-hemmere, som tyder på at forholdet mellom Cox-2 protein hemming og VEGF eller Cox-2 promoter uttrykk kan ikke alltid være tett knyttet [47]. I motsetning til forventningene, både Cox-2 positive og negative
in vitro
modeller vises økte nivåer av VEGF følgende Cox-2 hemming. Men i Cox-2 positiv tumor
in vivo
modell, uttrykte ikke-ondartede celler et betydelig redusert nivå av murine VEGF fører til redusert total VEGF og tumor angiogenese og vekst, mens COX-2 negative svulster vises økt tumorvekst. Disse resultatene antyder også at tumoren stroma kan ha en stor effekt på ekspresjon av COX-2 og relaterte faktorer.
Et annet aspekt vedrører den ikke-lineært forhold mellom E1A nivå og effekt av virusreplikasjon. Klassiske studier tyder på at svært variable E1A nivåer tillate effektiv replikering uten direkte sammenheng mellom E1A uttrykk og virusproduksjon [48]. Det er således fullt mulig, at selv om E1A ekspresjon ble påvirket på grunn av deksametason hemme promotere, var effekten ikke dramatisk nok til å bli sett på som en forskjell i tumorvekstkurver. Deksametason regulerer flere komponenter av både medfødte og adaptive immunitet.
