Abstract
Aktivering av stamcelle transkripsjonen krets er en viktig begivenhet i kreftutvikling. Selv om kreftceller demonstrere en stamcelleliknende genekspresjon signatur, forblir epigenetisk regulering av pluripotency-assosiert gener i kreft dårlig forstått. I denne studien karakteriseres vi epigenetisk regulering av pluripotency-assosiert gener
Nanog
,
OCT4
,
c-MYC
,
KLF4
, og
SOX2
i en rekke kreftcellelinjer og i primærtumorprøver, og undersøkte re-aktivering av pluripotency reguleringskretser i kreft progresjon. Differential mønstre av DNA-metylering, histonmodifikasjonene, og genekspresjon av pluripotent gener ble demonstrert i forskjellige typer kreft, noe som kan reflekterer deres vev opprinnelse.
Nanog
promoter hypometylering og genet oppregulering ble funnet i metastatisk menneskelige leveren kreftceller og menneskeleverkreft (HCC) primær tumor vev. Den oppregulering av
Nanog
, sammen med p53 utarming, var signifikant assosiert med klinisk sent stadium av HCC. En pro-metastatisk rolle Nanog i tykktarm kreft celler ble også vist, ved hjelp av en
Nanog
-overexpressing orthotopic tumorimplantering musemodell. Demetylering av
Nanog
promoter ble observert i CD133 +
høy kreftceller. I samsvar, overekspresjon av
Nanog
resulterte i en økning i bestanden av CD133 +
høye celler. I tillegg viste vi en cross-regulering mellom
OCT4 Hotell og
Nanog
i kreftceller via omprogrammering av arrangøren metylering. Til sammen epigenetisk omprogrammering av
Nanog
kan føre til oppkjøpet av stamcelleliknende egenskaper. Disse resultatene understreker restaurering av pluripotency kretser i kreftceller som en mulig mekanisme for kreft progresjon
Citation. Wang XQ, Ng RK, Ming X, Zhang W, Chen L, Chu ACY, et al. (2013) epigenetisk regulering av Pluripotent Gener formidler Stem Cell funksjoner i menneskelige leverkreft og kreft cellelinjer. PLoS ONE 8 (9): e72435. doi: 10,1371 /journal.pone.0072435
Redaktør: Anil Kumar Tyagi, Universitetet i Delhi, India
mottatt: 02.05.2013; Godkjent: 10.07.2013; Publisert: 04.09.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Seed Virkemidler for Basic Forskning ved University of Hong Kong (11159149) og General forskningsfond av Hong Kong stipend Council (HKU778809M) til Wang XQ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetiske endringer betraktes som potente surrogater for mutasjoner i dereguleringen av vekstfremmende gener og tumor-suppressor-gener [1], [2]. Det er blitt foreslått at fremgangsmåten innbefatter karsinogenese epigenetiske endringer i spindel /stamceller før gatekeeper genmutasjoner forekomme [1], [3], [4]. Denne prosessen kan antagelig påvirke både genetisk og epigenetisk plastisitet av en celle og tillate oppkjøpet av «stemness» funksjoner, som for eksempel invasjonen, metastaser og medikamentresistens, under kreft progresjon [1], [2]. Videre ble genomisk ustabilitet forårsaket av global DNA hypometylering funnet å være en av de tidligste endringer i utviklingen av kreft hos mennesker [2], [5].
Mens overekspresjon av
OCT4
,
SOX2
,
KLF4 Hotell og
c-myc
gener indusere pluripotency i somatiske celler som fører til dannelsen av embryonale stamceller (ESC) -lignende induserte pluripotente stamceller (iPSCs) [6] – [8], er det interessant å merke seg at ESC-lignende transkripsjonen program er ofte aktivert i forskjellige humane epiteliale cancere [9], [10]. En slik ESC-lignende genet modulen ble også assosiert med sykdomsprogresjon, f.eks metastase, og tidlig dødelighet av brystkreft [9] og blærekreft [11]. Det er derfor antyder en felles molekylreaksjonsvei som er involvert i både IPSC derivasjon og kreft stamcelle (CSC) initiering [12]. Dessuten har nylige studier vist at iPSCs beholde epigenetisk hukommelse, slik som DNA-metylering signatur, fra deres vev opprinnelse [13], [14], noe som indikerer viktigheten av epigenetisk regulering i cellen skjebne omprogrammering og tumorigenesis [15], [16].
Selv om stamcelleliknende genet nettverk har blitt vist i kreft [11], forblir sammenslutning av epigenetisk omprogrammering og CSC egenskaper dårlig forstått. Her undersøkte vi epigenetisk regulering av pluripotency-assosiert gener
Nanog
,
OCT4
,
c-MYC
,
KLF4
, og
SOX2
, og deres sammenheng med genuttrykk i kreftcellelinjer og primærtumorprøver. Vi videre undersøkt sine potensielle roller i prosessen med metastaser og i initiering av cscs under tumorprogresjon.
Materialer og metoder
Prøver
Paret ikke-tumor og svulstvev eksemplarer av leverkreft (HCC) ble samlet inn fra femten HCC pasienter diagnostisert med stadium i-IV patologisk tumor node-metastaser (TNM) sykdom [17]. Normale leverprøver ble oppnådd fra avdød lever givere. Alle prøvene ble levert av Tissue Bank of divisjoner av Hepatobiliær og bukspyttkjertelen kirurgi og levertransplantasjon ved Kirurgisk avdeling, Queen Mary Hospital. Innsamling og oppbevaring av kliniske prøver for Tissue Bank har blitt godkjent av Institutional Review Board ved University of Hong Kong /Hospital Authority of Hong Kong. Normal hepatocytter og HCC cellelinjer inkludert Miha og L02 (normale hepatocytter); PLC (primær HCC); og MHCC97L (97L) og MHCC97H (97h), ble hentet fra metastatisk HCC [18]. Andre ikke-HCC kreft cellelinjer inkludert HeLa (cervix adenokarsinom); MCF7 (bryst adenokarsinom); AGS (adenokarsinom); HCT116 (kolorektal kreft); og K-562 (kronisk myelogen leukemi). PLC, HeLa, MCF7, AGS, og HCT116 linjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). L02 ble oppnådd fra Kina senter for Type Culture Collection.
Genomisk DNA
Totalt genomisk DNA ble isolert fra perifert blod mononukleære celler (PBMC), cellelinjer, og ikke-tumor og tumor leverprøver fra HCC pasienter, ved hjelp av QIAamp DNA mini kit (Qiagen).
bisulfite sekvense analyse
Genomisk DNA ble behandlet for sulfitt konvertering av unmethylated cytosines bruker EpiTect bisulfite kit (Qiagen). Den sulfitt-modifiserte DNA ble brukt for PCR med primere som anerkjenner de konverterte DNA-sekvenser (figur 1A Figur S1 i File S1, Tabell S1). PCR-produkter ble klonet inn pGEM T-Easy vektor (Promega Bioscience). Ti kloner ble tilfeldig plukket og sekvensert. DNA-sekvenser ble analysert med BIO Analyzer (https://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de) for CpG lesing. Prosent av metylering refererer til antall denaturert CPGs enn det totale antall CPGs i regionen analysert.
(A) Skjematisk fremstilling av genet regulatoriske regioner av
Nanog
,
OCT4
og
c-MYC Hotell som ble undersøkt av bisulfite sekvensering (BIS) (røde søyler) og chip (grønne søyler) eksperimenter. (I)
Nanog
proksimale promoter regionen dekker 10 CpG sider fra -1449 til -952. (Ii)
OCT4
promoter regionen er dekket av 8 primerpar for 50 CpG nettsteder fra -2973 til 320. (Iii)
c-MYC
genet region er dekket av BIS primere for CpG øyer før TSS1 og TSS2, og CpG områder innenfor Exon 2 og 3; og chip primer for Exon 3. (B) Bisulfite sekvense analyse av
Nanog
promoter i kreftcellelinjer. DNA-metylering frekvens er presentert som prosentandeler i: normal lever (L02) og kreft i leveren (PLC, 97L, og 97h) celler (blå); normal PBMC og leukemi K-562 celler (orange); og i HeLa, MCF7-, HCT116 og AGS kreftceller (grønt). (C) Klonal
Nanog
arrangøren metylering mønstre i 97L, HeLa og K-562 celler. Åpne sirkler representerer unmethylated CPGs; lukkede sirkler representerer denaturert CPGs. (D) Metylering frekvensen til
OCT4
proksimale promoter (-530 til 7) i: normale og kreftleverceller (blå); og i HeLa og HCT116-celler (grønn). (E) DNA-metylering frekvens på oppstrøms og nedstrøms områder av
OCT4
i normale og kreftleverceller. «Samlet» dekker 50 CpG sider fra -2973 til 320; «5» TSS «dekker 10 CpG områder fra -530 til 7; og «3» TSS «dekker 12 CpG sider fra 61 til 320. (F) Metylering hyppigheten av ekson 3 av
c-MYC plakater (10 CpG nettsteder) i: normale og kreftleverceller (blå); PBMC og leukemiske K-562 celler (orange); og i HeLa, MCF7-, HCT116 og AGS kreftceller (grønt).
Chromatin immunoprecipitation (chip)
chip prosedyren ble beskrevet i Current Protocols [19]. Kort, 10-20000000 (1-2 × 10
7) L02, ble HCT116 og 97L celler samles og festes med 37% formaldehyd. De ultralydbehandlede cellelysatene ble underkastet immunoutfelling med 5 ug H3K4me3 eller H3K27me3 antistoffer (Abcam), og normal IgG (innganger som kontroll), henholdsvis, i nærvær av protein G-Sepharose-kuler (GE Healthcare) ved 4 ° C over natten. Kulene ble vasket i rekkefølge med FA lyseringsbuffer, sponvaskebuffer, og TE-buffer. Bundet materiale ble eluert med Chip elueringsbuffer. Anriking av histone modifikasjon ble kvantifisert ved real time PCR, ved hjelp av SYBR Grønn (Applied Biosystems), med relevante Chip primere (figur 1A Figur S1 i File S1, Tabell S1). Data er presentert som fold berikelse, ved hjelp av en chip-qPCR analyse utregningsformelen (www.sabiosciences.com); innganger og mock IP ble anvendt for normalisering.
Revers transkripsjon og kvantitativ sanntids-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen) og behandlet med DNase , etterfulgt av revers transkripsjon med Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). QRT-PCR-analyse ble utført ved hjelp av de forhåndsdefinerte TaqMan prober for
Nanog plakater (Hs02387400_g1),
POU5F1 plakater (Hs00999634_gH),
MYC plakater (Hs00153408_m1), og
18S
rRNA (4333760-0807027), som ble valgt ut fra TaqMan genuttrykk Analyser (Applied Biosystems). SYBR Grønn reagenser (Applied Biosystems eller Takara Bioteknologi) ble brukt for påvisning av
OCT4
,
MYC
,
KLF4, p53 Hotell og
β-ACTIN
genuttrykk (primer informasjon i tabell S2). Genekspresjon ble beregnet som CT og normalisert til nivået av
18S
eller
β-ACTIN
.
Lentivirus transduksjon
Menneske
Nanog
(NM_024865) og
OCT4 plakater (NM_002701) gener fra humane embryonale stamcellelinje ble klonet inn pWPI vektor og ble transfektert med pCMV-dR8.91 og pMD2.G plasmider inn i 293T emballasje cellelinje. Virale supernatanter ble høstet 48 timer etter transfeksjon og utfelt ved hjelp av PEG-det virus presipiteringsoppløsning (System Biosciences). HCT116 p53 – /- celler ble infisert med lentivirus som uttrykker enten
OCT4
eller
Nanog
i nærvær av 8 mikrogram /ml protaminsulfat. Celle sortering ble utført med FACSAria (BD Biosciences) for isolering av transduced HCT116 p53 – /-. Celler
In vivo metastase analyse av orthotopic kolon svulsten implantasjon
Fire til seks uker gamle BALB /Cann-v (Nude) mus ble oppnådd og opprettholdt ved Forsøksdyravdelingen ved Universitetet i Hong Kong. Alle mus eksperimenter ble godkjent av Komiteen for bruk av levende dyr av University of Hong Kong. Lentivirus infisert HCT116 p53 – /- celler ble injisert subkutant i nakne mus for å generere primære svulster. De primære tumorer ble dissekert i 1-2 mm
3 kuber og deretter implantert i cecum andre nakne mus [20]. Colon til lungemetastase ble undersøkt etter 4 uker med cecum implantasjon. Hele lungene fra nakne mus ble seksjonert og farget med H E. De tykktarmen tumorlesjoner i lungene ble undersøkt ved mikroskopi.
Flowcytometri og celle sortering
CD133-PE (Miltenyi Biotec) merket HCT116-celler ble analysert ved hjelp FACSCalibur (BD Biosciences). CD133 +
lav, CD133 +
høy, og CD133- cellene ble utsatt til celle sortering etter FACSAria (BD Biosciences).
Statistisk analyse
Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD og studentens
t
testen ble utført ved hjelp av SPSS programvare.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Differensial DNA metylering av pluripotency-assosiert gener i kreftceller
Tidligere studier har vist. aktivering av nedstrøms mål av
Nanog
,
OCT4
,
SOX2 Hotell og
MYC
gener i aggressivt voksende kreft hos mennesker [11]. Vi undersøkte derfor CpG metylering mønster av
Nanog plakater (også kjent som
NANOG1
),
OCT4
,
SOX2
,
KLF4
og
c-MYC
i humane kreftcellelinjer av bisulfit sekvense tilnærming (figur 1A Figur S1 i File S1). Sammenlignet med normale leverceller L02, som viste en beskjeden metylering nivå (39%), DNA hypometylering av
Nanog plakater (Figur 1A-i) ble observert i tre leverkreft cellelinjer, nemlig PLC, 97L og 97h ( 18%, 8% og 14%, henholdsvis) hvorav de metastatisk levercellelinje 97L viste, nesten fravær av DNA-metylering (figur 1B og 1C). Mens i leukemiske K-562-celler,
Nanog
metylering (39%) viste et 2-ganger økning i forhold til normale perifere mononukleære blodceller (PBMC) (81%, figur 1B og 1C). Kreftceller fra andre vev opprinnelse vises differensial
Nanog
promoter metylering; for eksempel, hypometylering ble observert i HeLa (25%), mens hypermethylation ble vist i MCF7, HCT116 og AGS (71%, 92% og 91%, henholdsvis) (figur 1B og 1C).
neste undersøkte
OCT4
promoter metylering mønster i kreftceller. Den proksimale promoter-regionen (-503 til 7, figur 1A-ii) i
OCT4
ble funnet hypermethylated i L 02 (92%), Miha (90%), HeLa (90%) og HCT116 (87% -celler), som er i motsetning til de reduserte nivåene observert i PLS og 97L celler (70% og 41%, respektivt; figur 1D). Vi utvidet metyleringen analysen til et totalt 50 CPGs som dekker både den distale promoteren og nedstrømsområdet av transkripsjonsstartsetet (TSS, -2973 til 320, figur 1A-ii). Den reduserte metylering mønsteret ble konservert ved analysert
OCT4
genet region i PLS og 97L celler (figur 1E). For
c-MYC
gen, selv om CPGs ligger oppstrøms TSS1 og TSS2 og innenfor ekson 2 forble unmethylated i både normale celler og kreftceller (figur 1A-iii Figur S2 i File S1), metylering nivå av exon 3 ble dramatisk redusert, og ble hypomethylated i to leverkreftcellelinjer, PLC (34%) og 97L (6%), sammenlignet med moderat til høyt nivå av metylering (51% til 82%) i normale leverceller ( Figur 1F). I motsetning til kreftceller fra andre vev opprinnelse, med unntak av HeLa, viste hypermethylation status av
c-MYC
ekson 3 (som varierer fra 72% til 99%, figur 1F). På den annen side, CpG øyene ved promotorområdene av
KLF4
og
SOX2
gener forble unmethylated i alle de undersøkte cellelinjer (figurer S1, S3, S4 i File S1). Til sammen differensial metylering mønster av pluripotency-assosiert gener ble observert i humane kreftcellelinjer fra ulike vev opprinnelse.
epigenetisk forskrifter pluripotent genuttrykk
neste fokusert på pluripotent genuttrykk i to cancercellelinjer, 97L og HCT116, som viste motsatte mønstre av DNA-metylering. QRT-PCR analyse viste høyere uttrykk av
Nanog
,
OCT4 Hotell og
c-myc
gener i 97L celler, men ikke i HCT116 cellene, når sammenlignet med kontroll L02 og PLC celler (figur 2A-C, figur s5a-C i File S1), noe som tyder uttrykket av disse genene er negativt regulert av DNA metylering. For
KLF4
, økt genekspresjon ble observert i både 97L og HCT116-celler (figur 2d, figur S5D i File S1) til tross for det faktum at CpG øya metylering mønster var umulig å skille mellom normale og kreftceller (figur S3 i File S1)
Expression nivåer av (A)
Nanog
, (B)
OCT4
, (C)
c.
–
MYC
, og (D)
KLF4
gener ble bestemt i L02, PLC, 97L, og HCT116-celler ved QRT-PCR-analyse, normalisert med referanse genet
18S
. Den genekspresjon ble normalisert til L02 prøve, som ble definert som 1. Data er gjennomsnitt ± SD oppnådd fra 2 til 3 eksperimenter med duplikater. Anriking av histone modifikasjon H3K4me3 og H3K27me3 på promotorområdene av pluripotency-assosiert gener (E)
Nanog
, (F)
OCT4
, (G)
c Z –
MYC
, og (H)
KLF4
ble målt i L02, 97L, og HCT116 av Chip analyse. Data er representert som fold berikelse og normalisert med innspill og mock IgG kontroller. Fold berikelse var i forhold til L02 prøven, som ble definert som 1. Data er representert med gjennomsnittsverdien hentet fra to chip eksperimenter med feilfelt av standard derivasjon.
epigenetiske modifikasjoner på histonproteiner viste også sterk assosiasjon med genekspresjon. Vi har derfor bestemt tilstedeværelsen av to typer histonmodifikasjonene, aktiv /givende tri-metyl-H3K4 (H3K4me3) og undertrykkende tri-metyl-H3K27 (H3K27me3), i 97L og HCT116 kreftceller. ChIP analyse viste en betydelig berikelse av aktiv H3K4me3 merke i promotorområdene av
Nanog Hotell og
OCT4
og ekson 3-regionen i
c-MYC
i 97L celler, når i forhold til L02 og HCT116-celler (Figur 2E-G, venstre panel). Dette er i kontrast til lavt nivå av undertrykkende H3K27me3 mark observert i disse cellene (figur 2E-G, høyre panel). Disse resultatene tyder på at både histonmodifikasjonene og DNA metylering funksjon synergi i å regulere
Nanog
,
OCT4 Hotell og
c-MYC
genuttrykk. På den annen side, ble funnet H3K4me3 sterkt anriket på
KLF4
promoteren fra 97L celler, mens HCT116-celler viste en moderat grad av H3K4me3 men med forholdsvis lavere nivå av undertrykkende H3K27me3 (figur 2 H, høyre panel). Dette kan forklare det høye nivået av
KLF4
genuttrykk i begge cellelinjer (figur 2D), som er uavhengig av DNA metylering.
Nanog promoter hypometylering i menneskelig HCC svulstvev
Gitt at differensial
Nanog
metylering mønster i kreftcellelinjer kan være en konsekvens av
in vitro dyrkning
i stedet for forbindelse med deres tumorgenisitet
per se
, vi derfor undersøkt
Nanog
promoter metylering i primære tumorer HCC forbundet med tilstøtende ikke-tumorvev (n = 15), sammenlignet med normale leverprøver (figur 3A). Påfallende, 73% av ikke-tumor tilfeller (11 av 15) var mer enn 50% denaturert, mens 53% av tumor tilfeller (8 av 15) var mindre enn 30% denaturert på
Nanog
promoter (figur 3B og 3C).
Nanog
promoter metylering nivåene ble betydelig redusert i de sammenkoblede HCC svulster sammenlignet med tilstøtende ikke-tumorvev (
p
= 0,000), mens ingen signifikante endringer ble oppdaget mellom normal og ikke-svulst leveren vev (
p
= 0,301; figur 3D). I samsvar med den reduserte promoteren metylering,
Nanog
ekspresjon ble funnet signifikant høyere i svulstvev enn i ikke-tumorvev (
p
= 0,021, figur 3E). Det er verdt å merke seg at HCC prøver på TNM stadium III og IV, som vanligvis er til stede med vaskulær invasjon, lymfeknute og fjernmetastaser [17], var signifikant forbundet med høy
Nanog product: (
p
= 0,011) og lav
p53 product: (
p
= 0,047) uttrykk (tabell 1; Tabell S3). Den lave
p53
var også assosiert med vaskulær infiltrasjon (
p
= 0,019, Tabell 1). Disse resultatene tyder på at tumormetastaser krever både oppregulerer
Nanog
via promoter hypometylering og undertrykkelse av
p53
i HCC
(A) H . E farging av humant normal leveren (til venstre), og HCC ikke-tumor (midten) og svulstvev (til høyre). (B) Metylering status for
Nanog
promoter (-1449 til -952) i femten sammenkoblede HCC ikke-tumor og tumorvev. DNA metylering frekvens ble klassifisert i 50-69% (svart), 30-49% (grå), og 19-29% (hvit) i HCC svulsten og tilstøtende ikke-tumorvev. (C)
Nanog
promoter metylering mønsteret er representert med HCC case-297 svulsten og tilstøtende ikke-svulstvev. (D) Statistisk sammenligning av
Nanog
promoter metylering i normal lever (n = 3), HCC tilstøtende ikke-tumor (n = 15) og tumor (n = 15) vev; data er gjennomsnitt ± SD. (E) Statistisk sammenligning av
Nanog
genuttrykk i paret HCC ikke-tumor og svulstvev (n = 15). Hver svulstvev ble normalisert med sin tilsvarende ikke-svulstvev.
Nanog uttrykk fremmer metastase
Etter identifisering av
Nanog
oppregulering i metastatisk HCC celler og kreftprøver, fremmet vi vår studie for å undersøke
in vivo
funksjon av
Nanog
i kreft progresjon. Men Nanog
i HCC celler gjør sterkt uttrykk for
det vanskelig å bli slått ned effektivt for
in vivo
funksjonelle studier (data ikke vist). Vi har derfor valgt HCT116-cellelinjen, som har lav endogen nivå av Nanog, for overekspresjon studien. En stabil
Nanog
uttrykker HCT116 p53 – /- celler (Figur S6a i File S1) ble injisert inn i nakne mus for tumordannelse. Overraskende, minimum 1 x 10
4 celler enten HCT116 p53 – /- eller
Nanog
uttrykker HCT116 p53 – /- (Nanog-HCT116 p53 – /-) celler var tilstrekkelig til å danne subkutane svulster (tabell S4), som indikerer at en høyere grad av
Nanog
ekspresjon ble ikke ytterligere å øke dannelsen av primære svulster. Men ved å bruke en orthotopic tumorimplantering musemodell, observerte vi en betydelig høyere kolon til lungemetastase ved å implantere xenografttumorer av Nanog-HCT116 p53 – /- celler i forhold til foreldre HCT116 p53 – /- celler (figur 4A-C). Dette gir sterke
in vivo
bevis for å støtte funksjon av
Nanog
fremme kreft celle metastase
(A) HCT116 p53 -. /- Eller Nanog-uttrykke HCT116 p53 – /- celler (1 x 10
6) ble injisert inn i nakne mus subkutant. Xenograft tumor vev som ble dannet, ble skåret ut og deles opp i 1-2 mm
3 kuber som deretter ble implantert i cecums av andre nakne mus. Svulstdannelse i cecum ble observert etter implantasjon. Piler peker cecum og den nydannede svulst i cecum. (B) Colon til lungemetastase ble undersøkt etter fire ukers implantering av H mens store og flere kolon tumorlesjoner ble funnet i Nanog-HCT116 p53 – /- implantasjon gruppe (til høyre). (C) Statistisk sammenligning av lungemetastaser frekvens i ortotopisk cecum implantering modell avledes fra HCT116 p53 – /- (n = 8) og Nanog-HCT116 p53 – /- (n = 11). (D) Flowcytometri analyse av CD133 uttrykk i HCT116 cellene demonstrerte tre populasjoner av celler; nemlig CD133-, CD133 +
lav, og CD133 +
høy. Mindre enn 1% av cellene ble ansett som CD133 +
høy. (E)
Nanog
arrangøren metylering mønstre i CD133-, CD133 +
lav, og CD133 +
høy HCT116-celler. CD133 +
høye celler viser en signifikant reduksjon av
Nanog
promoter metylering. (F)
Nanog
uttrykk i CD133-, CD133 +
lav, og CD133 +
høy HCT116-celler. CD133 +
høye celler viste en betydelig økt
Nanog
uttrykk.
Nanog
uttrykk i CD133- ble definert som en, og fold økning i CD133 +
lav og CD133 +
høy (versus å CD133-) ble beregnet som ΔΔCT. Dataene er middelverdien ± SD fra tre eksperimenter med duplikater. (G) HCT116-celler ble infisert med
Nanog
-GFP lentivirus og analysert for CD133 populasjoner av flowcytometri. Prosentene av CD133 populasjoner ble sammenlignet mellom HCT116-celler med enten endogent nivå eller overekspresjon nivå Nanog. Den CD133 +
høy befolknings (R5) ble økt i celler med overekspresjon av
Nanog
.
Demetylering av Nanog i CD133 +
høy bestand av HCT116 cellene
Høy uttrykk for CD133 er en av de indikasjoner på CSC befolkningen i ulike typer kreft, inkludert tykktarmskreft [21], [22]. Siden de tre pluripotente gener
Nanog
,
OCT4
, og
c Anmeldelser –
MYC
ble hypermethylated i kolorektal kreft HCT116 cellene, vi spurte om det samme mønster av metylering ville bli observert i sjeldne antatte CSC populasjon i HCT116-celler. Vi har observert over 80% av HCT116-celler ble CD133 +, men bare 1% av cellene ble betraktet som CD133 +
høy (figur 4D). Viktigere,
Nanog
promoter metylering ble opprettholdt på et høyt nivå i både CD133- og CD133 +
lave HCT116-celler (89% og 78%, henholdsvis), mens det ble dramatisk redusert til 42% i CD133 +
høye celler (figur 4E). Den reduserte metylering ble også funnet i samsvar med en betydelig oppregulering av
Nanog
uttrykk i CD133 +
høye celler (Figur 4F). I tillegg overekspresjon av eksogene
Nanog
i HCT116 cellene resulterte i en økning av CD133 +
høy befolknings (figur 4G), noe som tyder på at demetylering av
Nanog
arrangøren bidrar til oppstart av cscs i tumorutvikling.
pluripotency reguleringskretser i kreftcellene
OCT4
,
SOX2
, og
Nanog
har vist seg å danner en transkripsjonen regulatorisk løkke i ESCs for vedlikehold av pluripotency [23] – [25]. Vi spurte om en slik grenseregulering er konservert i kreftceller med avvikende epigenetiske mønstre. HCT116-celler med ulik p53 genetiske bakgrunn ble brukt fordi p53 ble rapportert som en barriere for å re-etablering av pluripotency [26]. Interessant, overekspresjon av eksogent
OCT4
betydelig øket
Nanog
mRNA-nivåer i HCT116 p53 – /- celler, men ikke i HCT116 p53 + /+ celler (figur 5A, Fig S6b i File S1). Induksjonen av
Nanog
ekspresjon ble assosiert med en redusert promotor-metylering i OCT4-HCT116 p53 – /- celler (fra 95% til 66%; figur 5B). Videre overekspresjon av eksogene
Nanog
betydelig forbedret
OCT4
mRNA nivåer i HCT116 cellene uavhengig av p53 status (figur 5C). Dette tyder på at pluripotency reguleringskretsen er konservert i kreftceller, og det er delvis restaurert i kreftceller via epigenetisk mekanisme som omprogrammerer
Nanog
promoter metylering.
(A) HCT116 p53 + /+ og p53 – /- celler ble infisert med
OCT4
-GFP-lentivirus. Sterk induksjon av endogen
Nanog
uttrykk ble funnet i OCT4-uttrykke HCT116 p53 – /- celler. Genuttrykket i HCT116 cellene uten infeksjon ble definert som en, og dobling i HCT116-celler med infeksjon ble beregnet ved ΔCT. Dataene er middelverdien ± SD fra tre eksperimenter med duplikater. Sammenkoblet Student
t
test ble brukt for statistisk analyse. (B)
Nanog
arrangøren metylering mønstre i HCT116 p53 – /- celler med eller uten
OCT4
overekspresjon. (C) HCT116-celler ble infisert med
Nanog
-GFP-lentivirus. Betydelig induksjon av endogen
OCT4
uttrykk ble funnet i både Nanog-uttrykke HCT116 p53 + /+ og p53 – /- celler. Genekspresjonen Beregningen var den samme som beskrevet i (A). Sammenkoblet Student
t
test ble brukt for statistisk analyse.
Diskusjoner
Aktivering av molekylære mål av pluripotency-assosiert gener (
Nanog
,
OCT4
,
SOX2
, og
c Anmeldelser –
MYC
) er hyppig observert i dårlig differensierte kreft [11], [27].
OCT4 Hotell og
Nanog
uttrykk har også blitt funnet i forbindelse med CSC eiendommer i kreft hos mennesker [28] – [33]. I denne studien har vi vist en stamcelle epigenetisk underskrift av pluripotency-assosiert gener i kreftcellelinjer; spesielt en økt ekspresjon av
Nanog
i metastatiske HCC celler og i svakt prognostiske humane HCC tumorer (figur 1B, 1C, 2A, 3, tabell 1), noe som antagelig er forbundet med sin promoter hypomethylated status og undertrykkelsen av
p53
. Vi har også lagt merke til at
NANOGP8
, koder for et protein med over 99,5% likhet til den autentiske NANOG1 protein blir uttrykt i en rekke forskjellige kreftceller, inkludert HCT116-celler [34], [35]. Det er mulig at
NANOGP8
nivå kan interferere med deteksjonen av
Nanog
uttrykk i vår undersøkelse siden den TaqMan-probe som anvendes kan ikke skille mellom de to gensekvensene. Viktigere, våre data tydet på at den sterke
Nanog
uttrykket var forbundet med oppstart av en antatt CSC befolkningen (figur 4D-G) og fremmet
in vivo
metastase (figur 4A-C) . Derfor hypoteser vi at demetylering av
Nanog
oppstår under tumorutvikling og tilsvarende uttrykk for
Nanog
gir kreftceller med metastatisk CSC egenskaper.
Kreftceller har vært foreslått å tilpasse seg en epigenetisk signaturen «stemness». Ulike kreftceller vise sine unike mønstre av DNA metylering, histonmodifikasjonene, og pluripotent genuttrykk som kan gjenspeile de ulike vev opprinnelse. Interessant, iPSCs havn rest DNA metylering underskrifter fra sine somatisk vev opprinnelse [13] – [16]. Selv om det er ennå ikke avgjort om fenomenet epigenetiske minne forbinder med kreftutvikling, våre data tyder på muligheten for at ulike vev opprinnelsen til kreftformer kan holde ulike kreftfremkallende potensialer når de blir utsatt for epigenetiske forandringer, hvorav noen er mer utsatt for å re -activate pluripotente gener ved å anskaffe en stamcelle epigenetisk signatur.
OCT4 og Nanog er de viktigste komponentene i protein komplekser for å opprettholde pluripotency og aktivere transkripsjonsregulerende krets. Vår observasjon av
OCT4 Twitter /
Nanog
cross-induksjon i HCT116 cellene viser en bevaring av kryss-regulerende funksjon mellom pluripotente faktorer i kreftceller videre (figur 5).
