Abstract
Vi har tidligere vist at humant choriongonadotropin β (hCGβ) indusert migrasjon og invasjonen i menneskelige prostata kreft celler. Men de involverte molekylære mekanismer er uklare. Her har vi etablert en stabil prostatakreft cellelinje overekspresjon hCGβ og testet hCGβ-utløst signalveier forårsaker celle migrasjon og invasjon. ELISA viste at hCGβ mengden utskilt i mediet økt med kulturen tid etter at hCGβ-transfekterte celler ble inkubert i 3, 6, 9, 12 og 24 timer. Flere, hCGβ standarder fremmes MAPK (ERK1 /2) fosforylering og økt MMP-2 uttrykk og aktivitet både dose- og tidsavhengige oppførsel i hCGβ ikke-transfekterte celler. I tillegg hCGβ fremmet ERK1 /2 fosforylering og økt MMP-2-ekspresjon og aktivitet i betydelig grad i hCGβ transfektert DU145-celler. Mens ERK1 /2 blocker PD98059 (25 mm) signifikant nedregulert fosforylert ERK1 /2 og MMP-2. Spesielt hCGβ fremmet celle migrasjon og invasjon, men den PD98059 svekket hCGβ-indusert cellemotilitet under slike forhold. Resultatene indikerte at hCGβ indusert cellemotilitet via fremme ERK1 /2 fosforylering og MMP-2 oppregulering i menneskelige prostata kreft DU145 cellene
Citation. Li Z, Li C, Du L, Zhou Y, Wu W (2013 ) Humant choriongonadotropin β induserer migrasjon og invasjon via Aktivering ERK1 /2 og MMP-2 i human Prostate Cancer DU145 Cells. PLoS ONE 8 (2): e54592. doi: 10,1371 /journal.pone.0054592
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 11 juni 2012; Godkjent: 14 desember 2012; Publisert: 12 februar 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Science and Development Plan of Beijing Education Committee (tilskudd nummer: KM200910025008) og Natural Science Foundation National of China (stipend nummer: 81272843). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste diagnosen kreft og den sjette største dødsårsaken i menn i verden [1]. Foreløpig de viktigste metoder for behandling av prostatakreft er radikal prostatektomi, ekstern stråle strålebehandling, brachyterapi, systemisk androgen deprivasjon og kjemoterapi, etc. [2] – [6]. Men den terapeutiske effekten er utilfredsstillende. Utvikling av nye behandling, slik som molekylær terapi er nødvendig for å behandle prostatakreft. Men den karakteriseringen av de molekylære mekanismer som forårsaker prostata kreft er det grunnlag for å etablere en ny terapi. Hvis vi bestemmer terapeutiske molekylære mål som bidro til prostatakreft først, så vi kan behandle pasienter via rettet mot de tumormarkører for å hemme prostatakreft, ytterligere forbedre prognose og lavere dødelighet.
human chorionic gonadotropiner (hCGs) er heterodimere glykoproteiner utskilt av trofoblastisk celler i normal graviditet. HCGs har noen isoformer som inneholder intakt hCG, hCGα, hCGβ, hyperglykosylerte (hCGh), komme nicked (hCGn) og kjerne fragment av hCGβ (hCGβcf) [7]. HCGβ er et molekyl med selvstendig funksjon. Det er blitt vist at fri hCGβ er en potensiell svulst markør fremstilt av en rekke forskjellige tumorer [8] – [10]. Vi rapporterte tidligere at hCGβ redusert E-cadherin uttrykk som fører til migrasjon og invasjon i prostatakreftceller [11]. Men de involverte hele mekanismene er ikke klart.
ekstracellulær signalregulerte kinase1 /2 (ERK1 /2) aktivering har vært innblandet i kreftutvikling og kreft progresjon. Økt ERK1 /2 aktivitet fremmer kreftcelle spredning og metastase i ulike kreftcellelinjer [12] – [15]. ERK1 /2 blokker, PD98059 resulterte i en reduksjon av cellevekst og invasivitet i prostata kreft. I MA-10-Leydig-celler, hCG utløst transient ERK1 /2-aktivering via oppstrøms proteinkinase A (PKA) [12]. I tillegg hCG induserer også ERK1 /2-fosforylering i en PKA-uavhengig måte i endometrium og er involvert i karsinogenese [13], [14]. Dessuten er det bevis for at matriksmetalloproteinaser (MMP) uttrykk ble regulert av ERK1 /2 i invasive karsinomer. Undersøkelser har vist at aktivert ERK1 /2 reguleres aktiviteten av MMP fører til ekstracellulære matriks (ECM) nedbrytning og cellemotilitet [13] – [15]. Mange MMP regnes som essensielle proteaser i ECM degradering og ombygging [16]. Rapporten viste at hCG stimulert sekresjon av MMP-2 og MMP-9 i en doseavhengig måte i cytotrophoblastic celler [17]. Videre hCG oppregulert MMP-2 aktivitet og fremmet celle motilitet i SGHPL-5-cellelinjer [18]. I human prostatakreft, bidro forbedret MMP-2 og MMP-9 aktivitet i tumorinvasjon og metastase [19] – [21]. Undersøkelser viste at vitamin D og vitamin D analog ZK191784 downregulated MMP å hemme invasjonen i prostata kreft [22] – [24]. Utvilsomt, MMP er de viktige anti-invasjons mål. Derfor foreslår vi at hCGβ kan øke ERK1 /2 fosforylering og videre oppregulere MMP å fremme cellemotilitet.
Derfor her vi vil undersøke hCGβ-utløst signalveier og sammenhengen mellom hCGβ uttrykk og cellemotilitet. Gjennom denne studien, håper vi at vi vil finne nye ledetråder i molekylær terapi for å behandle prostatakreft.
(A) Kvantitativ analyse av hCGβ mRNA og β-aktin mRNA transkripsjon i DV og DH celler ved Real-time PCR . DV: DU145 celle transfektert med tom vektor; DH: DU145 celler transfektert med hCGβ cDNA konstruere. Merk at hCGβ mRNA ble sterkt uttrykt versus kontroll. (B) Analyse av hCGβ protein uttrykk ved Western blot. β-aktin ble benyttet for lik belastning og normalisering. Resultatene indikerte at hCGβ ble sterkt uttrykt i DH-celler. * Indikerer
P 0,05
versus kontroll DV celler. Data ble vist som betyr ± SEM fra tre separate tester.
Materialer og metoder
Materialer
HCGβ standarder ble kjøpt fra Abcam (Hong Kong). Konstruksjonen pVSneo-hCGβ inneholder hCGβ cDNA ble kjøpt fra Stratagene (La Jolla, California). Restriksjonsenzymer Sall, Xhol, EcoRI, BamHI, Hindlll og T4 DNA-ligase, kompetente celler er et produkt av Invitrogen (Carlsbad, CA). G418 og krystallfiolett ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Human prostatakreft DU145 og PC3 (for å være en reserve) celler ble produktene fra American Typisk Culture Collection (Rockville, MD). Celler ble dyrket i DMEM-medium (Hyclone) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C, 95% luft og 5% CO
2. Transwell plater med indre innstikk eller kunstige basalmembranene ble kjøpt fra BD Biosciences (Bedford, MA). Anti-hCGβ var fra Biodesign International (Saco, ME); anti-ERK1 /2, anti-fosfor-ERK1 /2 og anti-MMP-2 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc (Shanghai, Kina).
Transfeksjon
Via transfeksjon, vi etablert stabil cellelinje overekspresjon hCGβ i DU145 cellene. Kontrollen vektor pVSneo-vektoren ble laget ved å kutte hCGβ cDNA med restriksjonsenzymene først og deretter autoligation som tidligere beskrevet [11]. Celler ble sådd ut i seks-brønns plater med DMEM vekstmedium. Når cellene kommer til 90% konfluens, ble konstruksjonene inneholder pVSneo-hCGβ eller pVSneo-Vector transfektert inn i DU145 cellene følgende Fugene HD transfeksjon reagens (Roche, USA) og produsentens instruksjoner. Etter at cellene ble inkubert ved 37 ° C i 48 timer, ble cellene spaltet med trypsin-EDTA og dyrket i seleksjonsmedium inneholdende G418 (1,2 mg /ml). Videre ble cellene inkubert i ytterligere to uker. Cellene uten integrering av hCGβ genet var døde og flytende i medium og enkeltkolonier som stabilt uttrykker hCGβ ble samlet. De siktede celler ble dyrket i seleksjonsmedium (600 ug /mL G418) i to uker inntil ingen døde celler ble funnet. De merkede cellene ble opprettholdt i medium inneholdende 600 ug /ml G418 for ytterligere prøving. Vi lyktes i å etablere stabile cellelinjer i tidligere arbeid [11]; her brukte vi en ny transfeksjon reagens å forbedre transfeksjonseffektivitet.
Real-time PCR
Celler ble dyrket som de rutinemessige prosedyrer i kulturmediet. Deretter ble total-RNA isolert ved anvendelse av TRIzol Reagens (Invitrogen, USA). HCGβ cDNA ble gjort ved hjelp av revers transkriptase Kit (Takara, Kina) med 1,5 mikrogram total RNA etter produsentens anvisninger. Real-time PCR ble utført på en Stratagene Mx3000P instrument. For sanntids termisk sykling, ble triplikate alikvoter av cDNA brukt i en reaksjonsblanding inneholdende 250 nM av hver primer i et reaksjonsvolum på 25 ul av den PrimeScriptTM RT reagens Kit (Takara, Kina). PCR sykkel program ble kjørt med en innledende predenaturation trinn ved 94 ° C i 60 s, deretter med en 40 syklus av forsterkertrinn, ved 94 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s, 72 ° C i 20 sek. Primerne var som følger:
hCGβ (fremover): 5′-TCTGTGCCGGCTACTGCCCC-3 «;
hCGβ (revers): 5′-TTGGGACCCCCGCAGTCAGT-3′;
β-aktin (fremover): 5′-AACTCCATCATGAAGTGTGACG -3 «; . Β
β-aktin (revers): 5′-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3 «
Data ble samlet inn og analysert ved å følge produsentens manual instruksjon
ELISA
..
HCGβ er et utskilt protein, som kan interagere med noen reseptorer, slik som luteiniserende hormon-reseptor, etc. for å spille en rolle i å utløse de signalveier. Derfor må vi sørge for at uttrykt hCGβ ble utskilt i celle medium. Etter at stabile DU145-celler ble dyrket til 70% kon fl-frekvensen i vekstmediet ble cellene vasket tre ganger med serumfritt DMEM-medium. Deretter ble cellene dyrket i serumfritt DMEM-medium i 3, 6, 9, 12 og 24 timer. Mediet ble samlet inn på de angitte tidspunkter og ELISA ble utført for å teste utskilt hCGβ via en β-hCG ELISA kit (DRG Diagnostics, New Jersey, USA) etter produsentens anvisninger. I forrige undersøkelse, vi lyktes i å påvise hCGβ sekretet i hCGβ transfekterte celler via en hCGβ deteksjon Kit, F-hCGβ ccubind ELISA, fra Monobind (Costa Mesa, California) [11]. For å reprodusere og bekrefte disse resultatene, vi brukte en β-hCG ELISA kit å bestemme hCGβ sekresjon.
Immunoblotting
Etter at DU145 cellene ble dyrket i ønsket tid, ble cellene samlet og lyseres med lyseringsbuffer (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksycholat og proteaseinhibitorer, Thermo Scientific, USA). Cellelysat ble sentrifugert ved 18.000 g i 20 min. Total proteinkonsentrasjoner ble testet ved BCA Protein Assay Kit (Invitrogen). Åtti mikrogram protein ble applisert på 10% SDS-PAGE-geler og kjørt i ønsket tid, avhengig av molekylvekten, og deretter overført til nitrocellulosemembraner med en semi-tørr overføring. Membranene ble blokkert i 1,5% BSA i TBS-T-buffer i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting, deretter inkubert med primære antistoffer separat, ved 4 ° C over natten. Etter vasking med TBST 3 x 10 minutter hver, ble membranene probet med fl uorescence-merket sekundært antistoff (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE) i 1 time ved romtemperatur. Etter tre vasker ble membranene skannet i 700 eller 800 kanaler ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Bioscience, Lincoln, NB, USA). β-aktin ble benyttet for lik belastning og normalisering. Antistoffer ble fortynnet på riktig måte.
Gelatin Zymografi
Etter ERK1 /2 blokkerings PD98059 (25 uM) ble anvendt for å behandle DU145-celler i 2 timer, vi endret 10% føtalt bovint serum DMEM-medium inn i serumfritt medium, og dyrket i 24 timer. Medium sammen med utskilt hCGβ ble oppsamlet fra et likt antall celler og blandet med like mengder av ikke-reduserte prøvebuffer. De like volumer av medium ble underkastet elektroforese på 10% SDS-polyakrylamidgeler inneholdende 1 mg /ml gelatin som en protease-substrat. Gelen ble vasket i 2,5% Triton X-100 oppløsning ved romtemperatur med forsiktig omrøring, og ble dynket i buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl
2 · 2 H
2O, og 0,02% Brij-35, pH 7,6) ved 37 ° C i 42 timer. Etter inkubering ble gelen farget i 30 minutter med fargeløsning (0,5% Coomassie Brilliant Blue, 25% isopropanol og 10% eddiksyre). Da den fargede gel ble avfarget med et passende Coomassie R-250 avfarging-oppløsning (50% metanol, 10% eddiksyre). I området med matriksmetalloproteinaser vil klare bånd mot mørk blå bakgrunn dukke opp. For å vise lik belastning, ble en parallell SDS gel kjøre for å teste MMP-2 og β-aktin via Western blot.
cellemotilitet Analyser
Prostatakreft celle migrasjon ble gjort i en 24-brønn plate med indre kammer; kammeret bunnen har 8 mikrometer porer. Sum 1 x 10
5-celler ble sådd ut i det øvre kammer med 500 ul serumfritt medium, og 1 ml DMEM-medium med 10% føtalt bovint serum ble tilsatt i det nedre kammeret. Etter at cellene ble dyrket i 6 timer, ble cellene i det øvre kammer fjernes med en bomullsdott. De migrerte celler (eller pseudopodia) på bunnen av kammeret ble fiksert med 100% metanol i 10 minutter ved -20 ° C, deretter beiset med 0,5% krystallfiolett oppløsning ved romtemperatur i 10 min. Etter beveger seg bort krystallfiolett-oppløsning, ble cellene skylt med destillert vann inntil intet overskudd av fargestoff ble vist. De migrerte celler eller pseudopodia ble fotografert og regnes fra 5 tilfeldig utvalgte områder; bildene ble fotografert med kamera med en Leica DM IRB mikroskop ved × 200 forstørrelse. Invasjon analysen ble utført ved tumorinvasjon System (8 um pore, BD BioCoat). Bunnen av cellekulturen innskudd ble belagt med kunstig basalmembran belagt med matrigel. Basalmembran er tynne ekstracellulære matrise underliggende epitelceller. Matrigel er et kommersielt produkt utvunnet fra en mus sarkom rik på ekstracellulære matriksproteiner. Hovedkomponenten er laminin, etterfulgt av collagen IV og heparin sulfat proteoglykaner. De andre fremgangsmåtene er de samme som i migrasjonsanalysen.
Statistical Analysis
Data ble underkastet analyse av varians med posttester for sammenligning blant spesielle grupper. Data ble uttrykt som middel ± SEM og analysert for statistisk signifikans ved hjelp av variansanalyse (ANOVA). Bonferroni korreksjoner for multiple sammenligninger mot en enkelt gruppe ble brukt.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Det minste antall gjentatte eksperimenter var 3.
Resultater
HCGβ Expression
Først bygget vi en kontroll vektor som beskrevet over; deretter DU145-celler ble transfektert med konstrukter, enten med eller uten hCGβ cDNA. Etter etablering av stabile cellelinjer, ble cellene opprettholdt i medium inneholdende 600 ug /ml G418 for videre studier. For å teste hCGβ ekspresjon i transfekterte DU145-celler, ble både sanntids-PCR og Western blot brukes til å bestemme mRNA og protein ekspresjon etter at cellene ble inkubert i henholdsvis 24 timer, (Figure1A, Figure1B). Resultatene viste at hCGβ ble sterkt uttrykt i både mRNA og proteinnivåer versus tom-vektor transfekterte DU145 (DV) celler. Enten hCGβ mRNA eller protein beløpet var lite i kontrollcellene under disse forsøksbetingelsene
HCG Utskillelse
ELISA viste at hCGβ ble utskilt i medium enormt i 24 timer.; beløpet var opp til 150 ng /ml (figur 2). Mengden av hCGβ sekresjon ble økt med inkubasjonstid. Merk at vi etablert en stabil cellelinje overekspresjon hCGβ. HCGβ kan spille en viktig rolle i signalisering mellom ekstracellulære og intracellulære kommunikasjon.
data viste at det ikke var hCGβ utskilt i cellemedium. Videre er nivået av hCGβ sekrert i mediet øker med tid etter at hCGβ transfekterte cellene ble inkubert i 3, 6, 9, 12 og 24 timer.
HCGβ Aktivert ERK1 /2
HCGβ standarder ble brukt til å behandle ikke-transfekterte DU145 cellene ved doser på 25, 50, 100 og 200 ng /ml i 24 timer, Western blot viste at ERK1 /2-ekspresjon ble øket etter en doseavhengig trend, og ERK1 /2 fosforylering kom til topp med en behandling 200 ng /ml hCGβ (figur 3A). Følgelig, behandlet vi cellene ved 0 (CON, kontroll), 5, 15, 30 og 60 minutter for å bestemme ERK1 /2 fosforylering. Resultatene viste at ERK1 /2 fosforylering fulgte en tidsavhengig måte og kom til topp ved 30 min på behandling med 200 ng /ml hCGβ (figur 3B). I tillegg ble ERK1 /2 fosforylering funnet signifikant høyere i hCGβ transfekterte DU145 (DH) celler enn kontrollceller. Men PD98059 (25 mm), en bestemt blocker, hindret ERK1 /2 fosforylering betydelig versus ubehandlede celler (Figur 3C). Legg merke til at hCGβ forårsaket ERK1 /2 aktivisering følgende dose- og tidsavhengige oppførsel.
(A) Vi har vist at det konsentrasjon på 200 ng /ml hCGβ standarder indusert celle invasjon [11]. Således, her behandlet vi ikke-transfektert DU145-celler med ulike doser på 0, 25, 50, 100, og 200 ng /ml hCGβ i 1 time. Western blot viste at hCGβ standarder fosforylert ERK1 /2 på en doseavhengig trend. Ved en konsentrasjon på 200 ng /ml, ERK1 /2 aktivisering nådd toppen. (B) Ikke-transfekterte DU145-celler i serumfritt medium ble behandlet med 200 ng /ml hCGβ for 0, 5, 15, 30 og 60 min. Western blot viste at hCGβ aktivert ERK1 /2 på en tidsavhengig måte. På tidspunktet for 30 min, ERK1 /2 fosforylering nådd toppen, og deretter gikk ned. (C) Cellene ble forbehandlet med PD98059 (25 pM) i 30 minutter og deretter inkubert i 24 timer i serumfritt medium, Western blot viste at hCGβ aktivert ERK1 /2, men PD98059 redusert ERK1 /2 aktivering. * Indikerer
P 0,05
versus DV. Data ble vist som betyr ± SEM fra tre separate tester.
HCGβ Induced MMP-2 Expression via Aktivering av ERK1 /2
MMP-2 ble vist å være involvert i kreftcelle migrasjon og invasjon. Her undersøkte vi hCGβ-indusert MMP-2 uttrykk i hCGβ ikke-transfekterte DU145 cellene. HCGβ standarder ble tilsatt til serumfritt medium i doser på 0 (CON, kontroll), 25, 50, 100 og 200 ng /ml. Western blot viste at hCGβ øket MMP-2-ekspresjon i en doseavhengig måte, ble MMP-2 ekspresjon økes til topp når de ble behandlet med 200 ng /ml hCGβ (figur 4A). Videre har vi behandlet cellene med PD98059 (25 uM), viste resultatene at MMP-2-ekspresjon i DH-celler ble bemerkelsesverdig nedregulert (figur 4B), som indikerer at MMP-2 oppregulering resulterte fra ERK1 /2 fosforylering.
(A) Vi behandlet ikke-transfektert DU145-celler med 0, 25, 50, 100, og 200 ng /ml hCGβ i 1 time, Western blot indikerte at hCGβ standarder oppregulert MMP-2 på en doseavhengig måte, ved den konsentrasjon på 200 ng /ml, MMP-2 ekspresjon nådd toppen. (B) Vi behandlet DH og DV-celler med eller uten PD98059 (25 pM) i 30 minutter og deretter inkubert i 24 timer med serumfritt medium, Western blot viste at hCGβ oppregulert MMP-2-ekspresjon og PD98059 opphevet dem øker. Størrelsene for pro-MMP-2 og aktiv-MMP-2 er 72 Kd og 64 Kd, henholdsvis. * Indikerer
P 0,05
versus kontroll. Data ble vist som betyr ± SEM fra tre separate tester.
HCGβ Økt MMP-2 aktivitet via aktivering av ERK1 /2
Gelatin zymografi analysen viste at MMP-2 aktiviteten ble redusert av PD98059 (25 pM) (figur 5), noe som indikerer at hCGβ aktivert MMP-2 via ERK1 /2 fosforylering.
Vi samlet betinget medium fra det ovenstående behandling ble for geltin zymografi assay som metoder. Resultatene viste at hCGβ øket MMP-2 aktivitet og redusert PD98059 disse effekter. * Indikerer
P 0,05
versus kontroll. Data ble vist som betyr ± SEM fra tre separate tester. Den nedre panel av gel bildene viste en lik belastning som en parallell SDS gel ble kjørt for å teste β-aktin via Western blot.
HCGβ Økt cellemotilitet via ERK1 /2 Fosforylering
i forrige undersøkelse, viste vi at hCGβ indusert prostata kreft celle migrasjon og invasjon. I denne studien ytterligere bekreftet vi hvordan hCGβ indusert celle trekkfugl og invasive atferd. Å vite hvorvidt hCGβ induserte celle motilitet resulterte fra ERK1 /2 fosforylering, ble migrerings og invasjons analyser utføres enten med eller uten PD98059 (25 uM). De nøyaktige metoder ble som beskrevet i Metoder. Resultatene viste at hCGβ signifikant økt både celle migrasjon og invasjon; men PD98059 sunket betraktelig disse effektene (Figur 6A, 6B). Merk at hCGβ nøyaktig akselerert celle migrasjon og invasjon via ERK1 /2 fosforylering.
(A) Vi seeded 1 × 10
5 celler i en 24-brønns plate med celle inserts, cellene ble tilsatt med /uten PD98059 (25 pM) i 6 timer for å påvise cellemigrering, viste resultatene at hCGβ fremmer cellemigrering i betydelig grad sammenlignet med kontroll. (B) under de samme betingelser Vi inkuberte cellene i invasjon kammer med kunstig basalmembran ble cellene tilsatt med /uten PD98059 (25 uM) i 12 timer for å detektere celle invasjon, viste resultatene at hCGβ fremmer celle invasjon betydelig. Alle prosedyrer ble utført som beskrevet i Metoder. * Indikerer
P 0,05
versus kontroll. Data ble vist som betyr ± SEM fra tre separate tester.
Diskusjoner
Prostatakreft står for 29% av alle krefttilfeller hos menn [25]. Prostata kreft celler har en slående tendens til metastaser og metastasering er den viktigste årsaken til dødelighet for kreftpasienter [26]. Derfor er det nødvendig å finne og karakterisere molekylære mål for å hemme invasjon og metastasering via genet målgruppe.
HCGβ er en betydelig markør for malign transformasjon. Nesten hver kreft hos mennesker produserer hCGβ til en viss grad [27]. Undersøkelser viste at hCGβ fremmer kreft celle spredning og kanskje også fremme metastasering. For eksempel, Laurence A Cole oppdaget at hCGβ kan konkurrere med en TGFB å binde en TGFfi reseptor, som TGFfi reseptorantagonismen å kontrollere apoptose og fremme invasjon ved å aktivere metalloproteinaser [28]. Også en annen rapport viste at hCGβ og VEGF spille en koordinert rolle gjennom sine angiogene og invasive egenskaper i utviklingen av Barretts adenokarsinomer [29]. Gjennom de ovenfor angitte resultater kan vi konkludere med at hCGβ kan spille en viktig rolle i kreftfremmende via flere signalveier. Dermed er det viktig å undersøke hCGβ-utløst signalveier i tumor migrasjon og invasjon.
I forrige undersøkelse viste vi at hCGβ endret kreftcelle morfologi, akselererer cellemotilitet, downregulating migrasjon hemmende protein E-cadherin, fremme human prostatakreft migrering og invasjon [11]. Men de ytterligere mekanismer for å forårsake migrering og invasjon holde ukjent. I denne studien fant vi at noen signalveier var knyttet til migrasjon og invasjon. Her viste vi at hCGβ oppregulert ERK1 /2 og MMP-2 fører til celle migrasjon og invasjon. Bruke ERK1 /2 fosforylering blocker PD98059, oppdaget vi at MMP-2 oppregulering resulterte fra ERK1 /2 fosforylering. ERK1 /2 har vist seg å bidra til tumor proliferasjon, migrering og metastase, og flere studier har rapportert at hCG fremmet ERK1 /2-aktivering i visse celletyper [30], [31]. Selvfølgelig, disse resultatene er i samsvar med våre resultater at hCG indusert ERK1 /2 fosforylering i en dose- og tidsavhengige oppførsel i DU145 cellene. ERK-reaksjonsveien er knyttet en av de mest kritiske signalveier i tumorforeteelse, utvikling og klonal ekspansjon. Spesielt, er MMP-2 nøkkelen molekylet i tumorinvasjon. Våre funn at hCGβ aktivert MMP-2 via ERK1 /2 fosforylering i DU145-celler er svært viktig. Disse resultatene ikke bare avdekket forholdet mellom hCGβ og kreft, men også at vi har funnet en ny nøkkel vei til å hemme kreft. Åpenbart hCGβ /ERK1 /2 /MMP-2 pathway er viktig i tumorinvasjon, i det minste i prostata kreft. Med andre ord har vi funnet mer nyttige metoder for å hemme tumorinvasjon, og videre vi kan utvikle molekylære mål-medikamenter.
hCG er sammensatt av to subenheter, hCGα og hCGβ. Disse to subenheter lage et kompleks, som binder til luteiniserende hormon reseptoren og utløser signalveier. Men vi vet ikke om hCGβ også binder seg til luteiniserende hormon reseptor separat. Denne studien ga oss nye hint, og vil presse oss til å karakter hCGβ bestemt reseptor.
Dessuten MMP ble ansett for å være metastase fremme molekyler med mange typer isoformer. De har potensiale for å nedbryte den ekstracellulære matriks og grunnmembranen. MMP-2 har vært innblandet å være et sentralt medlem i MMP. Mer, ERK1 /2 kan translocate til kjernen og aktivere enkelte Transkripsjonsfaktor AP-en for å regulere gentranskripsjon [32]. AP-en finner i MMP-2 promoter region av MMP-2-genet, således ERK1 /2 kan fremme MMP-2 transkripsjon og frigi [33], [34]. Derfor, for å undersøke rollen til ERK1 /2 i regulering av cellemigrering og invasjon, vi med hell bestemt MMP-2-ekspresjon og aktivitet. Vi fant at hCGβ betydelig økt MMP-2-ekspresjon og aktivitet. Disse effektene ble bemerkelsesverdig undertrykt av PD98059 i hCGβ transfektert DU145 cellene. Disse resultatene viste en krysstale mellom ERK1 /2 og MMP-2. Sammentreffet, fant vi også at hCGβ fremmet ERK1 /2 fosforylering og MMP-2 uttrykket etter samme dose og tidsmønstre. Disse resultatene indikerte at hCGβ utløste ERK1 /2-aktivering resulterte i MMP-2 oppregulering og økt MMP-2 aktivitet. Derfor hCGβ forårsaket migrasjon og invasjon resulterte fra ERK1 /2 aktivering. Vi har imidlertid ikke tilstrekkelig bevis om hCGβ-forårsaket MMP-2 oppregulering spiller en stor rolle i migrasjon og invasjon. Transfeksjon med MMP-2 konstruere og slå ut av MMP-2 studien kan bidra til å svare på disse spørsmålene. Ytterligere karakterisering av hCGβ signalering vil hjelpe oss å finne flere metastase markører for å møte de terapeutiske krav.
faktisk noen eksperter har startet forskning på hCGβ beslektede antistoffer i feltet av kreft [35], [36]. Her avdekket vi at hCGβ fosforylert ERK1 /2 og videre oppregulert MMP-2 for å øke kreft bevegelighet i prostatakreftceller. Våre resultater kan gi ny innsikt i de molekylære mekanismer for hCGβ regulering, og gi et sterkere grunnlag for hCGβ relatert forskning på tumor suppressor agent.
Vi har funnet noen nye molekylære mål å hemme invasjon og metastasering av prostata kreft. Effektiv behandling av prostatakreft er av stor betydning. Blokkering hCGβ signalering er en potensiell terapeutisk strategi for å behandle prostatakreft og andre kreftformer. Videre arbeid må prege hCGβ reseptor; utvikling av hCGβ signalblokkere vil være en potensiell felt for å senke invasjon og metastasering.
Takk
Vi takker Dr. Ameae Walker, University of California, Riverside for hennes slag retning i den opprinnelige prosjektdesign . Vi takker også Dr. Tao Jiang, Tiantan Hospital, Capital Medical University for hans hjelp i forsøkene.
