Abstract
Bakgrunn og Mål
Økende bevis har antydet at leverkreft (HCC) kan stamme fra en distinkt undergruppe kalt kreftstamceller (cscs), som er ansvarlig for den begrensede effekten av konvensjonell terapi. Vi har tidligere demonstrert at granulin-epithelin forløper (GEP), en pluripotent vekstfaktor, blir oppregulert i HCC, men ikke i den tilstøtende ikke-svulst, og at GEP er et potensielt terapeutisk mål for HCC. Her preget vi uttrykket mønster og stamcelleegenskaper i fosterets og kreft lever.
Metoder
Protein uttrykk for GEP i føtale og voksne lever ble undersøkt i menneske- og musemodeller ved immunhistokjemisk farging og flowcytometri. Leverkreft cellelinjer, isolert basert på deres GEP og /eller ATP-avhengige bindende kassett (ABC) stoffet transporter ABCB5 uttrykk, ble vurdert for lever CSC egenskaper i form av kolonidannelse, chemoresistance og tumorgenisiteten.
Resultater
Vi viste at GEP var en lever onkoføtal protein som uttrykkes i fosterets lever, men ikke i normale voksne lever. Viktigere, GEP + føtale leverceller co-uttrykte embryonale stamceller (ES) celle-relaterte signalmolekyler inkludert β-catenin, Oct4, Nanog, Sox2 og DLK1, og også lever CSC-markører CD133, EpCAM og ABCB5. Fenotypisk karakterisering i HCC kliniske prøver og cellelinjer viste at GEP + kreftceller co-uttrykte disse stamcellemarkører på samme måte som den GEP + føtale leverceller. Videre GEP ble vist å regulere uttrykket av ES-cellerelaterte signalmolekyler β-catenin, OCT4, Nanog, og Sox2. Isolerte GEP
høye kreftcellene viste økt kolonidannelse evne og chemoresistance sammenlignet med de GEP
lave kolleger. Co-uttrykk for GEP og ABCB5 bedre definert CSC populasjoner med forbedret tumorigen evne hos immunsupprimerte mus.
Konklusjoner
Våre funn viser at GEP er en lever onkoføtal protein som regulerer ES-cellerelaterte signalmolekyler . Co-uttrykk for GEP og ABCB5 beriker ytterligere en undergruppe med forbedrede CSC egenskaper. De aktuelle dataene gir ny innsikt i den terapeutiske strategi
Citation. Cheung PFY, Cheng CKC, Wong NCL, Ho JCY, Yip CW, Lui VCH, et al. (2011) Granulin-Epithelin Precursor Er en onkoføtal Protein Definere leverkreftstamceller. PLoS ONE 6 (12): e28246. doi: 10,1371 /journal.pone.0028246
Redaktør: Young Nyun Park, Yonsei University School of Medicine, Republikken Korea
mottatt: 02.06.2011; Godkjent: 04.11.2011; Publisert: 16.12.2011
Copyright: © 2011 Cheung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Sun CY Research Foundation for Hepatobiliær og bukspyttkjertelen kirurgi, Natural Science Foundation of China National og Hong Kong Stipend Council (N_HKU 709/07, HKU7 /CRG /09), Seed finansieringsprogrammet og små prosjektmidler Program ved University of Hong Kong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC), den tredje største årsaken til kreftdødelighet i verden, er en svært ondartet sykdom uten effektiv behandling for tiden [1]. Mens de molekylære mekanismene for patogenese HCC forblir stort sett ukjent, HCC ansett som en heterogen sykdom på grunn av sine mange molekylære profiler og varierte kliniske resultater [2]. Den heterogene natur HCC og mangel på egnede biomarkører har hindret pasienten prognose og behandling.
I årevis svulst celle heterogenitet har blitt forklart av klonal evolusjon modell [3]. Imidlertid tyder nyere bevis at svulster er hierarkisk organisert med en distinkt undergruppe som kalles kreft stamceller (cscs) liggende på toppen av hierarkiet. Disse cellene er ikke bare ansvarlig for tumor initiering og progresjon, men også utstyrt med stamcelleegenskaper, inkludert selvfornyelse, differensiering kapasitet og chemoresistance [4]. Selv om eksisterende behandlingsformer kan i utgangspunktet eliminere mesteparten befolkningen i svulsten, stamcelleegenskaper av cscs sette dem i stand til å overleve og repopulate svulsten, noe som resulterer i sykdom tilbakefall [5].
Begrepet cscs er dokumentert i mangfoldige maligniteter, inkludert bryst [6], tykktarm [7] og lever-kreft [8], [9]. Til tross for nylige fremskritt i lever CSC identifikasjon, nøyaktig opprinnelsen til disse cellene er fortsatt i stor grad ukjent. Tumorigenesis og embryogenese er kjent for å dele mange felles egenskaper, inkludert mobil plastisitet, dynamisk cellemotilitet [10] og konvergens av signalveier, noe som tyder på en mulig sammenheng mellom embryonale celler og kreftceller [11]. Interessant, er begrepet CSC særlig ligner på «embryonal resten» teori, som ble foreslått basert på histologiske likheter av embryonale og kreft vev, noe som tyder på at voksne vev inneholder embryonale rester som normalt ligge sovende, men kan aktiveres for å bli kreft [12]. Derfor, identifisering av nøkkelmolekyl som danner grunnlaget for den felles av embryonale stamceller (ES) celler og kreftceller kan resultere i nye terapeutiske strategier for å undertrykke malign transformasjon av normale stamceller, eller utrydde cscs.
Granulin-epithelin forløper (GEP, også kalt progranulin, proepithelin, acrogranin, eller PC-avledet vekstfaktor) er en pluripotent vekstfaktor som regulerer fosterutvikling [13], vevsreparasjon [14] og tumorgenese i forskjellige cancere [15]. Det ble funnet å regulere utviklings hendelser, inkludert kavitasjon i preimplantation museembryoer [16] og mannsspesifikke hjernen differensiering av hypothalamus av neonatale rotter [17]. Tidligere har vi demonstrert GEP-overekspresjon i de fleste humane HCC prøver [18], [19] og dens rolle i regulering av celleproliferasjon HCC, invasjon og tumorgenisitet [19]. Videre nøytralisering av GEP kunne hemme veksten av etablerte HCC [20]. Til tross for stor interesse for sine dobbeltroller i embryogenese og tumorigenesis, er informasjonen for sitt uttrykk mønster og biologiske funksjoner i lever fortsatt mangelvare.
I denne studien rapporterer vi for første gang at GEP er en lever onkoføtal protein som regulerer uttrykket av stamcellerelaterte signalmolekyler β-catenin, OCT4, Nanog og Sox2. Funksjonelle studier bekreftet at GEP-uttrykke celler besatt større evne i kolonidannelse og chemoresistance. Videre kreftceller samtidig uttrykte GEP og ATP-avhengige binding kassett (ABC) B5 vist forbedret tumorigen evne hos immunsupprimerte mus. Våre funn er avgjørende ikke bare for forståelsen av fosterets lever utvikling, men også for å bygge spesifikke terapier rettet mot GEP og ABCB5 å utrydde kjemoresistent cscs i HCC pasienter.
Materialer og metoder
Cell analyser
menneskeleverkreft cellelinjer, Hep3B og HepG2, ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket som tidligere beskrevet [19], [20]; mens Huh7 ble kjøpt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og vedlikeholdes i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, California). Stabile transfektanter for GEP overekspresjon og undertrykkelse har blitt beskrevet [19]. GEP blokkering i Hep3B ble utført ved å inkubere cellene med eller uten 50 ug /ml anti-GEP monoklonalt antistoff A23 (hjemmelaget, som tidligere beskrevet [20] eller mus-IgG-isotype kontroll-antistoff (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 24 h.
kliniske prøver
studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB). Seks pasienter gjennomgikk kurativ delvis hepatectomy eller levertransplantasjon for HCC på Queen Mary Hospital, Hong Kong, ble rekruttert med skriftlig informert samtykke til studien. pasientene hadde blitt diagnostisert med primær HCC og bekreftet av patologiske undersøkelser. alderen på pasientene varierte 42-67 år, med en median alder på 60 år. Det var 4 menn og 2 kvinner, og alle var hepatitt B virus bærere. størrelsen av svulstene varierte fra 3,5 til 19,5 cm, med en median størrelse på 8,3 cm. spesielt hver prøve har begrenset antall celler (små forsknings prøven for å sikre at ingen interferens med patologisk undersøkelse) og derfor ikke er tilstrekkelig for den fullstendige panel av stamcelle-markør ekspresjon analyse. Ekspresjonsproduktene data for hver markør presenterte gjennomsnittsdata fra minst fire prøver. Den normale leverprøve ble oppnådd fra organtransplantasjon donor under drift, og den giver hadde ingen underliggende leversykdom og var negativ i hepatitt B-serologi test. Fosterets lever prøven ble innhentet fra gjenfinning av arkivert formalinfiksert parafin innebygd vevsblokk tatt under rutinemessig patologisk undersøkelse av abortus etter spontan abort på 10 uker 6 dager. Etikk godkjenning for bruk av arkiv fostervev identifisert fra en database er innhentet fra Institutional Review Board ved University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB).
Mus prøver
Livers fra voksen, neonatal og foster ICR mus ble samlet og studieprotokollen ble godkjent av komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning ved University of Hong Kong (Godkjenning Ref CULATR 1968 -09). For isolering av muse hepatocytter, ble lever hakket og spaltet med type IV kollagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Etter filtrering og lysering av røde blodceller, ble cellene telles for immunfluorescens farging og flowcytometrisk analyse (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, California). Celler isolert fra embryoniske lever ble farget med anti-AFP-antistoff (R 80% med minimal celledød ( 10%).
Doksorubicin akkumulering og apoptose
Celler ble inkubert med eller uten 0,5 mikrogram /ml doxorubicin i 24 timer. Intracellulær akkumulering doksorubicin ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved FL2-spektrum; mens celle apoptose ble bestemt av Annexin V-FITC (FL1) og propidiumjodid (PI) (FL2) farging og flowcytometrisk analyse.
Colony formasjon analysen
Fersk isolerte celler ble sådd på en densitet på 1000 celler /brønn og fikk vokse i 10 dager. Kolonidannelse ble vurdert av en kolo analyse ved hjelp av krystallfiolett (Sigma Aldrich).
In vivo
tumorigenitet eksperimenter
BALB /c atymiske nakne mus på 5 uker gammel ble brukt å teste
in vivo
tumorigent potensiale av cellene. Studien protokollen ble godkjent av komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning ved University of Hong Kong. Forskjellige antall av celler ble inokulert subkutant i det dorsale område av stammen av hvert dyr. Mus ble ofret mellom 8 og 16 uker etter injeksjon, hvor svulstene ble høstet for videre undersøkelse. De musene injisert med HCC celler, men med ingen tegn til tumorbyrden var generelt avsluttet 5 måneder etter celleinjeksjon.
statistiske analyser
Alle data ble uttrykt som middelverdier ± standardavvik (SD) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Forskjeller mellom grupper ble vurdert av Student t-test. En sannsynlighet (p) 0,05 ble ansett som vesentlig forskjellig. Alle analysene ble utført ved hjelp av statistisk programvare GraphPad Prism for Windows, versjon 3.00 (GraphPad Software, CA, USA).
Resultater
GEP er et lever onkoføtal protein
Tidligere , GEP mRNA ble rapportert i embryonale muselever [13], men om GEP settes til protein og det tid for innkobling /-off under leveren utvikling er fortsatt ukjent. Siden foster Leveren har rikelig med blodkreft stamceller i tillegg til foster hepatocytter, må vi identifisere celletypen (e) som uttrykker GEP. Her har vi beskrevet for første gang protein ekspresjon mønster av GEP i humane og muselever. Ved immunhistokjemisk farging, ble GEP protein påvist i mus og humane føtale lever, mens voksne lever var blottet for GEP-uttrykke hepatocytter (figur 1A).
(A) Immunhistokjemisk analyse viser GEP protein i fosterets lever hos mus ( embryonale dag 17,5) og menneskelig (10 uker 6 dager), men ikke hos voksne lever (Forstørrelse x 400). (B) Flowcytometrisk analyser viser uttrykk for GEP og leverstamcellemarkører i mus embryonale hepatocytter. Samtidig uttrykk for GEP og leverstamcellemarkører CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin ble utført av firedoble-farge flowcytometri, gating på AFP + og /eller albumin + hepatocytter av embryonale lever. Celler co-uttrykker de respektive merkene ble vist i øvre høyre kvadrant av dot tomter. Data er uttrykt som gjennomsnittlig prosent av celler + SD.
I musemodell, for å skille GEP ekspresjon spesielt i hepatocytter, analyse av GEP-nivå ble utført ved tre-farge flowcytometri, gating på AFP + og /eller albumin + for hepatocytter på alle utviklingstrinn. Inkludering av AFP + og /eller albumin + celler i alle utviklingsstadier vil bedre reflektere hepatocytter befolkningen i leveren fordi andelen AFP + celler og albumin + celler var annerledes i embryonale, nyfødte og voksne lever (Figur S1). GEP uttrykk økt gradvis fra embryonale dag E11.5 (14,8% + 6,9%) til E17.5 (30,8 + 9,2%). Umiddelbart etter fødselen, nedsatt GEP nivå brått fra dag 1 (4.4 + 1.5%) for å day7 (1,2 + 0,4%), og ble nesten umulig å oppdage hos voksne muselever (0,9 + 0,4%) (Figur S1). Sammen med våre tidligere funn om at GEP uttrykt i de fleste HCC prøver, men ikke i de tilstøtende ikke-tumor leveren vev [18], [19], vi bekreftet at GEP var en lever onkoføtal protein.
Å karakterisere stamcelle signaturen til GEP + foster hepatocytter, undersøkte vi co-uttrykk for GEP og flere lever stamcelle eller stamcellerelaterte markører inkludert CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin [21], [22], [23] [24] i de embryonale leveren (figur 1B). Hepatoblasts ville ha serie endringer underveis utviklingsstadier og gi opphav til hepatocytter og cholangiocytes. På embryonale dag 11,5 (E11.5), uttrykk for CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin var høyt i hepatoblasts og flertallet av GEP-positive celler co-uttrykte alle disse leverstamcellemarkører. På E13.5, uttrykk for CD133 og EpCAM begynte å avta og det meste av CD133 + eller EpCAM + celler ble observert å co-express GEP. For DLK1 og β-catenin, forble deres uttrykk nivåer høyt på E13.5 og flertallet av GEP-uttrykkende celler var også positivt for begge merkene. Ved E17.5, uttrykk for CD133, EpCAM, DLK1 og β-catenin redusert til lave nivåer, mens GEP uttrykk nådd toppen på dette stadiet. Avviket av uttrykk trender mellom GEP og disse stamcellemarkører kunne tilskrives de vekstfaktor egenskaper GEP. Mens videre undersøkelser er nødvendig for å belyse mekanismen bak uttrykket mønster av GEP, co-uttrykk for GEP med disse lever stamcelle eller stamcellerelaterte markører antyder en stamcelle fenotype av GEP-uttrykkende celler.
GEP uttrykk i muse hepatocytter ble undersøkt av vår hjemmelagde anti-GEP antistoff A23. Spesifisiteten til A23 ble undersøkt ved western blot (Figur S2, og resultatet viste at det kunne gjenkjenne mus GEP som enkelt bånd fra musen embryoniske leverproteinekstrakt. Videre har det GEP uttrykksmønster som vist på western blot var konsistent med strømnings cytometri data i at GEP proteinnivået økt fra E11.5 og E13.5 til E17.5, og gir konsistente data for å reflektere GEP uttrykk i de embryonale lever.
Fenotypisk karakterisering av GEP-uttrykkende celler i HCC
for å bedre karakter hvis GEP-uttrykker cellene hadde stamcelleegenskaper i HCC, undersøkte vi co-uttrykk for GEP og et panel av stamcellemarkører ved hjelp av flowcytometri i menneskelig HCC cellelinjer Hep3B og Huh7. markører undersøkt inkluderer blodkreft forløper celleoverflatemarkører CD31, CD34, CD117, lever forløper celleoverflaten markør CD123, stamcelleoverflatemarkører CD24, CD29, lever CSC overflatemarkører CD44, CD90, CD133, EpCAM, ES-cellerelaterte signalmolekyler β-catenin, Oct4, Nanog og Sox2, ABC narkotika transportører ABCC1 og ABCB5. Merk at ABC narkotika transportører ble også tatt med fordi både normale og kreftstamceller uttrykt høyere nivå av ABC narkotika transportører, bidrar til større motstand mot kjemoterapeutika enn differensierte celler [4], [21]. Blant de markører som undersøkes, ble GEP + -celler vist til fortrinnsvis co-express med β-catenin, Oct4, Nanog, Sox2, CD133 og EpCAM sammenlignet med GEP- celler i både HCC cellelinjer Hep3B (figur S3) og Huh7 (figur S4 ). Våre funn foreslo derfor en stamcelle funksjon i GEP-uttrykke celler i både embryonale og kreftleverceller.
GEP regulerer uttrykket av stamcellemarkører
Vi modulert de GEP uttrykk nivåer i Hep3B celler ved transfeksjon tilnærming og undersøkt om proteinnivåene til stammen cellemarkører ville bli forandret. Resultatene viste at oppregulering av GEP nivå forbedret, samtidig undertrykkelse av GEP nivå redusert ekspresjon av β-catenin, Oct4, Nanog, Sox2 og ABCB5 (tabell 1). Modulation på GEP tyder ikke endret uttrykk for lever stilk celleoverflatemarkører CD133 og EpCAM. Årsaken til dette kan være på grunn av det faktum at de fleste Hep3B celler var positive for CD133 og EpCAM (mer enn 95%), kan det således endring av et molekyl (for eksempel GEP) ikke være i stand til å skifte befolkningen. Mens GEP har tidligere blitt rapportert av vår gruppe for å regulere ABCB5 å megle chemoresistance i HCC celler [25], den positive sammenhengen mellom GEP og β-catenin, Oct4, Sox2 og Nanog antydet at GEP kan regulere uttrykket av disse ES cell-relatert signalmolekyler for å opprettholde pluripotency av stamceller.
for ytterligere å validere regulerende rolle GEP på uttrykk for disse signalmolekyler, GEP blokkering av anti-GEP monoklonalt antistoff A23 ble utført i Hep3B celler ( tabell 2). A23 ble funnet å signifikant redusere endogene GEP nivåer i Hep3B celler. GEP blokkering også betydelig undertrykkes uttrykk for β-catenin, Oct4, Nanog og Sox2, og befester den regulatoriske rolle GEP på uttrykk for disse stamcelle-relaterte signalmolekyler.
GEP-uttrykke celler har CSC egenskaper
in vitro
for å bedre karakterisere stamcelleegenskaper av GEP-uttrykkende celler, GEP
høy og GEP
lave subpopulasjoner ble isolert fra humane lever kreft cellelinjer Hep3B, HepG2 og Huh7, og undersøkt for deres uttrykk for stamcellemarkører ved hjelp av flowcytometri. Celler ble sortert basert på overflaten ekspresjon av GEP, men ikke på dens intracellulære ekspresjon, fordi permeabiliseringen var ikke mulig å holde cellene levedyktige for etterfølgende funksjonelle analyser. Etter celleisolasjon, ble 2 millioner av hver sortert populasjon oppsamlet for å vurdere cellelevedyktigheten ved trypan blå farging og renhet ved strømningscytometri ved anvendelse av en annen anti-GEP antistoff som gjenkjennes distinkte epitoper fra disse antistoffene som anvendes for cellesortering. Renheten av GEP
høye og GEP
lave subpopulasjoner var ca 80% til 90%, henholdsvis, som avslørt av post-sortering analyse (Figur 2A). GEP
høye celler ble funnet å uttrykke høyere nivåer av ES-celler relaterte signalmolekyler p-catenin, Oct4, Nanog, Sox2 og ABC narkotika transporter ABCB5 enn GEP
lave kolleger i de tre HCC cellelinjer (figur 2B) . For lever CSC overflate markør CD133, høyere overflateuttrykk i GEP
høye celler enn GEP
lav motstykke ble funnet i HepG2 og Huh7, men ikke Hep3B, som var sannsynligvis på grunn av den ekstremt høye CD133 ( 95 %) konstitutivt uttrykt i Hep3B-celler (data ikke vist). For EpCAM, ble høyere overflate ekspresjon observert i GEP
høy enn GEP
lave populasjoner i Huh7, men ikke Hep3B og HepG2, hvori flertallet av celler (mer enn 95%) ble funnet å uttrykke EpCAM. Dataene er derfor i tråd med tidligere funn om at GEP-uttrykkende celler i forbindelse med stamcelle markør uttrykk sammenlignet med GEP negative celler.
(A) GEP uttrykk i usorterte Hep3B, HepG2 og Huh7 celler, og den ferske isolert GEP
høy, og GEP
lave subpopulasjoner etter celle sortering. Celler ble sortert på grunnlag av overflateekspresjon av GEP, men ikke på dens intracellulære ekspresjon, for å holde cellene levedyktige for etterfølgende funksjonelle analyser. Etter celleisolasjon, 2 millioner av hver sortert populasjon ble oppsamlet for å vurdere cellelevedyktigheten ved trypan blå farging og renheten av de sorterte subpopulasjoner ved strømningscytometri ved anvendelse av en annen anti-GEP-antistoff (gjenkjenner distinkte epitoper sammenlignet med de antistoffene som anvendes for cellesortering ). Data er uttrykt som gjennomsnittlig prosent av GEP + celler ± SD. (B) Protein uttrykk nivåer av stamcellemarkører β-catenin, OCT4, Nanog, Sox2 og ABCB5 i de sorterte subpopulasjoner ble målt ved intracellulær farging og flowcytometrisk analyse. Data er uttrykt som midlere prosentandelen av positive celler ± SD. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001 sammenlignet med GEP
lave celler. (C) kolonidannelse effektiviteten av GEP
høye subpopulasjoner var høyere enn sine respektive GEP
lav og usorterte Hep3B og HepG2 celler. (D, E) Etter eksponering for doxorubicin (0,5 mikrogram /ml for 24 h), GEP
høye subpopulasjoner beholdt betydelig mindre doxorubicin og færre celle apoptose enn GEP
lav og usorterte Hep3B og HepG2 celler. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0.001 sammenlignet med usorterte kontroller
for å finne ut om GEP-uttrykke celler ble beriket for cscs, sammenlignet vi karsinogent potensial og stamcelleegenskaper av GEP
høye celler med sine kolleger
in vitro
i Hep3B og HepG2 celler, som representerer høye og lave GEP-uttrykkende cellelinjer, henholdsvis. Clonogenicity av cellene ble bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen. GEP
høye Hep3B cellene var i stand til å danne vesentlig flere kolonier sammenlignet med GEP
lave celler og usortert kontroll. Lignende observasjon ble vist med en uavhengig leverkreft celle HepG2 (figur 2C).
For å undersøke hvilken rolle GEP i chemoresistance ble cellene inkubert med doksorubicin og vurderes for intracellulær akkumulering av legemidlet og celle apoptose. GEP
høye subpopulasjoner, både Hep3B og HepG2 celler, viste signifikant lavere doxorubicin opptak (figur 2D) og celle apoptose (figur 2E) sammenlignet med usortert kontroll; mens GEP
lave subpopulasjoner viste økt doxorubicin opptak og celle apoptose sammenlignet med usorterte populasjoner.
GEP
highABCB5 + celler demonstrere høyere kolonidannelse evne og chemoresistance
Ifølge CSC hypotese, cscs representerer bare en sjelden populasjon av svulsten [4]. Dette innebærer at GEP
høy undergruppe er fortsatt heterogen, og muligens består av undergrupper med differensial tumorigene potensialer. Derfor søkte vi å ytterligere dissekere GEP
høy befolknings av ytterligere samtidig uttrykte markør.
I Hep3B celler, de fleste av ABCB5 + celler uttrykte GEP, men bare en undergruppe av GEP + celler ble ABCB5 + (figur 3A, venstre panel). I tillegg har vi vist at nylig ABCB5 regulerte leverkreft stamcellemarkører CD133 og EpCAM [21]. Vi antok derfor at GEP i kombinasjon med ABCB5 kan definere mer nøyaktig lever CSC befolkningen.
(A) GEP og ABCB5 uttrykk i usorterte Hep3B celler, og den ferske isolert GEP
highABCB5 +, GEP
highABCB5- og GEP
lowABCB5- subpopulasjoner. Cellene ble sortert basert på overflaten uttrykk for GEP og ABCB5. Etter celleisolasjon, 2 millioner av hver sortert subpopulasjon ble oppsamlet for å vurdere renhet ved strømningscytometri ved bruk av forskjellige anti-GEP og anti-ABCB5 antistoffer som gjenkjennes epitoper forskjellige fra de av antistoffene som benyttes for cellesortering. Merk at de fleste ABCB5 + celler var også GEP +, og dermed var det ingen GEP
lowABCB5 + celler (venstre panel). Betyr prosentandelen av celler ± SD er vist i hver kvadrant. (B) kolonidannelse effektiviteten av GEP
highABCB5 + undergruppe var høyere enn GEP
highABCB5-, GEP
lowABCB5- og usorterte celler. (C, D) Etter eksponering for doxorubicin (0,5 ug /ml for 24 h), GEP
highABCB5 + celler beholdes betydelig mindre doxorubicin og færre celle apoptose enn de andre subpopulasjoner. *
P
0,05, **
P
0,01 sammenlignet med usorterte kontroller; #
P
0,05, # #
P
0,01, # # #
P
. 0,001 mellom gruppene merket med horisontale linjer
Vi isolert GEP
highABCB5 +, GEP
highABCB5- og GEP
lowABCB5- celler fra Hep3B. Celler ble sortert basert på overflaten ekspresjon av GEP og ABCB5, men ikke på deres intracellulær ekspresjon, fordi permeabiliseringen var ikke mulig å holde cellene levedyktige for etterfølgende funksjonelle analyser. Etter celleisolasjon, ble sortert subpopulasjoner vurdert for cellenes levedyktighet ved trypan blå flekker og renhet ved flowcytometri hjelp av ulike anti-GEP eller anti-ABCB5 antistoffer som anerkjente forskjellige epitoper fra de antistoffer som brukes for cellesortering. Minst 80% renhet ble oppnådd i hver undergruppe (figur 3A) og deres tumorigene potensialer ble undersøkt både
in vitro Hotell og
in vivo
.
GEP
highABCB5 + celler demonstrerte induksjon av det største antall kolonier, mens GEP
highABCB5- celler viste middels evne til å danne kolonier, men fortsatt betydelig høyere enn usortert kontroll. Viktigere, GEP
lowABCB5- undergruppe var nesten ute av stand til å danne kolonier (Figur 3B).
Ved eksponering for doxorubicin, GEP
highABCB5 + celler viste signifikant lavere nivå av doxorubicin opptak og celle apoptose sammenlignet med GEP
highABCB5- celler og usortert kontroll. Tvert imot, GEP
lowABCB5- celler var svært følsomme for doxorubicin i form av narkotika opphopning og celle apoptose (figur 3C og D)
GEP
highABCB5 + celler er mer tumorigent
in vivo
Tumor utviklings eksperimenter med GEP
highABCB5 + og GEP
lowABCB5- subpopulasjoner isolert fra Hep3B celler ble utført hos immunsupprimerte nakne mus. Alle mus injisert med GEP
highABCB5 + celler utviklet svulster. Mus injisert med 1 x 10
6 doble positive celler dannet tumorer i løpet av to til 4 uker etter inokulering. Tvert imot, bare 2/10 mus injisert med GEP
lowABCB5- celler som genereres relativt små svulster og krevde lengre latenstid (12 uker) (figur 4A og B).
(A) nakne mus injisert subkutant med GEP
highABCB5 + og GEP
lowABCB5- celler etter 8 uker. Høyre panel viser subkutane svulster avledet fra 2,5 × 10
5 GEP
highABCB5 + og 1 x 10
6 GEP
lowABCB5- celler i uke 16. (B) tumorigenitet av GEP
highABCB5 + og GEP
lowABCB5- celler.
