Abstract
Cancer stamceller er kreftceller preget av stamcelleegenskaper og representerer en liten bestand av kreftceller som driver tumor utvikling, progresjon, metastaser og resistens. Til dags dato er de molekylære mekanismer som genererer og regulerer kreft stamceller ikke godt definert. BORIS (bror av Regulator av trykt nettsteder) eller CTCFL (CTCF-lignende) er et DNA-bindende protein som er uttrykt i normalt vev bare i kjønnsceller og er re-aktivert i tumorer. Nye bevis har fremhevet sammenhengen av
BORIS /CTCFL
uttrykk med dårlig total overlevelse av ulike kreftpasienter. Vi har tidligere vist en sammenslutning av BORIS-uttrykke celler med stemness genuttrykk i embryonale kreftceller. Her studerte vi rolle BORIS i epiteliale kreftceller. Bruke BORIS-molekylær fyrtårn som allerede var godkjent, var vi i stand til å vise tilstedeværelse av
BORIS
mRNA i kreftstamcelle-beriket populasjoner (side befolkning og kuler) av cervical, tykktarm og bryst kreftceller. BORIS støydempere studier viste en nedgang på sfære formasjon kapasitet i bryst og tykktarm kreftceller. Viktigere, BORIS-lyddemping førte til nedregulering av
hTERT
, stamcelle (
Nanog
,
OCT4
,
SOX2 Hotell og
BMI1
) og kreft stamcellemarkører (
ABCG2
,
CD44 Hotell og
ALDH1
) gener. Omvendt, BORIS-induksjon førte til oppregulering av de samme genene. Disse fenotyper ble observert i cervical, tykktarm og invasive brystkreftceller. Men en helt annen oppførsel ble observert i de ikke-invasive brysttumorceller (MCF7). Faktisk disse cellene kjøpt en epitelial mesenchymale overgang fenotype etter BORIS lyddemping. Våre resultater viser at BORIS er assosiert med kreft stamcelle-anrikede populasjoner av flere epitelial tumorceller og de forskjellige fenotyper avhenger av opprinnelsen av tumorceller
relasjon:. Alberti L, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2015) ulike effekter av BORIS /CTCFL på Stemness Gene Expression, Sphere Dannelse og Cell Survival i epithelial kreftstamceller. PLoS ONE 10 (7): e0132977. doi: 10,1371 /journal.pone.0132977
Redaktør: Gabriele Saretzki, University of Newcastle, STORBRITANNIA
mottatt: 02.04.2015; Godkjent: 19 juni 2015; Publisert: 17.07.2015
Copyright: © 2015 Alberti et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av den sveitsiske National Science Foundation (31003A-113505) og Emma Muschamp Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. En av forfatterne (JB) er ansatt i en molekylær patologi laboratorium (Biopath Lab). Biopath Lab gitt støtte i form av lønn, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. En av forfatterne (JB) er ansatt i en molekylær patologi laboratorium (Biopath Lab). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Enorme bevis støtte synet om at menneskelig kreft kan anses som en stamcellesykdom [1- 3]. Den kreft stamceller (cscs) teori går ut på at kreften er sett på som komplekse vev hvor avvikende cellevekst blir drevet av en liten populasjon av celler er definert som tumor-initiering celler. Disse cellene er karakterisert av tre hovedegenskaper: ukontrollert proliferasjon kapasitet, evne til selvfornyelse og evne til å differensiere til en ikke-CSC avkom [3, 4]. Interessant, egenskapene til disse maligne celler er nært ligner de tre egenskaper som karakteriserer normale stamceller: potensiale til å formere seg i stor utstrekning, til selvfornyelse og evnen til å utvikle seg til flere linjene. Følgelig er tumorceller med disse egenskaper vil også kalt kreft stamceller. De første observasjoner av tilstedeværelsen av cscs ble utført i human akutt myeloid leukemi [5] og følgelig utviklet i forskjellige typer av humane solide svulster, som brystkreft [6], hjerne [7], tykktarm [8, 9], bukspyttkjertel [10 ] og eggstokkene [11] svulster. Det har vist seg at mange kreftpasienter, spesielt med solide tumorer, reagerer dårlig på konvensjonelle behandlinger, for eksempel cellegift og strålebehandling, og etter en innledende delvis remisjon, svulster tilbakefall. Årsakene til en slik svikt kan forklares med narkotika og radio- motstand av cscs. I tillegg har det blitt demonstrert at cscs er hyppigere i svært aggressive og ildfaste svulster [6-7]. Derfor blir det svært viktig å identifisere de CSC populasjoner og deres markører for å utvikle CSC-målrettet terapi for å overvinne motstanden cscs til de konvensjonelle anti-kreft narkotika. Ved hjelp av eksperimentelle tilnærminger, har cscs til mange tumortyper blitt karakterisert fenotypisk og flere CSC markører er blitt identifisert [4, 12]. Imidlertid har de fleste av de identifiserte markører er ikke fullt ut bestemt til cscs fordi de er også uttrykt i normale celler, og derfor er bruken av multiple markører som kreves. Mange forsøk på kreftforskning vil være nødvendig for å optimalisere målretting cscs terapi. Det er flere måter å berike cscs populasjoner, som hovedsakelig brukes for
in vitro
analyser og screening metoder. En tilnærming er basert på valg av en celle subpopulasjon som er i stand til å effluks fargestoffer. Utstrømningen av disse fargestoffer er en kapasitet på cscs som uttrykker gener som koder for ATP-bindende kassett (ABC) narkotika transportører som ABCG2 [13-15]. Den mest brukte fargestoffet er Hoechst 33342, som er et DNA-bindende fargestoff. En undergruppe er valgt ved denne metode er kalt side populasjon (SP). Den aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet er en annen funksjonell egenskap av stamceller, som brukes for å isolere anriket cscs befolkning [16, 17]. En ekstra
in vitro
tilnærmingen er basert på ikke-klebende serumfritt kultur [8, 18]. Ved hjelp av denne metoden, kan cellene fra forskjellige typer av tumorer (inkludert hjerne, bryst og kolon), som har kapasiteten til selvfornyelse og for å opprettholde stamcelle-egenskaper, for dannelse av sfæroide kolonier nevnt sfærer [19].
BORIS (bror av Regulator av trykt nettsteder) er et DNA-bindende protein som deler med sin paralog CTCF, en 11-sink finger domene, og dermed også kalt CTCFL (CTCF-aktig) [20]. BORIS protein er involvert i epigenetisk omprogrammering og det hører til kreft testis antigen familie, slik det er uttrykt i normale germinalceller og reaktivert i tumorer. Nylige rapporter indikerer at BORIS ekspresjon er assosiert med avansert stadium i forskjellige kreftformer, slik som ovarie, prostata, spiserøret og hepatocellulær kreft [21-24]. I eggstokkreft, kan BORIS uttrykk også gi dårlig prognose [21]. Vår tidligere studie har vist foreningen av BORIS uttrykk med stamcelle og CSC markørgener i embryonale carcinoma celler [25]. Til sammen disse bevisene bedt oss om å ytterligere undersøke tilstedeværelse og de molekylære funksjonene BORIS i cscs-beriket populasjoner i andre typer kreftceller og spesielt i livmorhalsen, tykktarm og bryst kreftceller. Ettersom det er ennå ikke en validert antistoff mot BORIS, brukte vi BORIS-molekylær fyrtårn (BORIS-MB) som tidligere ble testet og validert for
in vivo
påvisning av
BORIS
mRNA [25 ]. BORIS-MB tillatt oss å visualisere de BORIS-positive celler i de analyserte epiteliale kreftceller. Interessant, fant vi at
BORIS
er sterkt uttrykt i CSC-beriket populasjoner isolert fra SP og kuler. Videre funksjonelle studier viste at BORIS kunne spille en viktig rolle i den selvfornyelse av svulster og i oppkjøpet av epiteliale mesenchymale overgang (EMT) signatur i bunnen av opprinnelsen til kreftceller.
Materialer og Metoder
Cells og kuler forberedelse
de humane cellelinjer (HeLa, cervical adenokarsinom, HT29, colon adenokarsinom, NCCIT, embryonale karsinom) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og menneske brystcellelinjer (MCF7- og MDA-MB-231) ble levert av Dr Stéphanie Renaud (Bioteknologi Institute, University of Lausanne). Cellene ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 enten i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Gibco, Invitrogen) for HeLa og HT29-celler, eller i RPMI-1640 medium (Gibco, Invitrogen) for NCCIT, MCF7 og MDA-MB-231-celler, supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum. (FBS; Invitrogen) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen)
for sfære kultur-celler (HT29, MCF7 og MDA-MB-231) ble først frittliggende med 0,25% trypsin-oppløsning (Invitrogen) og vasket to ganger i PBS (Invitrogen). Deretter ble cellene filtrert to ganger ved bruk av en celle-sil på 40 um maskestørrelse (Falcon) og dyrket i serumfritt medium inneholdende DMEM /F-12 medium (Invitrogen) supplert med B27 (Invitrogen), 5 ug /ml heparin (Sigma ), 20 ng /ml EGF (epidermal vekstfaktor, BD Biosciences), 20 ng /ml FGF (fibroblast Growth Factor, BD Biosciences) og 5 ug /ml insulin (Sigma). Celler ble platet inn i ultra-low feste 6-brønners plater (Corning) med en tetthet på 1000 celler /ml i 10-15 dager. Spheres ble talt opp og samlet for RNA ekstraksjon. En alikvot av kulene ble sådd i vanlig medium med serum for å tillate differensiering.
Fluorescens analyse ved hjelp av BORIS-MB
Celler ble fremstilt som tidligere beskrevet [25]. I korthet ble cellene i suspensjonen (1 x 10
6 celler /ml) ble inkubert ved 37 ° C i 1,5 time i serumfritt DMEM-medium med Cy3-BORIS MB (200 nM) og Hoechst 33342 (5 ug /ml) i nærvær av en Lipofectamine RNAiMAX siRNA transfeksjon reagens (Invitrogen). Cellene ble vasket, resuspendert i PBS-5 mM EDTA og cytocentrifugated på glass lysbilde ved hjelp av en cytospin sentrifuge og deretter undersøkt under et fluorescerende (Axioplan2 Imaging, Zeiss) eller et konfokal (LSM 710 Quasar, Zeiss) mikroskop.
For ABCG2 fluorescens farging ble cellene fremstilt som beskrevet utover. Etter cytospin ble cellene fiksert med iskald aceton i 8 minutter og farget ved 4 ° C over natten med kanin anti-humant ABCG2 antistoff (Sigma) ble brukt ved 1:20 fortynning i PBS. Platene ble vasket med PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med esel anti-kanin-sekundært antistoff merket med Alexa Fluor 488 (Sigma) ble brukt ved 1: 500 fortynning i PBS. Platene ble deretter undersøkt med fluoriserende mikroskop.
FACS-analyse og sortering av SP
HeLa-celler (1 x 10
6 celler /ml) ble inkubert i serumfritt medium ved 37 ° C i 1,5 time med Hoechst 33342 (Invitrogen) ved en endelig konsentrasjon på 12,5 ug /ml, enten alene eller i kombinasjon med 50 uM verapamil (Sigma) som en kontroll. Cellesuspensjoner ble blandet med jevne mellomrom i løpet av inkuberingen. Etter inkubering ble cellene vasket med PBS og resuspendert i PBS-5 mM EDTA. Før analyse ble cellene inkubert med propidiumjodid (2 ug /ml) og filtrert ved anvendelse av en celle-sil på 40 um maskestørrelse (Falcon). SP analysene ble utført ved hjelp LSRII (Becton Dickinson) og sortering av SP og NSP (non-SP) ved hjelp av FACS Aria (Becton Dickinson) ved anlegget av EPFL (Ecole Polytechnique Fédérale av Lausanne). Hoechst 33342 fargestoff var spent på 355 nm og dens fluorescens ble analysert ved hjelp av dual-bølgelengde på utslipp, 445 nm for Hoechst blå og 650 nm for Hoechst rødt.
Ektopisk BORIS uttrykk
Hela-celler transfektert med pCMV-BORIS plasmid hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen) som tidligere beskrevet [25].
BORIS knockdown av induserbar shRNA lentiviral systemet
Staller cellelinjer med induserbare uttrykker shRNAs målretting menneskelig
BORIS
mRNA ble fremstilt som tidligere beskrevet [25]. HeLa, HT29, MCF7 og MDA-MB-231 tumorcellelinjer ble brukt i disse forsøkene.
BORIS cDNA uttrykk av induserbar lentiviral systemet
stabile cellelinjer med induserbar uttrykker menneskelig
BORIS
cDNA ble generert ved hjelp av doksycyklin-induserbar lentiviral systemet [26]. BORIS cDNA fra pCMV-BORIS plasmidet ble klonet inn i pINDUCER20 ved Gateway Cloning System (Invitrogen). Den lentiviral vektor pINDUCER20 inneholder antibiotika seleksjonsmarkør G418 (Geneticin), som gjør det mulig å velge bare de omsatte cellene. Denne vektoren inneholder også en kassett med en doksycyklin-induserbar promoter som kontrollerer transkripsjonen av klonede cDNA. For generering av lentivirus, vi fulgt vår prosedyre som tidligere beskrevet [25]. Den virale suspensjon kombinert med 8 ug /ml polybrene (Sigma) ble brukt til å infisere målceller (HeLa, HT29, MCF7 og MDA-MB-231). Tjuefire timer etter infeksjon ble mediet erstattet med medium supplementert med 500 ug /ml G418 (Roche). Etter 2 uker med antibiotika utvalg, ble 2 mikrogram /ml doksycyklin (Sigma) tilsatt til mediet for å tillate induksjon av
BORIS
cDNA uttrykk og doksycyklin holdig medium ble oppdatert hver 3. dag.
Kvantitativ RT-PCR-analyse
QRT-PCR-analyser ble utført som tidligere beskrevet [25]. Den ΔΔCt metode ble anvendt for å bestemme de relative ekspresjonsnivåer, som var normalisert til
GAPDH
nivå. Som allerede rapportert [25], for alle de forsterkede målgener PCR effektivitet utvidet 94-101%, med korrelasjonskoeffisient (r2) i området 0,96 til 1,0. De Ct verdier av GAPDH målt tilsvarende nivåer (Ct = 10,07 ± 0,25) for alle de analyserte celler.
sekvenser av primer som brukes i tillegg er vist i S1 tabell.
CD44 + /CD24 – analyse av flowcytometri
CD44 + /CD24- uttrykk ble analysert i cellene konstruert for å stabilt vise knockdown
BORIS
mRNA eller uttrykke
BORIS
cDNA. Cellene ble trypsinert og 10
6-celler ble resuspendert i 100 ul PBS-1% FBS. Monoklonale mus anti-human CD44-APC-H7-antistoff (BD Pharmingen) og et monoklonalt muse anti-human CD24-Alexa Fluor 647 antistoff (BD Pharmingen) ble tilsatt ved fortynninger på 1:20 og 1: 5 respektivt, som foreslått av produsent, og inkubert i 40 min ved 4 ° C. DAPI ble tilsatt i en konsentrasjon på 1 ug /ml i løpet av de siste 10 min med inkubasjon. Etter vasking med PBS-1% FBS, strømningscytometri-analyse ble utført ved å bruke Gallios strømningscytometer (Coulter Beckman). I det minste 5 x 10
4 arrangementene ble tellet for alle prøver. Analyse av prosentandelen av CD44 + /CD24–celler ble beregnet etter eksklusiv døde celler (DAPI positive celler) og gating på EGFP og TRFP-positive celler. Resultatene ble analysert ved hjelp av FlowJo programvare. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Colony forming analyse
Celler ble trypsinert og resuspendert i medium. Tre hundre celler ble sådd i 6 brønn /plater in triplo. Celler ble dyrket i friskt doksycyklin-inneholdende medium. Etter 2 uker ble cellene fiksert med 1 ml av 4% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og farget med 1 ml 0,1% krystallfiolett i 10 min. Etter vasking med PBS, ble hver brønn fotografert og koloniene (bestemt som 50 celler /koloni). Ble telt ved bruk av ImageJ program
Migration assay
Cellemigrering ble bestemt ved anvendelse av celledyrkningsinnsatser (BD Falcon) med 8 um porestørrelse. I korthet ble cellene høstet og resuspendert i serumfritt medium, 5 x 10
4-celler ble platet inn i toppen av innsatser plassert i 24-brønners plater. På bunnen brønn av innskuddene ble det tilsatt 500 ul medium supplert med 10% FBS. Etter 48 timers inkubasjon ble ikke-migrerende celler som fjernes med en bomullsdott, og de migrerende celler (på den nedre overflate av innsatsen) ble fiksert med 1 ml av 4% formaldehyd og deretter farget med 1 ml av 0,1% krystallfiolett i 10 min. Etter vasket 3 ganger med PBS, ble de trekkende cellene telles under ti tilfeldige høyeffekts mikroskopiske felt per innsats og gjennomsnittlig antall trekkende celler ble beregnet for hver gruppe av celler.
celleproliferasjon og chemo-følsomhet analyser
Celleproliferering analyse etter BORIS taushet BORIS induksjon ble vurdert ved MTT-analyse som beskrevet tidligere [25].
In vitro
vekst effekt av 5-fluorouracil (5- FU) ble bestemt ved MTT-analyse. I korthet ble hver gruppe av celler, etter BORIS stanse, ble sådd ut i triplikat med en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i 96-brønners plater i doksycyklin-inneholdende medium. Dagen etter ble 5-FU (Sigma) tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner: 0,5, 5, 50 og 500 ug /ml. Celler ble inkubert i 2 dager, og deretter cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Veksthemming eller overlevende fraksjon ble uttrykt som en prosent av de ubehandlede kontroller som ble målt på en gang, under anvendelse av ligningen: (absorbans av behandlede prøve /absorbans av ubehandlet prøve) x 100.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av to-tailed student t-test analyse. P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
BORIS
mRNA uttrykkes i sidebefolknings celler
For å undersøke tilstedeværelsen av
BORIS
mRNA i CSC-beriket populasjoner av epiteliale kreftceller, brukte vi som modeller menneske HeLa (cervical), HT29 (colon), MCF7- (non-invasiv bryst) og MDA-MB-231 (invasiv brystkreft) tumorcellelinjer. Expression analyse viste et lavere nivå av
BORIS
mRNA i HeLa og HT29 forhold til embryonale tumorceller (NCCIT), mens i MCF7- og MDA-MBA-231 celler
BORIS
mRNA var nesten umulig å oppdage ( fig 1A). Derfor kan HeLa, HT29, MCF7 og MDA-MBA-231 tumorceller bli klassifisert som BORIS-lav uttrykkende tumorceller.
(A)
BORIS
ekspresjon i humane tumorcellelinjer. Total RNA fra NCCIT (embryo), HeLa (cervical), HT29 (colon), MCF7- (non-invasiv bryst) og MDA-MB-231 (invasiv brystkreft) tumorceller ble hentet ut og
BORIS
uttrykk ble analysert ved QRT-PCR. Resultatene ble normalisert til
GAPDH
og relatert til NCCIT celler. Feilstolpene representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). (B)
BORIS
uttrykk som oppdages ved hjelp BORIS-MB. Representative bilder av HeLa, HT29, MCF7- og MB-MDA 231 celler, 40X forstørrelse. Celler ble inkubert med Cy3-BORIS MB (200 nM) og Hoechst 33342 (5 ug /ml) ved 37 ° C i 1,5 time i serumfritt medium og deretter undersøkt under fluoriserende mikroskopi. Hvite piler indikerer Hoechst negative celler som også er
BORIS
mRNA positiv som oppdages ved BORIS-MB.
Hoechst side befolkningen (SP) analyse er en velprøvd teknikk for å berike stilk og tidlig stamceller i ulike cellelinjer [13-15]. Fluorescens bildebehandling analyse ble utført ved hjelp av Hoechst 33342 i kombinasjon med
BORIS
mRNA deteksjon ved hjelp BORIS-Molecular Beacon (BORIS-MB), som tidligere beskrevet [25]. Fluorescensavbildning analyser viste at BORIS positive celler er bare et delsett av celler i alle analyserte epiteliale tumor-cellelinjer (figur 1B), i samsvar med resultatene oppnådd i embryonale tumorceller [25]. Den vurderte frekvensen av BORIS-positive celler er omtrent 0,1% i HeLa, 0,5% i HT29 og mindre enn 0,05% i MCF7 og MDA-MBA-231 celler; i motsetning var det ca 5% i NCCIT [25]. Interessant, fluorescens bildedannende analyser viste at de fleste av BORIS-positive celler ble også Hoechst negativ (hvite piler i figur 1B og S1 Fig). Derfor
BORIS
ekspresjon kan være assosiert med Hoechst negativ fenotype av SP-celler i cervikale, tykktarm og brysttumorceller. Imidlertid kan en liten prosentandel (mindre enn 10%) av BORIS-positive celler ble Hoechst positive.
ABCG2 er beskrevet som den viktigste efflukspumpen ansvarlig for Hoechst negativ fenotype i SP-celler [27]. Derfor, en mulig co-uttrykk for
BORIS
med chemoresistance transportproteinet ABCG2, ble først undersøkt. HeLa-celler ble anvendt i dette eksperimentet. Som det kan ses i figur 2A, BORIS positive celler er både negative for Hoechst (hvite piler) og positiv for ABCG2 protein. For å bekrefte tilstedeværelse av
BORIS
mRNA i CSC-beriket populasjon av HeLa-celler, SP celler og også ikke-SP (NSP) celler ble sortert etter FACS. Prosentandelen av SP-celler var fra 0,5% til 1,5% av det totale antall celler (figur 2B), i samsvar med tidligere rapporter [15, 27]. SP fraksjonen ble helt redusert ved å legge verapamil, en hemmer av ABC-transportører, noe som indikerer at befolkningen var bona fide SP celler. Den QRT-PCR-analyse viste at
BORIS
mRNA nivå av SP celler var signifikant høyere (12 ganger, s 0,05) sammenlignet med NSP og foreldre HeLa celler (figur 2C). Også
ABCG2
mRNA nivået var høyere (ca. 1,5 ganger) i SP sortert celler i forhold til NSP og foreldre celler (figur 2D). For ytterligere å bekrefte nærværet av
BORIS
i SP-CSC-anriket populasjon, ble frekvensen av SP analysert i pCMVBORIS-transfekterte HeLa-celler (figur 2E). Som forventet, ble overekspresjon BORIS cellene betydelig mer anriket i SP-celler (to ganger, p = 0,01) sammenlignet med HeLa-parentale celler. Alle disse resultatene indikerer at isolering av BORIS-positive celler kan føre til en anrikning av CSC befolkningen i HeLa-tumorceller.
(A) Immunofluorescensanalyse av ABCG2 i HeLa-celler. Cellene ble inkubert med BORIS-MB og Hoechst 33342 ved 37 ° C i 1,5 timer i serumfritt medium. Etter cytocentrifugation objektglassene ble fiksert med kald aceton og deretter inkubert med kanin-polyklonalt antistoff ABCG2. Den BORIS positive /ABCG2 positive /Hoechst negative celler er merket med hvite piler. 10X forstørrelse. (B) Representant prikkplott av flowcytometri analyse av SP. HeLa-cellene ble inkubert med Hoechst 33342 (12,5 mg /ml) enten alene eller i kombinasjon med verapamil (50 uM). Analysen ble utført ved hjelp LSRII og sortering ved hjelp FACS Aria. Portene indikerer sortert SP og NSP celler. (C)
BORIS
mRNA og (D)
ABCG2
mRNA uttrykk i SP og NSP isolert fra HeLa-celler. Total RNA ble ekstrahert og analysert ved QRT-PCR. Grafer indikerer mRNA nivåer av
BORIS Hotell og
ABCG2
gener normalisert til
GAPDH Hotell og relaterte til foreldre HeLa-celler. Data er representert som gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne indikerer p 0,05. (E) SP analyse i BORIS overuttrykt celler. HeLa-celler ble transient transfektert med en ekspresjonsvektor BORIS (HeLa pCMVBORIS). Etter 2 dager, 1 x 10
6-celler ble inkubert med Hoechst 33342 (12,5 mg /ml) enten alene (øverst) eller i kombinasjon (bunn) med 50 uM verapamil. Analysen ble utført ved hjelp LSRII flowcytometri og en representant eksperiment av 3 uavhengige forsøk er vist.
Colon-kuler og MAMMO sfærer uttrykke høye nivåer av
BORIS
mRNA
vekst av celler i suspensjon, med et serumfritt medium (sfære kultur), er en felles tilnærming til CSC-berikelse [7-8]. Ettersom dette hotellet ble rapportert å være begrenset til stilk /stamceller [19],
BORIS
uttrykk ble også undersøkt i forming-kuler av tykktarmen (HT29) og bryst (MCF7-) tumorceller. En alikvot av sfærer ble sådd i serumholdig medium for å tillate differensiering. Interessant,
BORIS
uttrykk analyse viste et signifikant høyere nivå av
BORIS
mRNA i tykktarm-kuler (37,2 ± 7,3 fold, n = 4), samt i MAMMO kuler (30.9 ± 6.4 fold, n = 4) sammenlignet med foreldreceller og differensierte-kuler (Fig 3). Disse resultatene antydet at
BORIS
er uttrykt i CSC-anrikede sfærer av tykktarm og brysttumorceller.
Celler ble sådd ut ved lav tetthet (1000 celler /ml) i sfære kulturmedium i lave festeplater. Etter 10-15 dager sfærer ble samlet for RNA-ekstraksjon og en alikvot av kulene ble sådd i vanlig medium med serum for å tillate differensiering (differensierte-kuler).
BORIS
uttrykk ble analysert ved QRT PCR i (A) kolon-kuler (HT29 kuler) og differensierte-kuler (HT29 DIFF kuler) og (B) MAMMO-kuler (MCF7 kuler) og differensierte-kuler ( MCF7 DIFF kuler). Data ble normalisert til
GAPDH
og relatert til foreldreceller (celler). En representant eksperiment av 4 uavhengige eksperimenter er vist. Stjernene indikerer statistisk signifikant forskjell (p 0,05) mellom kuler og parentale celler. (C) Representative bilder av kolon-kuler og MAMMO sfærer vises, 4X forstørrelse. Svart skala barer indikerer 250 mikrometer.
genekspresjon og CSC fenotype i BORIS knockdown celler
For å utforske en mulig rolle BORIS i cscs, vi valgte en knockdown strategi ved hjelp lentiviral system med induserbar uttrykker shRNAs rettet mot menneskelig
BORIS
mRNA. Den BORIS sh-3, BORIS sh-4 og egge-shRNA (CTR sh) lentiviruses tidligere generert og validert [25]. Disse lentiviruses ble brukt til å infisere HeLa, HT29, MCF7 og MBA-MD-231 tumorceller.
Det er blitt demonstrert at BORIS aktiverer
hTERT
uttrykk [28] og påvirker ekspresjonen av stemness gener i embryonale kreftceller [25]. I denne undersøkelsen ble disse korrelasjoner undersøkt i epitel-tumorceller. Etter 2 uker med BORIS knockdown, analyser uttrykk for
hTERT
,
CTCF
, de vanligste CSC markører (
ABCG2
,
CD44
,
ALDH1
) og stamcelle (
Nanog
,
OCT4
,
SOX2
,
BMI1
) gener ble utført. Figur 4a viser, for alle analyserte genene, gjennomsnittet av folden endring av BORIS sh-3 og BORIS sh-4-celler sammenlignet med CTR sh celler av hver konstruert tumorcellelinje.
hTERT
ekspresjon ble betydelig nedregulert i alle analyserte tumorceller ved unntak av MCF7, hvori en betydelig oppregulering (13 ganger) ble observert.
CTCF
ekspresjon ble redusert i alle celler, selv om reduksjonen var ikke signifikant (fra 40% til 20% i forhold til kontroll). Spesielt, fravær av BORIS trigget en minskning av
ABCG2
uttrykket (93% for MCF7, 25% for MDA-MB-231, 80% for HT29 og 60% for HeLa).
CD44
ble nedregulert i alle bortsett fra én cellelinje MCF7, hvori en 2,5 gangers økning ble observert.
ALDH1
,
Nanog
,
OCT4
,
SOX2 Hotell og
BMI1
ble generelt nedregulert i alle kreftceller etter BORIS lyddemping. Alle sammen, disse resultatene antydet at BORIS kan påvirke reguleringen av
hTERT Twitter /telomerase, stamcelle og CSC markørgener i epiteliale kreftceller.
(A) MCF7-, MDA-MB- 231, HT29 og HeLa celler ble konstruert for å stabilt vise slått ned
BORIS
mRNA. BORIS sh-3, sh-4 og CTR sh (kontroll shRNA inneholder egge sekvens) lentiviruses ble brukt til å infisere disse cellene. Hver transduced celler ble dyrket med doksycyklin å indusere BORIS shRNA uttrykk. Medium som inneholder doksycyklin ble erstattet hver 3. dag. Etter 2 uker, ble RNA isolert fra BORIS sh-3, sh-4 og CTR sh av hvert omformet cellelinje. mRNA-nivåene av de angitte gener ble analysert ved QRT-PCR. Grafene representerer for hvert gen hjelp av gangers induksjon av både BORIS shRNA (BORIS sh-3 og sh-4) relatert til den for kontroll av eventuelle celler. Standardfeil ble beregnet vurderer feilspredning av både BORIS shRNA analyser. Grafene viser en representant eksperiment. (B) Representant flowcytometri dot plots av CD44 og CD24 uttrykk i MCF7-, MDA-MB-231, HT29 og HeLa celler konstruert for å stabilt vise slått ned
BORIS
mRNA. CD44 og CD24 uttrykk mønstre av de to BORIS shRNA (BORIS sh-3 og sh-4) og kontrollen (CTR sh) er vist. Anti-CD24-antistoff merket med AlexaFluor 647 og anti-CD44-antistoff merket med APC-H7 ble anvendt. Prosentandelen av CD44 + /CD24- populasjonen ble estimert etter gating på EGFP og TRFP positive celler (transdusert og DOX-indusert shRNA, henholdsvis) og de endelige porter er basert på den isotypekontroll tilsvarer hver cellelinje. Alle forsøk ble utført tre ganger, uavhengig av hverandre, og en representant eksperiment er vist for hver gruppe av celler.
CD44 + /CD24- undergruppe er blitt funnet å være beriket med tumor initiere funksjonene, spesielt i brystcancerceller [6, 29]. I denne studien ble CSC undergruppe analysert ved flowcytometri i BORIS-knockdown tumorceller. En annen oppførsel av MCF7 i forhold til de andre celler ble observert (figur 4B). Analysene viste en bemerkelsesverdig oppkjøp av CD44 + /CD24- fenotype i BORIS-knockdown MCF7–avledet celler, fra ingen CD44 + /CD24- celler i kontrollen til ca 70% i de BORIS-knockdown celler. En ikke-signifikant reduksjon av CD44 + /CD24- undergruppe ble observert i BORIS-shRNA MDA-MB-231-avledede celler. I den ikke-brysttumorceller, HT29 og HeLa, ble ingen endring av uttrykk observert med både celler som viser en typisk CD44 + /CD24- epitelial fenotype.
knockdown av BORIS påvirker celleproliferasjon i MCF7 bryst celler
Cell overlevelse ble vurdert ved BORIS knockdown. Celleproliferasjon og evnen til å danne kolonier ble målt hver uke i en måned. Den kolonidannelse (eller klonogene) analyse overvåker evnen til en kreftceller for å frembringe en levedyktig koloni etter behandlingen [30] og ble anvendt for å analysere
in vitro
kapasitet av tumorceller til å danne kolonier etter BORIS knockdown. Resultatene viste ingen signifikant forskjell på celleformering i alle bortsett fra en tumorcellelinje. Unntaks opptatt MCF7-celler hvori en signifikant økning (3-4 ganger, s 0,0001) på celleproliferasjon sammenlignet med kontroll-celler ble observert (figur 5A). Kolonidannelse analyser bekreftet celleproliferasjonsprosesser resultater (figur 5B). Etter en måned med BORIS-knockdown, antall kolonier var ikke signifikant forskjellige for HeLa, HT29 og MDA-MB-231, sammenlignet med kontroller. I motsetning til dette antall kolonier var signifikant høyere i MCF7. Disse resultatene indikerer at ved unntak av MCF7 brystkreftceller, BORIS tie i epiteliale kreftceller ikke har en betydelig innvirkning på celleoverlevelse.
(A) Cell spredning, over en måned av DOX-indusert BORIS – og CTR- shRNA celler, ble analysert hver uke ved MTT-analyse. Resultater fra to spesifikke BORIS-shRNA (BORIS sh-3 og sh-4) er angitt i prosent i forhold til cellen spredning av kontrollceller (kryptert shRNA, CTR sh). Feilstolpene representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3). Stjernene viser statistisk signifikant forskjell (p 0,05) mellom BORIS sh og CTR sh. (B) Representative bilder av kolonidannelse analysen etter en måned BORIS knockdown.
