Abstract
Innvielse, vekst, tilbakefall og metastasering av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) har vært knyttet til oppførselen til kreft stamceller (CSC) som kan identifiseres ved sin aldehyd-dehydrogenase -isoform-en (ALDH1) aktivitet. Vi kvantifisert og beriket ALDH1
+ celler i HNSCC cellelinjer og deretter preget deres fenotypiske og funksjonelle egenskaper som invasjon kapasitet og epitelial-mesenchymale overgang (EMT). Spheroid kultur beriket CSC fra fem HNSCC cellelinjer med opptil fem ganger. I sfæroide-deriverte celler (SDC) og foreldre monolag-avledet cellelinje ALDH1, CD44, CD24, E-cadherin, α-SMA, og vimentin uttrykk ble sammenlignet med flow-cytometri og immunfluorescens sammen med spredning og cellesyklusanalyse. Invasion aktivitet ble evaluert av Matrigel analyse og uttrykk for stemness relaterte transkripsjonsfaktorer (TF) Nanog, Oct3 /4, Sox2 og EMT-relaterte gener Snail1 og 2, og vri ved real-time PCR. Alle cellelinjer dannet kuler som kan fornye seg selv og bli serielt gjen passeres. ALDH1 uttrykk var betydelig høyere i SDC. ALDH1
+ celler viste økt koloni-formasjon. Andelen av celler med en antatt CSC markør konstellasjon av CD44
+ /CD24
– var svært variabel (0,5% til 96%) i monolags og sfæroide kulturer og overlappet i 0% -33% med CD44
+ /CD24
– /ALDH1
+ celle undergruppe. SDC hadde signifikant høyere invaderende aktivitet. mRNA av stemness relaterte gener Sox2, Nanog, og Oct3 /4 ble betydelig økt i SDC av alle cellelinjer. Twist var signifikant økt i to mens Snail2 viste en signifikant økning i ett, og en signifikant reduksjon i SDC av to cellelinjer. SDC hadde en høyere andel G0 fase, viste ekspresjon på høyt nivå av α-SMA og vimentin, men signifikant redusert E-cadherin uttrykk. HNSCC-linjer båtplass potensial CSC, preget av ALDH1 og stemness markør TF uttrykk samt egenskaper som invasivitet, quiescence, og EMT. CSC kan bli beriket av forankrings uavhengig kultur teknikker, som kan være viktig for etterforskningen av deres bidrag til behandling motstand, tumorresidiv og metastase
Citation. Chen C, Wei Y, Hummel M, Hoffmann TK, Gross M, Kaufmann AM, et al. (2011) bevis for epithelial-Mesenchymale Overgang i kreftstamceller på hode og hals Plateepitelkarsinom. PLoS ONE 6 (1): e16466. doi: 10,1371 /journal.pone.0016466
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 20 september 2010; Godkjent: 20 desember 2010; Publisert: 27 januar 2011
Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert i sin helhet av penger fra Charite-Universitätsmedizin. Ingen eksterne finansieringskilder for denne studien ble brukt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
HNSCC står for omtrent 6% av alle krefttilfeller og for ca 650 000 nye tilfeller og 350.000 dødsfall på verdensbasis hvert år [1], [2], [3]. Fremskritt i terapi har bedret livskvalitet, men overlevelse har vært uendret de siste tiårene. Dødelighet av denne sykdommen er fortsatt høy på grunn av utviklingen av fjernmetastaser og fremveksten av lokale og systemiske residiv motstandsdyktig mot kjemoterapi og strålebehandling. Det er derfor viktig å utvikle en dypere forståelse av biologien til denne sykdommen for å utvikle mer effektive terapeutiske tilnærminger.
Bevis har nylig vært samler for å støtte hypotesen om at svulster inneholde en liten undergruppe av celler som kalles kreft stilk celler (CSC), som viser selvfornyende kapasiteter og er ansvarlig for svulst vedlikehold og metastase [4]. CD44
+ /CD24
-cellene er for det første foreslått å stille CSC eiendommer i brystkreft [5].
Deretter CD133 ble funnet å identifisere CSC i hjernesvulst [6], tykktarmskreft [7], og pankreatisk karsinom [8]. I HNSCC, Prince et al. første gang påvist at en CD44
+ populasjon av celler som besitter egenskapene til CSC [9], men relativt høye antall av disse cellene ( 5.000 celler) var nødvendig for å generere nye tumorer i immundefekte mus indikerer enten en lav frekvens av CSC eller en lav spesifisitet CD44 som CSC-markør i HNSCC. Sistnevnte hypotese støttes av den observasjon at CD44s og CD44v6 uttrykk ikke skiller normal fra godartet eller ondartet epithelia av hodet og nakken. CD44s og CD44v6 var rikelig tilstede i de aller fleste cellene i hode og nakke vev, inkludert karsinomer [10]. Dermed identifisering av mer spesifikke CSC markører for HNSCC er ønskelig. Nylig ble høy aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1, også kjent som ALDH1A1) aktivitet er vist for å identifisere den CSC i HNSCC og andre epiteliale cancere [11], [12], [13], [14], [15]. Men i brystkreft den ALDH1
+ populasjonen viser en overraskende liten overlapping med det tidligere beskrevne CD44
+ /CD24
– fenotype på bare 0,1 til 1,2%. Interessant, i brystkreft celler som bærer begge fenotyper syntes å være svært tumorigent, være i stand til å generere svulster fra så få som 20 celler [15]. Det gjenstår å fastslå om den samme fenotypiske mønster av stamceller i HNSCC er forbundet med en tilsvarende karsinogent potensial.
Ikke-adherente sfære assays blir i økende grad anvendt for å bedømme stamcelle aktivitet i normalt vev og antatte CSC. Neurosfærene er den mest studerte sfære analysen. Sentralnervesystem celler dyrket på ikke-festede flater gir opphav til neurosfærer som har evne til selvfornyelse, og kan i prinsippet generere alle celletyper i hjernen [16], [17]. Kapasiteten for gjentatt generering av neurosfærer fra enkeltceller blir vanligvis sett på som bevis for selvfornyelse [18]. Nylig ble det beskrevet at sfæroide-avledede celler (SDC) fra gliosarcoma rottecellelinjene har CSC kapasitet [19]. Så langt er det ikke kjent om sfæroide kulturer av HNSCC kan berike for CSC.
Normal blodkreft stamceller er i stand til å fornye seg selv og gi opphav til alle typer blodceller. De er ikke- eller svært sakte dele celler og bor i benmarg nisjer i en sovende tilstand. Evnen til å opprettholde den ikke-delende tilstand, eller med andre termer, opphold i G0 fasen av cellesyklus, er kalt quiescence [20]. Det har blitt foreslått at CSC har mange kvaliteter med normale stamceller siden de aller fleste av dem også skulle bli stillestående og være i stand til å fornye seg selv. Fordi et flertall av anti-kreftlegemidler målrette aktivt delende (sykling) celler, hvilende CSC forblir levende og kan være årsaken for tilbakefall og progresjon av kreft. Ki-67-antigenet er det prototypiske cellesyklusrelaterte nuclear protein, uttrykt ved prolifererende celler i alle faser av aktiv cellesyklus (G1, S, G2 og M-fase), men det er fraværende i hvilende (G0) celler.
en annen mulighet for CSC er å utføre epitelial-mesenkymale overgang (EMT), et nøkkeltrinn i løpet av embryogenesen [21], [22], [23] og sårheling [24]. Nylige bevis antyder at genetiske programmer er relevante for EMT er også forbigående aktiveres i epiteliale kreftformer ved å spille en rolle i progresjon av kreft, gjennom hvilken epiteliale cancere invadere vev og metastasere. Selv om EMT programmet er nødvendig for normal utvikling, det avvikende aktivering av EMT bidrar til forskjellige patologiske tilstander, inkludert fibrose og karsinom progresjon [25], [26]. Under EMT epitelceller bryte ned celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-kontakter og migrere til andre steder i kroppen [27]. Under kreft progresjon, synes EMT å gi kreftceller med kapasitet til å infiltrere omliggende vev og til slutt metastaserer til fjerne steder [28]. Nylig har det blitt rapportert at induksjon av EMT i differensierte udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller førte til oppkjøpet av CD44
+ /CD24
– stamcelle fenotype [29]. Videre ble det vist at disse antatte CD44
+ /CD24
– CSC isolert fra neoplastiske menneskelig brystvev uttrykt høy mRNA nivåer som koder for EMT-assosiert markører Snail1 (SNA), Snail2, og Twist. Ondartede svulster består av kreftceller og tumorassosierte vertsceller, med det sistnevnte tiltrekker mer nylig interesse på grunn av deres deltagelse i tumorinvasjon og metastase, og terapeutisk respons [30], [31]. Myofibroblasts er de viktigste komponentene i tumor stroma. Likevel, opprinnelsen til disse cellene er fortsatt kontroversielt så langt. Uttrykket av alfa-glatt muskulatur aktin (α-SMA) regnes som markør for fullt differensierte myofibroblasts. Emerging bevis viser at myofibroblasts kan utledes fra epitelial (tumor) celler via EMT [32], [33]. Dette begrepet er støttet av den observasjon at kompakte kuler dannet av eggstokkreft celler i ascites skjerm kontraktile oppførsel, har høy kapasitet invaderende in vitro og ekspresjon av α-SMA, som også er forbundet med høy kapasitet kontraktile [34].
i dette arbeidet har vi testet om forankringsuavhengig cellekultur teknikker tillater generering av sfæroide-kulturer og hvis disse kulturene ble beriket for celler med funksjonelle og fenotypiske egenskaper som karakteriserer CSC av HNSCC. Her gir vi bevis for at myofibroblasts kan utledes fra HNSCC bruke en spheroid cellekultur modell som beriker for CSC-lignende celler som preget av en høy andel av ALDH1 positivitet, proliferativ quiescence, og invasiv kapasitet.
Resultater
HNSCC cellelinjer inneholde celler med selvfornyende kapasiteter som danner kreft kuler
Flere ulike tilnærminger har vært brukt til å identifisere CSC. Strategien brukes til våre eksperimenter var in vitro spheroid kolonidannelse metode. Vi undersøkte evnen til fem HNSCC-avledet cellelinjer (UD-SCC1, UT-SCC22, UM-SCC11B, UT-SCC9, UT-SCC24A) å vokse forankring selvstendig som sfæroide-kulturer. Celler ble sådd ut i en tetthet på 20 000 /ml. Etter in vitro dyrking i 5-10 dager i serumfritt medium i henhold til ikke-adherente betingelser, alle undersøkte cellelinjer som dannes sfæroider, som strekker seg fra 50 til 500 celler per sfæroide (figur 1A). Den selvpolerende effekt for disse tumor kuler ble vurdert ved hjelp av fremgangsmåten publisert av Ghods et al [19]. Kort sagt ble sfæroidene samlet opp og dissosiert til en enkelt cellesuspensjon som deretter ble belagt på en klonal tetthet på 1000 celler pr ml. Tumor subspheroids strekker seg fra 20 til 40 celler ble tydelig etter 10 to14 dager (figur 1B, C). I motsetning til dette ble foreldrecellemonolaget kulturer dyrket under de samme betingelser ikke danner kuler hvis belagt ved denne lave konsentrasjon, selv etter 21 dager. Når kulene ble overført tilbake til en vanlig vevskulturkolbe belagt i monolag cellekultur, sfæroidene festet til kolben, og cellene vokste ut fra den sfæroide og dannet et sammenflytende monolag. Fenotypen til disse cellene var identisk med den parencellelinjer (figur 1D).
Representative bilder av cellelinjen UD-SCC1 er vist. (A) Den første generasjonen av kuler. (B) En subspheroid dannet etter poding ved en konsentrasjon på 1000 celler /ml. (C) En sfæroid er dannet i det 21 generasjon. (D) spheroid holde og voksende til konfluens etter replating inn kolber belagt for vev kultur. (E) Foreldrecellelinje vokst permanent som en monolagskultur.
Fenotypisk karakterisering av SDC
uttrykk for den antatte stamcelle markør ALDH1 i SDC og de respektive foreldremonocellelinje anvendt som kontroll ble sammenlignet med CD44
+ /CD24
– uttrykkende populasjon av flerfarget FACS-analyse
Interessant, alt SDC har et økt antall ALDH1 positive celler sammenlignet med foreldrecellelinjer. (Figur 2). Den høyeste andelen av ALDH1
+ celler ble funnet i kuler generert fra UD-SSC1 cellelinje (46,4 ± 8,1%) som var fem ganger høyere enn den tilsvarende foreldrecellelinje (9,4 ± 5,3%).
(A) representant FACS-analyse av to cellelinjer etter Aldefluor farging. Sammenligning av frekvenser av ALDH1 positive celler i monolag til SDC og DEAB kontroll. DEAB er en spesifikk hemmer av ALDH1. (B) Resultatene representerer uttrykk for ALDH1 i celler avledet fra sfæroide kulturer (sikrede kolonner) sammenlignet med monolagcellene (åpne søyler). ALDH1 ekspresjon av SDC er generelt betydelig forbedret (A, B). UD-SCC22, UT-SCC24A, og UM-SCC11B viser en delvis mesenchymale fenotype har allerede relativt høyt ALDH1 uttrykk i foreldrecellelinjer. (** P 0,01, * p 0,05)
Kreftceller med en CD44
+ /CD24
– fenotype ble vist å ha CSC egenskaper i en rekke solide tumorer. [4]. Vi har derfor også undersøkt relativt til CD44 og CD24 uttrykk i HNSCC cellelinjer og fant at andelen av CD44
+ /CD24
– celler er svært variabel (0,5 til 97%). Overlapp med ALDH1
+ celler var liten (0 til 2,2%) med unntak av de to cellelinjene UM-SCC11B og UT-SCC22 som hadde en overlapping på ca 33% og ble komponert til over 95% av CD44
+ /CD24
– celler. Interessant, andelen av CD44
+ /CD24
–celler ble ikke konsekvent beriket av den sfæroide dyrkingsmetoden (tabell 1). Dette resultatet reist spørsmålet hvor godt ALDH1 er egnet for identifisering av celler med CSC eiendommer i HNSCC. Å nærme seg dette spørsmålet, ble ALDH1 positive og negative celler fra kulene generert fra cellelinjene UT-SCC9 og UD-SCC1 atskilt med FACS sortering. Deretter ble deres evne til kolonidannelse vurdert. UT-SCC9 og UD-SCC1 ble valgt fordi sammenlignet med de andre cellelinjer de genererte flere kuler med høyere anrikning av ALDH1
+ celler. Dataene viser at ALDH1
+ celler kan danne 3-4 ganger mer kloner enn ALDH1
– celler (figur 3). Lys mikroskopisk observasjon etter 2 uker viste at klonene dannet av ALDH1
+ celler i gjennomsnitt inneholdt 197 (197 ± 47) celler sammenlignet med 33 (33 ± 16) celler i kloner generert fra ALDH1
– celler (p 0,01). Våre data viser også at én ALDH1
+ celler kan betydelig bedre regenerere en spheroid i en forankrings uavhengig kultur med serumfritt medium supplert med bFGF og EGF (UT-SCC9: 17,1%, UD-SCC1: 19,3%), mens på samme vilkår enkelt ALDH1
– celler regenereres bare i ett tilfelle en spheroid. (Tabell 2, figur S1).
To tusen ALDH1-sortert celler ble sådd og etter 14 dager ble koloniene som dannet kvantifisert. Den ALDH1
+ undergruppe i UD-SCC1 og UT-SCC9 cellelinjer har en høyere klone formasjon effektivitet i forhold til ALDH1
– undergruppe (** p 0,01).
i sammendraget, SDC generert fra HNSCC linjer uttrykker høye nivåer av den antatte CSC markør ALDH1, danner betydelig flere kloner, som også betydelig regenerere oftere inn i kulene så ALDH1
– celler og har en varierende overlapping med den CD44
+ /CD24
-. befolkningen
SDC viser økt invadere kapasitet in vitro
Sentralt i definisjonen av CSC er evnen til å initiere og drive veksten av primær tumor og invasjon og metastasering. En nær sammenheng mellom andelen celler med CSC fenotype (CD44
+ /CD24
-) i primærtumor og utvikling av metastaser i bryst-kreft ble nylig rapportert [35]. Også indikasjon for den metastatisk potensial av cellene med CSC-fenotype i brystkreft kommer fra den observasjon at brystkreft celler som detekteres i benmargen overveiende viste denne fenotype [36].
I analogi til denne observasjonen, vi spurte om CSC avledet av sfæroide kulturer av HNSCC vise en lignende invasiv potensial. Ved å bruke en Matrigel invasjon kammer, sammenlignet vi invaderende kapasiteten av celler enten tas opp i sfæroide eller monolagskultur. SDC fra alle fem testede cellelinjer viste en invaderende kapasitet på 2,1 betydelig økt til 8,6 ganger over foreldrekontroll (figur 4).
Matrigel invasjonen kamrene ble brukt til å sammenligne de invaderende kapasitet mellom celler avledet fra kuler (klekket søyler) eller mono (åpne søyler). SDC fra alle cellelinjer undersøkt viser høyere invaderende aktivitet in vitro enn monolayer-deriverte celler. (** P 0,01, * p 0,05).
Overuttrykte stemness relaterte gener i SDC
Det ble rapportert at Oct4, Sox2, og Nanog, som danner en selvorganisert kjerne av transkripsjonsfaktorer (TF), opprettholde pluripotency og selvfornyelse av menneskelige embryonale stamceller [37], [38]. Vi ønsket å vite om CSC også dele denne funksjonen i TF uttrykk med embryonale stamceller (ES). For dette formål vi kvantitativt sammen mRNA-ekspresjonen av disse TF mellom SDC og sperremonolags-avledede celler. Vi fant at mRNA-nivåer av Oct3 /4, Sox2, og Nanog ble alle signifikant økt i SDC. Den største økningen ble observert i UT-SCC22, der en 52-dobling i Sox2 uttrykk ble funnet i kulene. Den minste endring ble funnet i UT-SCC9, hvor en 1,23 ganger økning i Oct3 /4 uttrykk ble funnet i kulene. Nøkkelen TF involvert i EMT, Snail1 ble også betydelig økt i alle SDC generert fra fem forskjellige HNSCC cellelinjer. Interessant, to andre TF involvert i EMT, Snail2 og Twist, viste et uttrykk mønster i samsvar med CD24 status. I UD-SCC1, UT-SCC9, og UT-SCC24A der de fleste av cellene er CD44
+ /CD24
+, redusert Snail2 nivået i kuler mens Twist viste ingen signifikant endring. Men i UT-SSC22 og UM-SCC11B, som ble komponert til over 95% av CD44
+ /CD24
– celler Snail2 og Twist, viste en signifikant økning (Figur 5). Disse funn underforstått at Snail2 og vri ekspresjonsnivået ble korrelert til CD24 fenotype.
Messenger RNA isolert fra sfæroidene og monolagskulturer ble kvantifisert for ekspresjon av angitte TF. Forholdet mellom ekspresjon i sfæroide til monolag celler er gitt. Signifikante forskjeller ble * p 0,05; ** P 0,01. MRNA nivået av stemness relaterte TF Nanog, Oct3 /4, og Sox2 ble økt bemerkelsesverdig i kulene. Nøkkelen TF i EMT Snail1 ble også økt i alle kuler, men en annen to TF involvert i EMT, Snail2 og Twist, viste et uttrykk mønster avhengig av CD44 /CD24 status.
SDC er mer stillestående enn foreldre monolag-avledet kolleger
For cellesyklus analyse av FACS, cellelinjene UT-SCC24A, UT-SCC9, UD-SCC1, UT-SCC22, og UM-SCC11B dyrket i celleklump eller enlagskultur var farget for Ki-67-FITC og DNA kontra av propidiumjodid. Celler bosatt i G1 /G0 topp som var negative for Ki-67 farging ble ansett for å være den hvilende fraksjonen (G0 fase). I alle cellelinjer, viser andelen av celler i G0 fase en meget betydelig økning i SDC, noe som indikerer at SDC inneholder en høyere andel av hvilende celler enn parenmonolags-avledede celler (figur 6).
(A ) Dobbelt farging med Ki-67 og propidiumjodid for måling av spredning og cellulært DNA-innhold. Enkeltceller ble separert på FL2-W og FL2-A. DNA-innhold og Ki-67-ekspresjon ble evaluert ved flow cytometri-analyse. (B) Frekvenser av hvilende celler i SDC som sammenlignet med monolags-avledede celler. I alle tilfeller, de celler avledet fra sfæroidene inneholde en svært signifikant større andel av hvilende (G0) celler. (** P 0,01).
En undergruppe av celler i kulene har kjøpt funksjonene myofibroblasts og kan ha gjennomgått EMT
myofibroblasts er komponenter av svulsten stroma og kan ha en rolle i konstruksjon av CSC-nisje, noe som kan bidra til å bevare den stemness av CSC. Likevel, opprinnelsen til disse cellene er fortsatt ukjent. Myofibroblasts produsere flere faktorer, som kan stimulere proliferasjon av cancerceller og letter infiltrasjon av vev. I litteraturen har de ikke-adherente sfæroider generert fra kreftcellelinjer er vist å inneholde antatte CSC. Disse kuler kan bli opprettholdt i kultur i lange perioder, noe som innebærer at kulene kan tilveiebringe en nisje er egnet for opprettholdelse og vekst av CSC. Derfor spurte vi om i) myofibroblasts finnes i nisje skapt av kuler, ii) er disse myofibroblasts avledet fra epiteliale kreftceller gjennom EMT, og iii) er det indikasjoner på at denne prosessen er reversibel?
For å løse dette uansett, undersøkte vi uttrykket av myofibroblast markører vimentin og α-SMA i SDC av tre cellelinjer som har forskjellige ALDH1 uttrykk nivåer i enlagskultur (lav: UD-SCC1: 9,4 ± 5,3%, medium: UT-SCC22: 16,9 ± 4,1 %, høy: UT-SCC24A: 25,8 ± 3,0%). Vi har funnet at de forskjellige cellelinjer og SDC generert fra disse cellelinjene varierte i den andel av celler som uttrykker vimentin og α-SMA (tabell 3). UD-SCC1 viste ingen α-SMA-uttrykkende celler og svak (12,5 ± 2,5%) vimentin ekspresjon av cellene i monolagskultur. I motsetning til dette, UT-SCC24A (figur 7) og UT-SCC22 monolags-avledede celler som hadde en forholdsvis høy frekvens av vimentin og α-SMA-uttrykkende celler som indikerer at disse cellelinjene har både epiteliale og mesenkymale egenskaper. Interessant nok har disse to cellelinjene har en forholdsvis høy prosentandel av celler i monolag-kulturer som er ALDH1 positive (tabell 3). Likevel, som sfæroide kulturer, alle cellelinjer inneholdt flere α-SMA og vimentin positive celler enn de tilsvarende foreldremonolagscellelinjer.
(A) Immunofluorescensanalyse farging av monolayer (A1-3 og B1-3) og spheroid (C1-3 og D1-3) kulturer fra UT-SCC24A med antistoffer rettet mot α-SMA (grønn) og vimentin (rød). Alle av SDC (panel C og D) viser høye nivåer av mesenchymale markører a-SMA og vimentin i forhold til sine monolags motstykker. (B) E-cadherin uttrykk analyse ved FACS. Sammenlignet med sine monolags kolleger, viste kuler redusert E-cadherin uttrykk; to populasjoner av celler avledet fra UT-SSC24A kan skilles i henhold til E-cadherin uttrykk nivå, noe som indikerer at SDC har kjøpt myofibroblast karakteristikker av EMT.
EMT er også ledsaget av tap av celle-celle-kontakter til epitelceller, karakterisert ved en nedregulering av E-cadherin uttrykk. Antallet E-cadherin uttrykke celler i SDC og monolagene ble kvantifisert ved FACS (figur 7, Tabell 3). SDC viste signifikant økt andelen av E-cadherin negative til lave uttrykker celler i forhold til sine monolags-avledet kolleger, noe som indikerer tap av mobilnettet tilslutning i denne undergruppe.
Til slutt, vi også testet re-vedheft av kuler til kultur plast. Interessant, da sfæroidene er festet til kolben, og begynte å vokse ut som en monolagskultur, den α-SMA og vimentin nivå redusert, og de fleste av cellene som vokste ut fra kulene farget negativt for disse to markører (figur 8).
(A-C) Lys-mikroskopiske bilder med fasekontrast skjema UD-SCC1 kuler reattaching å dekke lysbilder under prosessen med å re-vekst til en mono fenotype. (A) 24 timer etter reattachment, noen spindel-lignende celler vokse ut fra overholdt kuler. (B) 72 timer etter reattachment, de fleste av de festede celler «formen ser ut som foreldre monolag motstykke (C). (D-E) Indirekte immunfluorescens farging av reattached kuler etter 24 timer farget med DAPI (D1, E1), α-SMA (D2; grønn), og vimentin (E2, rød). Bilder D3 og E3 viser overlegg med nukleær farging. Piler skildre outgrowing celler som går ut fra spheroid. Uttrykket av α-SMA og vimentin redusert i outgrowing celler (piler) etter reattachment og det meste av flekker var begrenset til kuler, mens de fleste av celler dyrket fra kulene var unstained.
Diskusjoner
i tumorbiologi mange anstrengelser har blitt gjort for å forklare de embryonale-lignende funksjoner i transformkreftceller. Evnen til CSC å gjenoppbygge svulst fra en enkelt celle kan forklare mange av de forskjellene som diskriminerer kreftceller fra differensierte somatiske celler som udødelighet, quiescence, invasjon fører til metastasering, og tilbakefall etter behandling. Prince og kolleger [9], viste at en mindre befolkning på CD44
+ HNSCC-celler har CSC egenskaper, som kan gi opphav til nye svulster in vivo (≈5,000 celler injisert). Mack og kolleger stilt spørsmål ved bruk av CD44 som en spesifikk CSC markør i HNSCC siden CD44 er rikelig uttrykt på de fleste tumorceller innenfor HNSCC (60% -100%) og kunne derfor ikke brukes for å skille fra normal godartet eller ondartet epitel av hodet og nakke [10]. ALDH1 ble nylig vist å være en mer egnet markør for å identifisere antatte CSC av HNSCC og andre epiteliale cancere [11], [12], [13], [14], [15]. I HNSCC viste Chen et al at 3000 ALDH1
+ HNSCC-celler fra fem pasienter i xenotransplanted mus resulterte i alle tilfeller i dannelse av synlige tumorer 6 uker etter injeksjon, mens 10
4 ALDH1
– celler mislyktes å generere svulster. [12], [39]. Vi beskriver en fremgangsmåte for formering og anrikning av ALDH1
+ cellekulturer fra HNSCC cellelinjer. Stamcelle-lignende egenskapene til disse celler ble analysert ved å sammenligne overflate antigen ekspresjon og ekspresjon av embryonal TF, så vel som funksjonelle egenskapene til foreldre monolag cellelinjer. Observasjonen at sfæroide-kulturer ikke består av en homogen cellepopulasjon utløst ytterligere subanalyses som avslørte en cellepopulasjon med uttrykk av EMT-markører. Dette kan tyde på at disse cellene har en aktivert EMT-program og demonstrerer et potensielt nært forhold mellom CSC og celler med en aktivert EMT program som kan ha kommet fra CSC.
kulene er tre-dimensjonale (sfæriske) klynger av tumor celler dyrket fra en eller flere cellekloner. I forhold til celledoblingstider målt i monolagskultur, hastighet og mønster av sfæroide vekst in vitro bedre matcher det som ble observert i tumorer in vivo [40]. Anchorage uavhengig vekst har vist seg å være en egenskap som deles av normale vev celler som viser stamcelleegenskaper [41]. Også CSC avledet fra melanom [42], brystkreft [43], og gliosarcoma [19] var i stand til å bli spredd forankring uavhengig av hverandre og viser fenotypen av ikke-adherente sfæroider.
Som eksemplifisert ved brystkreft for eksempel antatte CSC (CD44
+ /CD24
-) kan bli beriket in vitro ved å isolere mammospheres fra suspensjonskulturer [43], [44]. I vår studie fant vi hyppigheten av CD44
+ /CD24
– celler i HNSCC linjer for å være svært variabel (fra 0,5% til 97%). Dessuten kunne de ikke bli beriket av spheroid kultur. I motsetning til dette ble ALDH1 positive celler funnet å være sterkt anriket på sfæroide kulturer fra alle fem HNSCC cellelinjer. Hvis sådd ut ved en meget lav densitiy, FACS-sortert ALDH1
+ -celler dannet vesentlig flere kolonier deretter ALDH
– befolkning, noe som indikerer en høyere proliferativ kapasitet av denne undergruppe. Andre har vist at ALDH1
+ eller ALDH1
+ /CD44
+ /CD24
– celle populasjoner isolert fra HNSCC-pasienter har en høyere tumorigent potensiale deretter ALDH1
– cellene selv om de var CD44
24
– hvis xenotransplanted hos mus [12]
Kreft og normale stamceller (SC) dele proliferative egenskapene til selvfornyelse, quiescence og uttrykk av viktige transkripsjonsfaktorer (TF. ). Chickarmane et al. [45] sette opp en datamodell for å beskrive de viktigste transkripsjonsfaktorkombinasjoner i SC og definerte høye nivåer av Oct3 /4, Sox2, og Nanog. På den annen side, Ji et al. [46] i forhold rolle Oct3 /4 og Nanog i transform (t-hPSCs), og normale humane pluripotent stamceller (hPSCs). I motsetning til vanlige SC, selvfornyelse og overlevelse av t-hPSCs ble funnet å være uavhengig av Oct3 /4 uttrykk. I kontrast, genetisk knockdown av Nanog forårsaket fullstendig tap av selvfornyelse samtidig med apoptose i t-hPSCs. I vår studie, uttrykk for Oct3 /4, Sox2, og Nanog var oppregulert i SDC i fem HNSCC avledet cellelinjer. Dette innebærer at SDC kan ha stamcelleegenskaper.
Studier som omhandler genuttrykk profilering ved hjelp av in vivo invasive celler eller celler som gjennomgår EMT in vitro, viste en bryter fra en proliferativ til en invasiv fenotype. I overensstemmelse til denne observasjonen har da celleproliferasjonen Ki-67 blitt vist å merke bare en liten minoritet av celler på invasiv foran i forhold til de mer differensierte sentrale delen av tumoren, noe som tyder på at ikke-prolifererende tumorceller som har unnsluppet tumormassen kan ha metastatisk potensiale [47]. I vår studie fant vi at SDC hadde en høyere andel av Ki-67 negative celler sammenlignet med tilsvarende monolagskulturer. Dette indikerer at SDC er mer enn hvilende celler avledet fra monolaget. Vi fant også at SDC har økt invasjon kapasitet, noe som innebærer at disse cellene kan ha en høyere evne til å metastasere.
myofibroblasts er en slags mesenchymale celle spille en nøkkelrolle i tumorinvasjon og metastase og terapeutisk respons. De kan produsere flere faktorer som kan stimulere spredning av kreftceller og letter deres infiltrasjon [31]. Imidlertid er opphavet til disse myofibroblasts ikke klart. EMT er blitt rapportert å spille en viktig rolle for å starte CSC [29]. I denne studien demonstrerte vi at myofibroblast ende celler er en subpopulasjon av SDC. Disse kulene stammer utelukkende fra klonede tumorceller. Det kan derfor konkluderes med at de myofibroblasts bare kunne komme ut av epiteliale kreftceller ved å endre den epiteliale til en mesenchymal fenotype gjennom EMT. Enda viktigere, som vi har funnet, at over 90% av SDC farget positivt for α-SMA og vimentin, mens prosentandelen av ALDH1
+ celler varierte fra 37% til 46,4%. En betydelig reduksjon av E-cadherin ekspresjon kan bli demonstrert i SDC, noe som indikerer en reduksjon av celle-celle-kontakt på sfæroide kulturer. Disse markør uttrykk var reversible i oppdrett, der kulene kan følge og cellene vokste radielt ut for å danne en monolayer.
