Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en ødeleggende menneskelig malignitet og gevinst på funksjonelle mutasjoner i
K-ras
onkogen er observert i 75% -90% av pasientene. Studier har vist at onkogene
ras
er ikke bare i stand til å fremme cellevekst og overlevelse, men også apoptose, avhengig av omstendighetene. Ved hjelp av bukspyttkjertelkreft cellelinjer med eller uten uttrykke muterte
K-ras
, viste vi at hemming av endogen PKC aktivitet sensibilisert menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler (MIA og PANC-1) som uttrykker mutert
K-ras
til apoptose, som ikke hadde noen effekt på apoptotisk BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler som inneholder en normal Ras, så vel som human lunge epiteliale BAES-2B-celler. I denne apoptotiske prosess, ble nivået av ROS øket og Puma ble oppregulert i en p73-avhengig måte i MIA og PANC-1-celler. Deretter caspase-3 ble spaltet. En full induksjon av apoptose som kreves til aktivering av både ROS- og p73-medierte veier. Dataene tyder på at PKC er en avgjørende faktor som takler avvikende
K-ras
å opprettholde homeostase av kreft i bukspyttkjertelen celler husing muterte
K-ras
. Men undertrykkelse eller tap av PKC forstyrrer balansen og initierer en apoptotisk krise, der ROS og p73 ser potensialet, sentrale mål
Citation. Shen L, Kim SH, Chen CY (2012) Sensibilisering av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler som mutert
K-ras anbefale til apoptose. PLoS ONE syv (7): e40435. doi: 10,1371 /journal.pone.0040435
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 20 mars 2012; Akseptert: 6 juni 2012; Publisert: 25.07.2012
Copyright: © 2012 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble delvis støttet av en intern JCRT (Joint Senter for strålebehandling, Harvard Medical School) og National Institute of Health 1RO1CA100498 tildelt Chang Yan Chen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en sykdom med et dystert syn. I USA, er ca 33 000 pasienter diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen hvert år, og nesten like mange vil dø av denne ondartede sykdommen [1] – [3]. På verdensbasis forårsaker kreft i bukspyttkjertelen et betydelig antall dødsfall årlig. Flere funksjoner i denne ødeleggende sykdommen er ansvarlig for den høye dødeligheten, på grunn av vanskeligheter med å oppdage forstadier eller merke symptomene før i avanserte stadier. Kreften gjennomgår ofte mikrometastasering, som er ansvarlig for en dårlig prognose av denne sykdommen. I tillegg er avansert kreft i bukspyttkjertelen ofte resistente mot konvensjonell kjemoterapi eller radioterapi. Alle disse indikerer at det haster for å utvikle nye strategier for å behandle denne dødelige sykdommen.
Genetisk, epigenetiske og miljøfaktorer er involvert i dannelsen og utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen [1]. Patogenese av denne sykdom er gjennom akkumulering av genetiske og molekylære forandringer, noe som resulterer i defekter i vekst, adhesjon og integrering av pancreases. De molekylære endringer i denne human malignitet har vist seg å inkludere endringer i vekst-relaterte molekyler, tumor-suppressorer og cellesyklus regulatorer [4] – [7]. Forstyrrelser i intracellulær, mitogene signaliseringsreaksjonsveier eller spredningsbegrensninger tilveiebringe en fordel å tumorceller for deres vekst eller overlevelse. Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) familie er plasmamembranen glykoprotein og ble vist å spille en avgjørende rolle i bukspyttkjertelkreft initiering og utvikling [8] – [10]. Medlemmene av EGFR har blitt rapportert å være overuttrykt ofte i kreft i bukspyttkjertelen celler, som accordantly aktiverte nedstrømssignalveier, for eksempel Ras og ERK, for å fremme cellevekst og overlevelse [11].
Selv om en rekke genetiske avvik markører har blitt identifisert i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen lesjoner, ble de hyppigste mutasjoner identifisert i
K-ras
, og tett følgende hendelser var inaktivering av tumor undertrykkere av p16, ARF, p53 og SMAD4 [ ,,,0],12] – [14]. K-Ras tilhører Ras familien proteiner som er små cytoplasmatiske GTP bindende proteiner [15]. Konstitutivt aktive Ras forbinder med GTP, og overfører ukontrollerbare, mitogen-stimulerende signal til nedstrøms effektbokser, inkludert Raf /MAPK, PI3K /Akt, JNK /p38 og RalGDS. En musemodell av kreft i bukspyttkjertelen viste at betinget ekspresjon av en onkogen allel av
K-ras
var i stand til å danne pre-ductal lesjoner som kommet til invasive og metastatisk kreft på en lav frekvens. Samtidig knockout av P14 og ARF fremmet og forvandlet disse pre-lesjoner til svært invasive og metastatisk kreft [12] – [14]. Disse resultatene indikerer at K-Ras-aktivering induserer pre-pankreatiske sår og tumor-suppressorer (slik som p14 eller ARF) funksjon for å begrense den ondartet omdannelse av disse forløpere [12] – [14]. Men det har ikke vært fullt utforsket hvis disse intracellulære trasé i kreft i bukspyttkjertelen celler kan bli henvist til å slå på celledød program.
Det er vel kjent at Ras kan fremme ikke bare celleproliferasjon eller differensiering, men også programmert celledød. I APO1-mediert apoptose, den ligering med APO1 (apoptose antigen-1) reseptoren forårsaket akkumuleringen av membranlipider og aktivering av ceramid, som i sin tur stimulerer Ras-aktiviteten for induksjon av apoptose [16], [17]. I lymfocytter, spilte Ras en viktig rolle i IL-2-mediert apoptose, som sørget for effektiv omsetning av lymfocytter [18], [19]. Brå aktivering av Ras nedstrøms effektor MAP kinase pathway forfremmet celler til å gjennomgå apoptose [20], [21]. Som svar på stressrelatert stimulering, JNK ut til å fungere på nedstrøms for Ras og indusere apoptose i celler når spenning var vedvarende [22]. Vi rapporterte at onkogene Ha-Ras sensitivisert menneskelige eller murine celler til apoptose når endogen PKC aktivitet undertrykkes [22]. I denne apoptotiske prosess, ble nivået av ROS øket og caspase kaskade ble utløst [22]. Vår studien tar sikte på ytterligere å teste om
K-ras
mutasjon var syntetisk dødelig med tap av PKC i kreft i bukspyttkjertelen celler.
PKC (protein kinase C) familie består av mer enn 11 isoformer som er klassifisert på grunnlag av deres biokjemiske funksjoner og strukturer i de klassiske (cPKCs: α, p og y som er forbolester og kalsiumavhengig), nye (nPKCs: δ, ε, η og θ som er phobol ester-avhengig bare ) og atypiske PKCS (aPKCs: C, X, og som er uavhengige av forbolester og kalsium). Mitogene stimuli (for eksempel vekstfaktorer), gjennom å øke membranen DAG (diacylglycerol), aktiverer PKC. Mens undersøkelser har vist at PKC var involvert i forbolester-mediert mitogen respons, er det nå klart at PKC-aktivering kan hemme cellevekst eller til og med utløse apoptose, avhengig av typer av isoformene, differensialkopling til effektorer [23], [24] . For eksempel, PKC α formidler ofte proliferative eller tumorigen respons. I tarm eller mammary celler, de samme isoformer av PKC delta i anti-proliferative responser. Imidlertid kan forskjellige PKC-isoformer i den samme type celler fungerer motsatt. I murine NIH3T3, rotte R6 eller normale menneskelige colonic epitelceller, overekspresjon av PKC δ forårsaket veksthemming og samtidig øke nivået av PKC iU initiert transformasjonsprosessen [25] – [27]. Emerging bevis sterkt antydet at PKC δ ofte fungerer som en tumor suppressor [24], [28]. Undersøkelser har vist at PKC-S ikke bare var en negativ regulator av cellesyklusprogresjon eller positiv mediator av apoptose, men også gjengitt en høy motstand mot huden tumorvekst indusert ved DMBA-forbolester i dyremodeller [29], [30].
crosstalk mellom PKCS og Ras signalveier har blitt observert [31]. I forskjellige typer celler, PKC og Ras samvirke enten i en hierarkisk lineær eller samarbeidende parallelt med hverandre. I respons til mitogen stimulering, ble PKC fosforylert ved forskjellige serinrester og deretter forbundet med SH2 domene av grb-2. Komplekset inkludert grb-2 /Sos ble i sin tur dannet for å aktivere Ras signalisering i T-lymfocytter [32]. Aktivering av PKC og Ras i lymfocytter var da i stand til å mobilisere PI3 kinase å generere PIP3 og videre føre til ulike protein kinase kaskader, som fører til aktivering av AKT og Rac å fremme cellevekst-relaterte aktiviteter. Det ble også rapportert at gjennom å påvirke Rel aktivitet, PKC hatt en negativ innflytelse på Ras-mediert signalisering [31]. I visse maligne celler, ble PKC aktivert og i stand til å mediert BCL-2 fosforylering for å overleve fremme [33], [34]. Ved å blokkere pro-apoptotiske signalveier, PKC-indusert aktivering av BCL-2 ble foreslått å spille en betydelig rolle i lunge tumorigenesis. Hemming av PKC av farmakologiske hemmere i dyrkede humane lunge kreftceller utløste en apoptotisk respons [35]. Vår nåværende studien viste at Ras fortrinnsvis indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler som en aktiv
K-ras
etter blokaden av PKC. Våre data antydet at samarbeidet med PKC dukket avgjørende for kreft i bukspyttkjertelen celler som muterte K-Ras å overleve.
Resultater
Sensibilisering av kreft i bukspyttkjertelen celler som mutert K-ras til apoptose etter behandling med GO6976
duell funksjonene i Ras å fremme cellevekst og apoptose ble godt dokumentert [20], [22]. Tidligere har vi vist at co-hemming av PKC α og β uttrykk eller aktivitet var dødelig for museceller overekspresjon
v-ras product: [22], [28]. Siden
K-ras mutasjoner
blir påvist i de fleste av pankreas adenokarsinom lesjoner [1], førte oss til å undersøke i hvilken grad kreft i bukspyttkjertelen celler i apoptose som respons på behandling med GO6976 (a PKC-inhibitor er spesifikk for PKC a og β). Uttrykket og aktiveringsstatusen til K-Ras i forskjellige humane bukspyttkjertel cancer cellelinjer og humane lunge epitelceller ble testet. Nivået av Ras-ekspresjon i humane kreft i bukspyttkjertelen MIA eller PANC-1-celler var sammenlignbart med det i lunge epiteliale BEAS-2A celler og en redusert mengde av Ras ble påvist i kreft i bukspyttkjertelen BxPC-3-celler (fig. 1A). Deretter ble lysater fra disse cellene utfelt med en RBD (Ras bindingsdomene av Raf) -GST fusjonsprotein for å teste aktiveringsstatusen til Ras. Et aktivert Ras ble ko-utfelt med fusjonsproteinet i MIA og PANC-1-celler, men ikke i BxPC-3 eller BEAS-2B-celler (Fig. 1B). Størrelsen av Ras-aktivering i MIA var høyere enn i PANC-1-celler.
A. Ekspresjon av Ras ble undersøkt ved immunblotanalyse i human bukspyttkjertelkreft BxPC-3, MIA, PANC-1 eller lunge epiteliale BEAS-2B-celler. Foldene av uttrykket nivåer av Ras i kreft i bukspyttkjertelen celler i forhold til at det i BEAS-2B celler ble målt og indikert. Lik belastning av de totale proteiner per kjørefelt ble bestemt ved β-aktin. B. Ras GTP-bindende aktivitet ble mål i disse cellene ved Ras-GTP analysen. Blottet ble re-analysert av anti-Ras antistoff for å dømme jevnt lasting av totale proteiner.
Deretter undersøkte vi uttrykket av PKC i disse cellene, samt deres svar på PKC aktivator PMA (phorbol myristat acetat) eller hemmer GO6976. En tilsvarende uttrykk nivå av PKC ble påvist i alle cellelinjer (Fig. 2A). Induksjons PKC-aktivitet med PMA og inhiberende effekt av GO6976 på PMA-induserte PKC-aktivitet ble også undersøkt ved anvendelse av et PKC-kinase-aktivitet kit (Fig. 2B). I ubehandlede MIA eller PANC-1-celler, PKC-aktivitet var litt høyere enn i ubehandlede BxPC-3 eller BEAS-2B-celler. Behandlingen med PMA økt dramatisk aktivitet av denne kinasen i alle cellelinjer, som ble inhibert med GO6976, noe som indikerer at PKC var funksjonelt i alle celler som ble testet.
A. Cellelysater isolert fra ubehandlede celler ble immunoblottet med anti-pan-PKC antistoff.
β
p-aktin ble benyttet for å bestemme lik lasting av totalt protein pr kjørefelt. B. Cellelysater fra cellene med eller uten å bli behandlet med PMA eller PMA pluss GO6976, ble immunopresipitert med anti-pan-PKC-antistoff. De immunokomplekser ble inkubert med [
32P] γ-ATP og peptidsubstrater for å analysere PKC-aktivitet. De feilfelt representert SD fra tre uavhengige forsøk (n = 3,
ρ
0,05).
PKC og Ras er avgjørende intracellulære signal transdusere og delta i overføring av signaler til regulere ulike biologiske eller patogene biologisk aktivitet. Induksjon av apoptose av PKC undertrykkelse ble rapportert i murine eller humane celler som uttrykker onkogen
ras product: [20], [22], [28]. For å teste om GO6976 var i stand til å indusere apoptose i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer med eller uten uttrykke muterte
K-ras
, annexin V Analysen ble utført (Fig. 3A og B). GO6976 behandling dramatisk sensibilisert MIA og PANC-1 celler til apoptose og spilte noen rolle i induksjon av apoptose i BxPC-3-celler som inneholder normal Ras-signalisering, så vel som i human lunge epiteliale BEAS-2B-celler. Spesielt, MIA-celler hvori Ras-aktiviteten var høyere var mer utsatt for GO6976-indusert apoptose enn PANC-1-celler. For å avgjøre om Ras var ansvarlig for induksjon av apoptose, ble famesyltransferaseinhibitoren (FTI) for å undertrykke Ras aktivitet (Fig. 3C). I nærvær av FTI, GO6976 behandling var ikke i stand til å indusere apoptose i MIA eller PANC-1-celler. Dataene antydet at mutert K-Ras, sammen med tap av PKC funksjon, dukket dødelig og dette dødelige reaksjon kan være regulert av mutert Ras.
A. Celler ble behandlet med GO6976 (1 uM) i 48 timer og deretter samlet for annexin V-analyse. Feil barer er SD fra 5 uavhengige forsøk (n = 5,
ρ
0,05). B. Profiler av cellene etter å ha blitt farget med annexin V. C. Celler ble behandlet med FTI i 30 minutter før GO6976 behandling. Deretter ble annexin V assay gjennomføres. Feil barer er SD fra 5 uavhengige forsøk (n = 5,
ρ
0,05)
oppregulering av ROS ved GO6976 i kreft i bukspyttkjertelen celler som muterte K-ras for. induksjon av apoptose
ROS (reaktive oksygenforbindelser) er kjent for å være nødvendig for cellevekst og tvert imot, en vedvarende økning i ROS ble vist å være i stand til å forårsake DNA-skade eller utløse apoptose [36]. Studier viser at ROS i celler som uttrykker onkogener (for eksempel
ras
) ble ofte forsterket, noe som kan skyldes høye metabolske behov neoplastisk vekst [36]. ROS nivåer i kreft i bukspyttkjertelen og BEAS-2B-celler ble målt under normale vekstbetingelser, eller etter behandlingen med GO6976 (Fig. 4A). En moderat mengde av ROS ble påvist i MIA eller PANC-celler, som var dramatisk forhøyet etter tilsetning av GO6976. ROS var på basislinjenivåer i ubehandlet BxPC-3 eller BEAS-2B-celler og behandlingen med PKC-inhibitoren ikke påvirke ROS-produksjon eller opphopning.
A. Cellene ble behandlet med GO6976 eller ko-behandlet med GO6976 pluss NAC (2,5 mM). Etter å ha blitt farget med DCF, ble nivåene av ROS i cellene analysert ved hjelp av et strømningscytometer. B. Cellene ble behandlet med GO6976 (1 uM) eller GO6976 pluss NAC. Deretter ble prøvene samlet opp og underkastet for annexin V-analyse. Feil barer er SD fra 5 uavhengige forsøk (n = 5,
ρ
0,05).
For å finne ut om ROS spilt en rolle i induksjon av apoptose følgende PKC hemming i kreft i bukspyttkjertelen celler som uttrykker mutert
K-ras
, annexin V-analysen ble utført (fig. 4B). Igjen, MIA og PANC-1-celler som var følsomme for GO6976 behandling, som var delvis, men betydelig blokkert av NAC (N-acetyl-L-cystein, en ROS-inhibitor). Siden NAC ikke helt redusert apoptose i disse celler, er det foreslått deltakelse av andre baner i utførelsen av denne celledød programmet. Konsekvent, kreft i bukspyttkjertelen celler uten uttrykker mutert
K-ras
eller human lunge epitel BEAS-2B celler var ikke-responsive til GO6976 samt til kombinasjonsbehandling av GO6976 pluss NAC.
Activation av caspase 3 i denne Dødelig reaksjonen oppsto i MIA eller PANC-1 celler
caspase familie består av mer enn 10 medlemmer [37]. Som svar på apoptotiske stimuli, ble caspase-3 vist seg å fungere som en bøddel i caspase kaskade for gjennomføring av celledød programmet [37]. I denne prosessen ble caspase-3 nødvendig for å bli spaltet i en liten, aktivt fragment. For å teste aktiveringsstatusen til kaspase 3, ble nærværet av spaltet caspase 3 i MIA eller PANC-1-celler analysert ved immunoblotting (Fig. 5A). Etter behandling med GO6976, en liten, spaltet caspase-3 virkelig var tilstede i disse to kreft i bukspyttkjertelen celler. Den aktive form av denne caspase var detekterbar i GO6976-behandlede BxPC-3 eller BEAS-2B-celler (data ikke vist). For ytterligere å undersøke aktiveringen av caspase 3 under samme eksperimentelle omgivelser, var kaspase 3 aktivitet analysert (fig. 5B). Etter behandlingen med inhibitoren, ble aktiviteten av denne protease oppregulert i MIA og PANC-1-celler, som ble delvis undertrykt ved tilsetning av NAC. Konsekvent, aktiviteten av caspase 3 var fraværende i GO6976-behandlede BxPC-3-celler som uttrykker uten muterte
K-ras
eller BEAS-2B-celler. Resultatene antydet at caspase 3 deltatt i gjennomføringen av GO6976-indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler husing onkogene
K-ras
.
A. Med eller uten GO6976 behandling, ble cellelysater fremstilt og immunoblottet med anti-kaspase 3 antistoff. B. Cellene ble underkastet behandling med GO6976 eller GO6976 pluss NAC. Deretter ble annexin V-målingen ble utført. De feilfelt representerer SD fra 3 uavhengige eksperimenter (n = 3,
ρ
0,05).
oppregulering av den apoptotiske Factor PUMA i en p73-avhengig Fashion Under GO6976- Apoptose indusert
p73 hører til p53 familie og deler homologi med p53 ikke bare i sine sekvenser, men også den transaktivering, DNA-bindende eller oligomerisering funksjoner [38]. I p73-mediert apoptose, ble den apoptotiske relatert faktor Puma ofte oppregulert [38]. Vi har tidligere rapportert at etter PKC hemming, p73 i murine fibroblaster ectopically uttrykke
Ha-ras
ble aktivert og ansvarlig for igangsetting av apoptose [28]. I løpet av denne celledødsprosessen, ble p73 fosforylert ved sine serinrester [28]. For å teste om p73 ble fosforylert i GO6976 behandlet MIA eller PANC-1 celler ble immunoblot analyse utført (Fig. 6A). Fosforylering av p73 ble forekom ved sine serinrester i de behandlede celler, men ikke i kontrollceller. Den GO6976-mediert p73 fosforylering ikke endret ved tilsetning av NAC. Deretter uttrykket av p73-regulert
PUMA
genet i MIA eller PANC-1 celler ble undersøkt ved real-time PCR-analyse (Fig. 6B). Nivået av genekspresjon i cellene var signifikant økt etter behandlingen med GO6976. Oppregulering av genet ble igjen uforandret i nærvær av NAC, men fullstendig undertrykt ved den forbigående infeksjon av
shRNA-p73
. Konsekvent, ble proteinet uttrykket utvidet etter behandlingen med den PKC-inhibitor (fig. 6B). Innføringen av
shRNA-p73
inn i cellene også blokkert induksjon av PUMA protein, som ikke ble påvirket ved tilsetning av NAC (data ikke vist). Det viste seg at PUMA var involvert i aksen av p73-mediert signalisering i dette apoptotiske prosessen.
A. Med eller uten behandling med GO6976 eller GO6976 pluss NAC, ble lysater immunopresipitert med anti-p73-antistoff. Immunopresipitatene ble deretter utsatt for immunblotting ved bruk av anti-fosforylerte serin antistoff. Nivået av immunopresipitatene ble bedømt ved å re-undersøkelser av blot med anti-p73-antistoff. B. Total RNA fra cellene med eller uten behandling med GO6976, GO6976 pluss NAC eller GO6976 pluss
shRNA-p73
infeksjon ble isolert. Lik mengde av RNA ble revers-transkribert og uttrykket for
Puma
ble testet ved hjelp av RT-PCR. C. Med eller uten GO6976 behandling, MIA eller PNAC-1 celler ble utsatt for immunblotanalyse for PUMA uttrykk. Lik lasting av totale proteiner ble bestemt av rep-undersøkelser av blot med anti-β-actin antistoff.
Samarbeid for ROS og p73 for Induksjon av GO6976-mediert apoptose
Det er vel kjent at flere, apoptotiske signalbaner som blir integrert for en fullstendig utførelse av celledød program. Siden ROS og p73 dukket ta del i induksjon av apoptose i GO6976 behandlet kreft i bukspyttkjertelen celler som muterte
K-ras
, vi først testet om p73 spilt noen rolle i oppregulering av ROS i kreft i bukspyttkjertelen celler ( fig. 7A). Igjen, en moderat blandt av ROS ble påvist i ubehandlet MIA eller PANC-1-celler, som ble ytterligere økt etter PKC-inhibering. Den forbigående infeksjon av
shRNA-p73
hadde ingen innflytelse på induksjon av ROS, noe som tyder på at p73 i vår eksperimentelle innstillingen var ikke involvert i ROS signalering. Deretter ble caspase-3 aktivitet analysert etter knockdown av p73 eller ko-inhibering av p73 og ROS (fig. 7B). Innføringen av
shRNA-p73
delvis blokkert aktiviteten av caspase-3 i GO-6976-behandlet MIA eller PANC-en og aktiviteten til denne protease ble fullstendig avskaffet etter at co-undertrykkelse av p73 og ROS. Forekomsten av apoptose etter de samme behandlingene ble deretter analysert med annexin V-analyse (Fig. 7C). Knockdown av
p73
delvis hemmet GO6976-indusert apoptose prosess i MIA eller PANC-1 celler. I fravær av både
p73
og ROS, GO6976 var ute av stand til å initiere apoptose i disse celler. Dataene antydet at minst to apoptotiske veier. P73 og ROS tok del i denne dødelig reaksjon
Nivået ROS i cellene behandlet med GO6976 eller GO6976 pluss
shRNA-p73
infeksjon var analysert. De feilfelt representerer SD fra 3 uavhengige eksperimenter (n = 3,
ρ
0,05). B. Aktiviteten av caspase 3 i cellene behandlet med GO6976, GO6976 pluss
shRNA-p73
infeksjon eller GO6976 pluss NAC pluss
shRNA-p73
infeksjon ble undersøkt. De feilfelt representerer SD fra 3 uavhengige eksperimenter (n = 3,
ρ
0,05). C. Annexin V-analyse i MIA og PANC-1 celler behandlet med GO6976, GO6976 pluss
shRNA-p73
infeksjon eller GO6976 pluss NAC pluss
shRNA-p73
infeksjon ble utført. De feilfelt representerer SD fra 3 uavhengige eksperimenter (n = 3,
ρ
0,05).
Diskusjoner
Kreft i bukspyttkjertelen er en ødeleggende menneske malignitet og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall [1]. Prognosen for denne sykdommen er sturen, på grunn av mangel på effektive behandlinger. Det er kjent at forsterkningen av funksjonsmutasjoner i
K-ras
opptrer på tidlige stadier i human bukspyttkjertelcancerpasienter eller musemodeller som ble generert ved utstansing av tumorsuppressorgener av
p16, Arf
, eller
p53
, henholdsvis eller i kombinasjoner [12] – [14]. Disse funnene indikerer viktigheten av K-Ras i tilblivelsen og utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Målet med vår studie var å utforske den nye strategien rettet mot onkogene Ras for bukspyttkjertel therapeutics. Denne studien viste at avvikende, muterte
K-ras
var i stand til å re-direkte kreft i bukspyttkjertelen celler mot å apoptose etter undertrykkelse av PKC. I denne apoptotiske prosessen, flere signalveier var involvert. Etter behandlingen med den PKC-inhibitoren, nivået av ROS i de pankreatiske kreftceller som uttrykker muterte
K-ras
ble hevet, sammen med induksjon av apoptose. Imidlertid er tilsetningen av NAC delvis blokkerte celledødsprosessen. p73 var fosforylert, og PUMA gen og protein ble oppregulert. Videre caspase 3 ble spaltet for gjennomføring av celledød program. Den co-hemming av ROS og p73 oppnådd en ultimate blokaden effekt på apoptose i GO6976-behandlede kreft i bukspyttkjertelen celler husing muterte
K-ras
. Dermed indikerer vår studie at avvikende Ras, sammen med tap av PKC er syntetisk dødelig i kreft i bukspyttkjertelen celler. Dataene også foreslått en mulig balanse mellom Ras og PKC som bestemmer terskelen av apoptose i cellene.
mutasjonsaktiveringer av
ras
gener er en av de viktigste hendelsene under initiering og utvikling av ulike typer av humane maligniteter [15]. I prosessen med transformasjon, vedvarende økninger i Ras aktivitet bryteren på forskjellige nedstrøms effektor veier, som fører til fosforylering kjedereaksjoner for aktivering av pro-veksttranskripsjonsfaktorer [39]. Til tross for den avgjørende engasjement i cellevekst og differensiering, hyperaktive Ras, under visse omstendigheter, kan bli henvist til apoptose. Tallrike studier har fremhevet roller Ras i reguleringen av apoptose [20]. Spesielt har det blitt observert at behandlinger med PKC-inhibitorer kan indusere apoptose i murine fibroblaster eller rottelunge epitelceller overekspresjon onkogen
ras product: [22], [28]. Her viser vi at PKC aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler som muterte
K-ras
ble litt utvidet, som kan være nødvendig for å takle abnormt høy Ras aktivitet for å overleve. Etter PKC ble undertrykt, mutert K-Ras ikke kunne opprettholde høye metabolske behov kreftceller og dødelig reaksjon ble igangsatt. Siden høye prosenter av kreft hos mennesker husing onkogene
ras
, vises PKC en ideell intracellulær mål for induksjon av apoptose, med lav eller ingen toksisk effekt på omkringliggende normalt vev eller celler.
Mer enn 11 serin /treonin-proteinkinaser tilhører PKC-familie, hvorav noen er strukturelt distinkte eller funksjonelt variert. Det er imidlertid en funksjonell redundans blant disse PKC isozymer for å gjenopprette normale fysiologiske status når en eller flere av PKC isozymer er slått ut eller ikke-funksjonell. Rollene til PKC-isoformer i reguleringen av cellevekst eller død er ganske kontroversiell, avhengig av forskjellige typer av celler eller cellulære sammenhenger. For eksempel har det blitt foreslått at PKC α, β, o besatt duel roller i regulering av kreftutvikling, eller programmert celledød, noe som indikerer kompleksiteten av disse PKC isozymer [24]. Cross-forhandlingene mellom PKC isoformer og med andre intracellulære signal transdusere var ofte til stede i et hierarki ordre eller ulike avdelinger for å veilede celler for å oppnå ulike utfall. Det ble også vist at PKC og Ras-signalveier ble koblet sammen, spesielt i lymfocytter [24], [40]. Ved mitogen stimulering, SH2-bindingssetene av PKC ble fosforylert, som i sin tur rekrutterer GRB2 /SOS kompleks og ytterligere aktivert Ras-signalisering i T-lymfocytter [24]. PKC ble rapportert å negativt regulert Ras-reaksjonsveien, ved å påvirke dens effektor Rel [24]. I NIH3T3 celler ectopically uttrykker
v-Ha-ras
, p73 fungerte nedstrøms PKCα og β og som en sensor for å bestemme terskelen av apoptose [22]. Ved hjelp av PKC-inhibitoren GO6976 som inhiberer den forbolester-avhengige PKC-isoformer, har vi i denne studien viste at kreft i bukspyttkjertelen celler med hyperaktiv K-Ras kan bli effektivt sensibilisert overfor apoptose. Undersøkelsen å identifisere nøkkel PKC isoform (e) i reguleringen av denne apoptotiske prosessen er i gang.
ROS fungerer ofte som et intracellulært signal svinger av vekstfaktorer [36]. Noen mitogene stimuli er i stand til å øke nivået av intracellulær ROS, noe som resulterer i endring av struktur av cytoskjelettet og videre å indusere transformasjon [36]. I PC12-celler ble Ras vist seg å oppregulere ROS produksjon på EGF stimulering [41]. Studier har også vist at onkogener (for eksempel
myc
eller
ras
), gjennom vedvarende perturbing staten intracellulære redoks, var i stand til å forårsake kromosomavvik og senere forstyrre genetiske integriteten til fremme tumorigenesis [36 ]. Til tross for regulering av celleproliferasjon og transformasjon, ble en økning i ROS slått å spille en obligatorisk rolle i induksjon av apoptose [22]. I TNFa-indusert programmert celledød, NF-kB og JNK samarbeidet for å stimulere ROS produksjon, som fører til caspase kaskade og mitokondrie depolarisering [42]. Ektopisk uttrykk for
Ha-ras
i murine fibroblaster indusert celledød gjennom å få fram ER (endoplasmatiske retikulum) stress og aktivering av UPR (utfoldet protein respons) [22]. Denne studien viste at selv om ROS ble moderat forhøyet i bukspyttkjertelcancerceller som uttrykker muterte
K-ras
under normale vekstbetingelser, inhibering av PKC alvorlig forstyrret likevekt av redoks-tilstand og induserte en signifikant akkumulering av ROS i celler. Således synes PKC en viktig faktor for å opprettholde homeostase av kreft i bukspyttkjertelen celler som bærer en avvik
K-ras
.
p73 representerer p53 familie proteiner og, deler den strukturelle og funksjonelle homolog med p53 [38]. Undersøkelser viste at p73 spilte en betydelig rolle i DNA damage- eller stress-indusert apoptose. Nuclear c-Abl ble aktivert ved genotoksiske stress og ytterligere fosforylerte p73 for induksjon av apoptose [43]. I denne celledød prosessen, kjerne c-Abl samhandlet med p73 og videre stimulert p73-regulert aktiviteter. Det ble også vist at som respons på ioniserende stråling eller cisplatinbehandling, spilte p73 en nøkkelrolle i overføring av den apoptotiske signalering [44]. I murine fibroblaster overekspresjon
v-Ha-ras
, PKC δ samhandlet med og videre aktivert p73 å utløse en apoptotisk krise [28]. I denne studien demonstrerte vi at p73 ble fosforylert i kreft i bukspyttkjertelen celler husing muterte
K-ras
, og deretter oppregulert nivået av ekspresjon av den apoptotiske faktor Puma. Den underliggende mekanismen som PUMA deltar i denne apoptotiske prosessen gjenstår å bli ytterligere undersøkt.
I sammendraget, genetiske mutasjoner i
K-ras
vises entydig til stede i 90% av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen lesjoner og denne sykdommen er en av de viktigste årsakene til kreftdødsfall. Det er derfor et stort behov for funn av effektive behandlinger klinisk.
