Abstract
gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) reseptorer er uttrykt i prostata cancer, spesielt i de mest aggressive fasen av tumor (kastrering-motstandsdyktig prostatakreft, CRPC) som standardbehandlingen, docetaxel- kjemoterapi, kan bare forbedre median overlevelsestid etter noen måneder. Vi har tidligere vist at GnRH-agonister utøver en antitumoraktivitet i CRPC celler; men er fortsatt en kobling mellom GnRH reseptorer og apoptotiske maskiner som skal defineres. Hensikten med denne studien var å vurdere om, i CRPC cellene, kan GnRH agonister påvirker uttrykket /aktivitet av apoptose relaterte proteiner og kan bevisstgjøre, eller resensitize, kreftceller til kjemoterapeutika. Vi demonstrert at, i p53-positive celler DU145, GnRH-agonister: a) øke ekspresjon av proteinet proapoptotiske Bax; denne virkning er mediert av fosforylering (aktivering) av p53, utløst av p38 MAPK; b) potensere antiproliferative /proapoptotiske aktivitet av docetaxel; c) resensitize docetaxel-resistente celler til antitumoraktivitet av det cytotoksiske legemiddel. Disse data indikerer at GnRH-agonister sensibilisere og, enda viktigere, resensitize DU145 CRPC celler til kjemoterapi i et p53-avhengig måte. For å bekrefte den avgjørende rollen av p53 i aktiviteten av GnRH-agonister, ble eksperimenter utført i p53-null PC3-celler. Vi fant at GnRH-agonister ikke klarer å øke Bax uttrykk og ikke forsterke den cytotoksiske aktivitet av docetaxel. Disse resultatene kan gi en begrunnelse for nye kombinasjonsbehandlingsstrategier, spesielt for docetaxel-resistente CRPC pasienter uttrykker et funksjonelt p53 protein
Citation. Moretti RM, Marelli MM, Taylor DM, Martini PGV, Marzagalli M, Limonta P (2014) gonadotropinfrigjørende hormon agonister bevisstgjøre, og Resensitize, prostata kreft celler til Docetaxel i en p53-avhengig måte. PLoS ONE 9 (4): e93713. doi: 10,1371 /journal.pone.0093713
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 14 oktober 2013; Godkjent: 05.03.2014; Publisert: 10 april 2014
Copyright: © 2014 Moretti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Università degli Studi di Milano, PUR program (tilskudd n. 12-1-95 og 12-1-104). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreft for menn og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i vestlige land [1]. De fleste prostata cancer er avhengig av tilstedeværelsen av androgener for vekst og overlevelse, og androgen ablasjon, rettet til å blokkere androgen sekresjon /aktivitet, representerer den mest effektive innledende behandling [2], [3]. Denne behandlingen inkluderer kirurgisk eller kjemisk kastrering, oppnås ved: administrering av gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) analoger; blokkering av bindingen av androgener til deres reseptor ved antiandrogener; hemming av steroidogenic enzymer. Dessverre, til tross for en god første svar, i ca 2 til 3 år, de fleste prostata kreft vil utvikle seg til kastrering resistent prostatakreft (CRPC) stadium med økt spredning og malignitet [4], [5]. For CRPC pasienter, representerer taxan-basert kjemoterapi behandling av valget [6], [7]. Docetaxel virker ved binding til tubulin for å fremme polymeriseringen og hindrer mikrotubuli depolymerisasjon i fravær av guanosin trifosfat. Det har også blitt vist å indusere tumorcelledød ved å påvirke ekspresjon /aktiviteten av flere kreftspesifikke mål, også nedregulering av den antiapoptotic proteinet Bcl-2 og oppregulering av den proapoptotiske proteinet Bax [8], [9]. Men til tross for den første demonstrasjonen av en bedre overlevelse med docetaxel-basert kjemoterapi, ble forbedringen funnet å være bare en progresjonsfri overlevelse av noen måneder [6], [10]. Dermed behandling av pasienter med CRPC som utvikler seg etter docetaxel-basert kjemoterapi fortsatt en betydelig klinisk utfordring. Identifisering av nye strategier for å overvinne motstanden docetaxel vil sannsynligvis forbedre de terapeutiske alternativer for disse pasientene.
GnRH ble først identifisert som hypothalamus nøkkelen regulator av de reproduktive funksjoner. Ved å binde seg til spesifikke reseptorer (GnRH-R) på hypofysen gonadotropes GnRH aktiverer hypofyse-gonadal-aksen. GnRH-agonister, når det gis kontinuerlig og ved høye doser, ufølsomme hypofysen GnRH-R, og dermed undertrykke gonadal steroider sekresjon; på grunnlag av deres aktivitet, er disse forbindelsene representerer den mest utbredte og med hell anvendt medisinsk behandling for androgen-responsive prostatakreft [2], [11].
Det er nå vel etablert at GnRH-reseptorer er uttrykt i prostata kreftceller, spesielt i CRPC celler og vev [12] – [15]
Disse reseptorene (i tillegg til GnRH-reseptorer i bryst og gynekologiske kreftceller og vev) er først karakterisert med hensyn til bindingsaffinitet.. Imidlertid har kontrasterende resultater blitt rapportert: en klasse av lav-affinitets-bindingsseter [12], [13], [16] – [18]; to typer av reseptorer (ett med høy affinitet og en med lav affinitet) [19] – [21]; en enkelt klasse av høy affinitet GnRH bindingsseter [22] – [25]. I særdeleshet, rapporterte nærvær av lav affinitet GnRH-reseptorer i prostatakreftceller [12], [13]. Årsaken til dette avviket er fortsatt et spørsmål om debatt; Imidlertid kan det være på grunn av ulike eksperimentelle forhold vedtatt (ulike kreftcellelinjer og ligander, evaluering av bindende affinitet i kreftceller /vev uttrykker bindingsstedene
vs
. celler utviklet for å overuttrykker reseptorene, celle -spesifikke posttranslational modifikasjoner av reseptoren,
osv.
).
Disse første kontrastmålinger stimulerte karakterisering av kreft GnRH-reseptorer på molekylært nivå. Nærmere bestemt, rapporterte vi at både mRNA som koder for den humane hypofyse GnRH-reseptor og det tilsvarende protein er uttrykt i prostata kreftceller, enten androgen-avhengige eller kastrering-resistente [26]. Videre har nukleotidsekvensen av cDNA som koder for tumor-reseptorer blitt vist å tilsvare det tidligere rapportert for hypofyse-reseptorer [27], [28].
Vi viste videre at GnRH-agonister, gjennom aktivering av lokalt uttrykt GnRH reseptorer, utøve en sterk antiproliferativ effekt på prostatakreftceller, både
in vitro Hotell og
in vivo product: [12], [29], [30]; Dette antitumoraktivitet er spesifikk, siden den er helt oppheves etter at stanse av GnRH-reseptoren ved hjelp av en spesifikk siRNA [31].
I tillegg til redusert celleproliferasjon, og apoptose blitt foreslått å være involvert i antitumor aktivitet av GnRH analoger. Men dataene så langt som tilbys på dette problemet er fortsatt kontroversiell [30], [32] – [35]
Her bekrefter vi vår forrige observasjon at GnRH-agonister ikke, av seg selv, indusere apoptose i. CRPC celler. Men i p53-uttrykkende DU145 prostatakreftceller, øker de ekspresjon av proteinet proapoptotiske Bax, gjennom fosforylering ved Ser-15 (
ie
., Aktivering) av p53, er den viktigste regulator av den iboende apoptotiske reaksjonsvei ; aktivering av denne p53-Bax apoptotiske signalering blir utløst av p38 MAPK-fosforylering. Vi viser også at GnRH-agonister bevisst DU145 cellene til antimitosemekanisme aktivitet av docetaxel. Enda viktigere, GnRH-agonister resensitize docetaxel-resistente DU145-celler til dødsinduserende aktivitet av det kjemoterapeutiske middel. Disse data indikerer at, i p53-positiv prostatakreftceller, rettet lokalt uttrykt GnRH-reseptorer ved hjelp av GnRH-agonister sensitizes og resensitizes kreftceller til kjemoterapi, i et p53-avhengig måte. Den avgjørende rolle spilt av p53 blir videre demonstrert ved den observasjon at GnRH-agonister ikke påvirker Bax uttrykk og ikke klarer å forsterke den apoptotiske aktivitet av docetaxel i p53-null PC3 prostata kreftceller. Samlet utgjør disse resultatene representerer begrunnelsen for kombinasjonen behandlingsstrategier for docetaxel-resistente CRPC pasienter, uttrykker et funksjonelt p53 protein.
Materialer og metoder
cellekulturer
Den menneskelige kastreringsresistent DU145 (p53-positiv) og PC3 (p53-null) prostatakreftcellelinjer ble kjøpt fra American Tissue Culture Collection. Både PC3 og DU145-celler representerer den mest hensiktsmessige og mye benyttet modell av CRPC i litteraturen [36] – [40]. Celler ble rutinemessig dyrket i Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) medium supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS), glutamin (1 mmol /L) og antibiotika (100 IU /ml penicillin G-natrium og 100 ug /mL streptomycin sulfat), i fuktig atmosfære med 5% CO
2/95% luft ved 37 ° C.
Materialer og Antistoffer
GnRH-agonist Goserelinacetat [D-Ser (tBu )
6Aza-Gly
10-GnRH, Zoladex, GnRH-A] ble vennlig levert av Astrazeneca Pharmaceuticals. GnRH-antagonist antid (Ant) og docetaxel (Doc) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich.
I alle forsøkene, GnRH-agonist har vært brukt i en dose på 10
-6 mol /L, på grunnlag av tidligere studier, fra forfatternes laboratorium såvel som fra andre, forsøkte å undersøke de molekylære aspekter av antitumoraktivitet av GnRH-analoger i CRPC celler [29], [41] – [46]. Den samme rekke doser ble også anvendt for å undersøke antitumoraktivitet av GnRH-agonister i flere eksperimentelle modeller av kreftceller som overuttrykker den GnRH-reseptoren [16], [47] -. [49]
Pifithrin-a, den spesifikk hemmer av p53 transkripsjonen aktivitet, og SB203580, den spesifikke p38 MAPK-hemmer, ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, og fra henholdsvis Sigma-Aldrich, etter
Antistoffer anvendt for Western blotting eksperimenter:. kanin-anti-human Bax (1 :500; # 2772), kanin anti-human p38 MAPK (1:1,000 ;. # 9212) og kanin anti-human p-p38 MAPK (1:1,000; # 9211) fra Cell Signaling Technology; mus monoklonalt anti-human Bcl-2 (1:250; # sc-7382), muse-monoklonalt anti-humant p53 (1:1,000; # Sc-53394), kanin anti-humant p-p53 (Ser-15; 1: 1000; # sc-101762) og geit anti-human aktin 1-19 (1:1,000;. # Sc-1616) fra Santa Cruz Biotechnology
Microarray analyse
DU145 prostatakreftceller var seeded (5 × 10
5 celler /parabol) i 10 cm vevskulturstudier retter; etter 48 timer ble cellene behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 timer, og total RNA ble fremstilt ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner. Etter kvalitetskontroll ved hjelp av en Bioanalyzer (Agilent 2100), ble RNA merket i henhold til Affymetrix protokollen ved hjelp av en syklus Merking Kit (Affymetrix). 15 mikrogram resulterer CRNAs ble hybridisert på hele genomet microarray U133 pluss 2,0. Etter hybridisering på Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 chips, ble genuttrykk verdier beregnet for hver sonde er innstilt med pakker i Bioconductor suite [50]. Gener var normalisert og analysert med Robust multichip Analysis (RMA) metode innenfor AFFY pakken [51] og GCRMA pakken [52]. Forskjellene i loggen uttrykk nivåer for både RMA og GCRMA normalisert data ble evaluert av den tosidige t-test som gjennomføres i limma pakken [53]. Gener med
P
-verdier 0,05 og den absolutte uttrykk folden endre større enn 1,5 ble betraktet som signifikant forskjellig uttrykt (DE) mellom behandlede og ubehandlede celler. Et gen listen ble generert ved å ta den overlappingen av DE-gener som genereres av limma fra både RMA og GCRMA normaliseringsfremgangsmåter.
Western Blot analyse
På slutten av forsøkene ble cellene vasket med PBS og lysert i RIPA-buffer (0,05 mol /L Tris-HCl pH 7,7, 0,15 mol /l NaCl, 0,8% SDS, 10 mmol /l EDTA, 100 umol /l NaVO4, 50 mmol /l NaF, 0,3 mmol /l PMSF , 5 mmol /l jodeddiksyre) inneholdende leupeptin (50 ug /ml), aprotinin (5 ul /ml) og pepstatin (50 ug /ml). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA-metoden. Proteinekstrakter (30 ug) ble resuspendert i prøvebuffer (0,5 mol /L Tris-HCl pH 6,8, 20% glycerol, 10% SDS, 0,2% 2β-merkaptoetanol, 0,05% bromfenol blå) og oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter . Etter elektroforetisk separasjon ved hjelp av SDS-PAGE ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert i 3% ikke-fettholdig tørrmelk før inkubasjon ved romtemperatur i 2 timer med de spesifikke primære antistoffer ved egnede fortynninger. Påvisning ble gjort ved hjelp av en pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff og forbedrede Chemiluminescence reagenser (Supersignal Chemiluminescence Detection System). I hvert Western blot eksperiment aktin-ekspresjon ble evaluert som en lasting kontroll. For hvert protein analyse, ble tre ulike eksperimenter gjort; den densitometrisk analyse rapportert i tallene ble utført på resultatene fra de tre ulike eksperimenter.
Cell Proliferation og celleviabilitet Studier
DU145 og PC3 cellene ble sådd (1 × 10
4 celler per parabol) i 6 cm retter. Etter 2 dager, ble cellene behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 timer, enten alene eller i nærvær av GnRH-antagonist antid (Ant, 10
-6 mol /l) , etterfulgt av docetaxel (10 nmol /L) i 48-72 timer. Celler behandlet med hver av de to legemidlene alene eller uten noen behandling tjente som kontroller. Ved slutten av behandlingene ble cellene høstet og tellet ved hemocytometer. For levedyktighet studier ble DU145 og PC3-celler behandlet som beskrevet, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypanblått eksklusjon assay. Antallet av døde celler ble målt ved å telle trypanblått-farvelegemer.
Caspase-3 Assay enzymaktivitet
Caspase-3-lignende aktivitet ble vurdert ved bruk av CaspACE kolorimetrisk analyse kit (Promega). DU145 cellene ble sådd (2 × 10
5 celler /parabol) i 10 cm retter. Etter 2 dager ble cellene forbehandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 timer og deretter behandlet med docetaxel (10 nmol /L) i 72 timer. Ved slutten av behandlingene ble celler (både adherente og frittliggende) lysert i lyseringsbuffer som inneholdes i settet etterfulgt av sentrifugering (15.000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C). Caspase-3-lignende aktivitet ble bedømt ved å følge den proteolytiske spaltning av kolorimetriske substrat Ac-DEVD-pNA. Prøvene ble avlest ved 405 nm i et spektrofotometer ved å bruke en 100 ul quarz kyvette. Den pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK ble brukt til å bekrefte analysen spesifisitet.
Colony Forming analyse
For utvikling av docetaxel-resistente celler (DU145-R), DU145 cellene sådd i 10 cm skåler ble serielt behandlet med docetaxel (10 nmol /l, en gang i uken) før de utviklet evnen til å vokse og dele seg i nærvær av stoffet (8 uker). For å undersøke hvorvidt GnRH-agonister kan resensitize DU145-R-celler med aktiviteten av docetaxel, ble en standard klonogene-målingen ble utført. DU145-R-celler ble sådd ut ved 1000 celler /brønn i seks-brønners plater og tillatt å feste i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 timer, fulgt av docetaxel (10 nmol /L) i 72 timer. Ved slutten av behandlingen ble cellene vasket og friskt medium ble tilsatt. Celler ble dyrket i 14 dager i 5% FBS inneholdende medium og deretter fiksert og farget med krystallfiolett. Bilder av farget kolonier ble tatt til fange av en Nikon kameraer.
Statistical Analysis
Når det er hensiktsmessig, data ble analysert ved Bonferroni test, etter enveis variansanalyse.
P
verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
GnRH agonister Øk Bax Expression i DU145 Cells
Vi har tidligere rapportert at GnRH-agonister utøve en antiproliferativ effekt på DU145 prostatakreftceller. Det er imidlertid fremdeles uklart om apoptose kan også være involvert i antitumoraktivitet til disse forbindelsene [30], [32] – [35]. Den BCL-2 familie av celledød regulatorer (både proapoptotiske og prosurvival) representerer et kritisk styringspunkt i indre vei av apoptose. Balansen mellom disse to klasser av proteiner som bestemmer skjebnen til cellen. Apoptosiske protein Bax, gjennom oligomeriseringsprosessen med Bak, translocates fra cytoplasma til mitokondriene for å øke mitokondrie ytre membran permeabilization, utløser cytokrom
c
release og caspase-3-aktivitet [54]. Her undersøkte vi hvorvidt GnRH-agonister kan påvirke ekspresjonen av gener som er involvert i den apoptotiske reaksjonsvei. DU145-celler ble behandlet med GnRH-A i 24 timer og endringer i genekspresjon profil ble evaluert av genom-wide transcriptomic analyse. Blant de genene hvis uttrykk ble endret av den behandlingen vi fokusert vår oppmerksomhet på uttrykk for
Bax
.
Bax
uttrykk ble betydelig økt med 1,67 ganger (tabell 1); Denne økningen ble bekreftet på proteinnivået ved Western blotting (fig. 1A). Den stimulerende effekt av GnRH-A på Bax ekspresjon ble funnet å være spesifikk, siden den ble opphevet ved den cotreatment av cellene med GnRH antagonisten antid (Fig. 1B). På den annen side, GnRH-agonisten ikke påvirke ekspresjon av proteinet antiapoptotic Bcl-2 (fig. 1C).
(A) DU145-celler ble behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 eller 48 timer. Western blotting ble utført på fullcelle-ekstrakter ved hjelp av et anti-antistoff Bax. Som forventet, øker GnRH-A behandling Bax proteinekspresjon etter 24 timers behandling. (B) DU145-celler ble behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) og med GnRH antagonisten antid (Ant, 10
-6 mol /L), enten alene eller i kombinasjon, for 24 timer. Western blotting ble utført som beskrevet i A). Maur, gitt alene, ikke påvirker Bax uttrykk, mens GnRH-A, som forventet, øker ekspresjon av Bax. Denne stimulerende effekt av GnRH-A er spesifikk siden den er opphevet ved den cotreatment av cellene med GnRH antagonisten. (C) Behandling av DU145 celler med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 eller 48 timer, ikke påvirker Bcl-2-ekspresjon, som evaluert ved Western blotting. For både Bax og Bcl-2-protein ekspresjon analysen er vist en representativt for tre forskjellige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05
versus
C (ubehandlede kontroller); **
P
0,05
versus
GnRH-A-behandlede celler
I DU145 Cells GnRH agonister oppregulere Bax Expression gjennom p53 signalnettverk. pathway
det sentrale rollen p53 i indre apoptotiske veien er godt etablert [55]. Etter å ha blitt aktivert ved fosforylering ved Ser-15, translocates p53 inn i kjernen for å regulere ekspresjonen av gener proapoptotiske, for eksempel
Bax product: [56]. Dessuten ble p53 fosforylering rapportert å være avhengig av aktiviteten av p38 MAPK [57]. Ved Western blot-analyse fant vi at i DU145-celler, gjorde GnRH-A behandling (1-48 timer) ikke påvirker ekspresjonen av p53; imidlertid nivåene av serin-15 fosforylert (
dvs.
., aktiv) formen av proteinet ble signifikant økt etter 1 og 5 timer etter behandlingen (fig. 2A). Når cellene ble forbehandlet (2 timer) med pifithrin-α (p53-inhibitor) den stimulerende effekt av GnRH-A (24 timer) på Bax ekspresjon ble fullstendig opphevet (fig. 2B). Vi har også funnet at behandling av cellene med GnRH-A (5-15 minutter) påvirket ikke ekspresjonsnivået av p38 MAPK; men det signifikant økte nivåer av fosforylerte form av MAPK, 5 og 10 minutters tidsintervaller (Fig. 3A). Forbehandling (30 minutter) av cellene med SB203580 (1 umol /L), det spesifikke p38 inhibitor, redusert i betydelig grad de stimulerende virkninger av GnRH-A på p53 fosforylering (1 og 5 timer) (Fig. 3B). Således, i celler som DU145 GnRH-agonister oppregulere ekspresjonen av proteinet proapoptotiske Bax gjennom p53 phoshorylation; p38 MAPK er et oppstrøms aktivator for denne p53-Bax signalveien.
(A) DU145-celler ble behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) for forskjellige tidsintervaller (1-48 timer). Western blot-analyse ble utført på fullcelle-ekstrakter ved hjelp av p53 eller p-p53 (Ser-15) antistoffer. Behandling med GnRH-A ikke påvirker ekspresjonen av p53 til enhver tidsintervaller vurderes; imidlertid, er nivåene av serin-15 fosforylerte formen av proteinet betydelig øket etter 1 og 5 timer etter behandling. (B) DU145-celler ble behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l), enten alene eller etter en forbehandling med pifithrin-α (Pif, 30 umol /L, i 2 timer), den spesifikke p53 inhibitor. Western blot-analyse ble utført på fullcelle-ekstrakter ved hjelp av Bax antiobody. De oppnådde resultater viser at pifitrhin-α, når det gis alene, ikke påvirker Bax uttrykk. Som forventet, GnRH-A øker ekspresjonen av Bax; denne effekten blir fullstendig opphevet når cellene ble forbehandlet med pifithrin-α. En representant av tre forskjellige forsøk for hver av analysene som utføres, er vist. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05
versus
C (ubehandlede kontroller); **
P
. 0,05
versus
GnRH-A-behandlede celler
(A) DU145 cellene ble behandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) for forskjellige tidsintervaller (5-15 minutter). Western blot-analyse ble utført på fullcelle-ekstrakter ved hjelp av p38 og p-p38-antistoffer. Behandling med GnRH-A ikke påvirker ekspresjonen av p38 som helst tidsintervall vurderes. På den annen side, GnRH-A signifikant øker nivåene av den fosforylerte form av p38 (p-p38) ved 5 og 10 minutter etter behandling. (B) Som ventet, GnRH-A øker ekspresjonsnivåene av p-p53, som bekrefter tidligere resultater; densitometrisk analyse av dataene viser at denne effekten blir betydelig redusert når cellene blir forbehandlet med den spesifikke p38 inhibitor SB203580 (SB, 1 umol /L, i 30 minutter). En representant av tre forskjellige forsøk for hver av analysene som utføres, er vist. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05
versus
C (ubehandlede kontroller); **
P
. 0,05
versus
GnRH-A-behandlede celler
GnRH agonister bevisst p53-positive DU145 Celler til den cytotoksiske aktivitet av Docetaxel
en forstyrrelse i balansen mellom pro- og antiapoptotic faktorer er et viktig skritt i cellen beslutningen om å gjennomgå apoptose eller overlevelse. Basert på den stimulerende effekt av GnRH-agonister på Bax ekspresjon, mediert av p53-aktivering, undersøkte vi hvorvidt GnRH-agonister kan indusere apoptose i DU145-celler. Ved FACS-analyse kunne ikke observere noen proapoptotiske virkning av GnRH-A på disse cellene (data ikke vist). Disse observasjonene var ikke uventet siden det ble tidligere rapportert at i CRPC celler, GnRH-agonister redusere celleproliferasjon uten å indusere apoptose, [30], [32], [35]. Grunnen til at, i DU145 cellene, GnRH agonister øke Bax nivåer uten å utløse apoptotiske arrangementet er spennende. Imidlertid er det vel kjent at DU145-celler som overuttrykker den antiapoptotic proteinet Bcl-2, og nivåene av dette proteinet blir ikke påvirket av den GnRH-A behandling (se fig. 1 C). Således er det mulig at, i disse celler, er ikke tilstrekkelig til effektivt å forbedre forholdet Bax /Bcl-2 for å utløse apoptose den økte ekspresjon av Bax indusert av GnRH-A. På grunnlag av disse betraktningene, begrunnet vi at GnRH-agonister, ved oppregulering av proapoptotiske faktorer, kan sensibilisere prostata kreftceller til å aktiviteten til cytotoksiske medikamenter, kjent for å virke ved å øke ekspresjonen av proapoptotiske faktorer samtidig redusere det av antiapoptotic proteiner. Vi fokuserte vår oppmerksomhet på docetaxel siden: a) det representerer behandling av valget for CRPC [4], [5]; b) Det har blitt vist å indusere tumorcelledød ved oppregulering av den proapoptotiske protein Bax og nedregulering av den antiapoptotic proteinet Bcl-2 [8], [9]. Først ved Western blotting, bekreftet vi at docetaxel (48 timer) reduseres signifikant ekspresjon av Bcl-2, samtidig som det øker det av Bax (Fig. 4A). Deretter vurderte vi om GnRH-agonister kan forsterke antitumor aktivitet av docetaxel. Vi først funnet som, når det gis alene, betyr GnRH-A (24 timer) ikke påvirker proliferasjon av DU145-celler. Dette var ikke uventet, siden vi tidligere har rapportert at i CRPC celler, kan GnRH agonister utøve en betydelig antiproliferativ effekt når behandlingene blir utført for lengre tidsintervaller (4-7 dager) [29]. Lignende data er rapportert for andre typer svulster [58], [59]. Da viste vi at forbehandling DU145 cellene med GnRH-A (24 timer) forbedrer antiproliferative virkningene av docetaxel (48-72 timer) på alle tidsintervaller (Fig. 4B) betydelig. Videre kan vi vise at den sensibiliserende virkning av GnRH-A til docetaxel var spesifikk siden den ble fullstendig opphevet ved den cotreatment av cellene med GnRH antagonisten antid (fig. 4C). I de samme eksperimentelle betingelser, ble vurdering av cellelevedyktigheten utført ved trypanblått eksklusjon assay. GnRH-A, når det gis alene, ikke påvirke cellenes levedyktighet (fig. 4D). Som forventet, docetaxel økt antall positive Trypan blå fargede celler (døde celler) betydelig. Denne effekten ble betydelig forsterkes ved forbehandling av cellene med GnRH-A ved alle tidsintervaller (fig. 4D). For å bekrefte at forbehandling med GnRH-agonister sensitizes CRPC celler til antitumor aktivitet av docetaxel ble DU145 cellene behandlet med GnRH-A (24 timer) og deretter med cellegiften i 72 timer. Caspase-3 aktivitet ble deretter vurdert som en markør for celledød ved apoptose. GnRH-A, gitt alene, ikke påvirke caspase-3 aktivitet; som forventet, docetaxel øket enzymatisk aktivitet. Forbehandling av cellene med GnRH-A forsterket proapototic effekt av det kjemoterapeutiske middel betydelig. Effekten er spesifikk, siden den ble motvirket av den samtidige behandling av cellene med det pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (fig. 4E).
(A) Western blot-analyse ble utført for å bekrefte at cytotoksisk aktivitet av docetaxel (Doc) blir mediert av en perturbasjon av forholdet pro-til-antiapoptotic proteiner. DU145-celler ble behandlet med docetaxel (10 nmol /l) i 48 timer. Som forventet, docetaxel reduserer uttrykk for antiapoptotic protein Bcl-2, mens økende Bax uttrykk. En representant av tre forskjellige eksperimenter er vist. (B) DU145-celler ble forbehandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) i 24 og deretter med docetaxel (10 nmol /l) for forskjellige tidsintervaller (48-72 timer). Ved slutten av behandlingene ble cellene tellet ved hemocytometer. Forbehandling av cellene med GnRH-A øker den antiproliferative effekt av docetaxel ved alle tidsintervaller betraktet signifikant. (C) DU145-celler ble forbehandlet med GnRH-A (10
-6 mol /l) og med GnRH antagonisten antid (Ant, 10
-6 mol /L), enten alene eller i kombinasjon, for 24 timer, og deretter med docetaxel (10 nmol /L) i 60 timer. Ved slutten av behandlingene ble cellene tellet ved hemocytometer. Forbehandling av cellene med GnRH-A øker den antiproliferative effekt av docetaxel vesentlig; denne effekten er spesifikk, siden den er fullstendig opphevet ved den cotreatment av cellene med Ant. (D) Ved slutten av behandlingene (utført som beskrevet i B), ble cellenes levedyktighet målt ved trypan blå eksklusjon assay. Antallet av døde celler ble målt ved å telle trypanblått-fargings celler. Data er uttrykt som prosent av fargede celler /totalt antall celler. Docetaxel øker i betydelig grad antallet av døde celler; ved alle tidsintervaller, er denne effekten forsterkes betydelig ved forbehandling av cellene med GnRH-A. (E) DU145-celler ble forbehandlet med GnRH-A i 24 timer og deretter behandlet med docetaxel i 72 timer. Ved slutten av behandlingen caspase 3-lignende aktivitet ble vurdert ved bruk av CaspACE kolorimetrisk analyse kit. Forbehandling av cellene med GnRH-A potenserer proapototic effekten av docetaxel i form av caspase-3 aktivitet i betydelig grad. Effekten er spesifikk, siden den motvirkes av den samtidige behandling med pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK. I B-E hver forsøksgruppe besto av seks replikater og hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05
versus
C (ubehandlede kontroller); **
P
. 0,05
versus
docetaxel-behandlede celler
Disse resultatene tyder på at det i p53-positive DU145 prostatakreftceller GnRH-agonister spesielt bevisst cellene til den cytotoksiske aktivitet av docetaxel; denne effekten er sannsynlig konsekvens av GnRH-A-indusert aktivering av p38 /p53 /Bax apoptose signalveien.
GnRH agonister Resensitize p53-positive DU145 Celler til den cytotoksiske aktivitet av Docetaxel
for å få docetaxel-resistente celler (DU145-R), ble DU145 cellene serielt behandlet med docetaxel (en gang i uken i 8 uker) før de utviklet evnen til å vokse i nærvær av stoffet. I disse celler, ble motstanden mot den cytotoksiske forbindelse assosiert med en signifikant reduksjon av Bax nivåer, uten noen endring i nivået av ekspresjon av Bcl-2 (fig. 5A), noe som bekrefter tidligere observasjoner som rapporterer liten enighet mellom taxan-motstand og overekspresjon av BCL-2 [60]. På den annen side, våre data viser klart at de DU145 celler kan kontrast og overvinne den antitumoraktivitet av kjemoterapeutiske medikamenter ved å øke forholdet mellom anti- og proapoptotiske proteiner. Ved klonogene analysen, så undersøkte vi om GnRH-agonister kan resensitize docetaxel-resistente prostata kreft celler til proapoptotiske aktivitet av kjemoterapeutiske stoffet. Behandling av DU145-R-celler med GnRH-A (24 timer) alene ikke påvirke evnen av cellene til å danne kolonier (fig. 5B). Som forventet, DU145-R celler dannet kolonier i nærvær av docetaxel (72 timer), som bekrefter deres oppkjøp av resistens mot stoffet. Imidlertid kombinasjonsbehandling (GnRH-A i 24 timer etterfulgt av docetaxel i 72 timer) fullstendig avskaffet kolonidannelse evnen til DU145-R-celler (Fig. 5B). Disse resultatene indikerer at GnRH-agonister kan resensitize docetaxel-resistente prostatacancerceller til antitumoraktivitet av det kjemoterapeutiske legemiddel.
DU145 prostatakreftceller ble gjort motstandsdyktige mot docetaxel (Doc) etter behandling med det kjemoterapeutiske legemiddel (10 nmol /L) en gang i uken i 8 sykluser. (A) Western blot-analyse av Bcl-2 og Bax i docetaksel-resistente (DU145-R) celler.
