Abstract
Selv om en økt grad av prostata-spesifikt antigen kan være en indikasjon for prostatakreft, andre grunner ofte føre til en høy grad av falske positive resultater. Derfor kan en ekstra serologisk screening av autoantistoffer i pasientenes sera bedre deteksjon av prostatakreft. Vi utførte protein makromatrise screening med serum fra 49 prostatakreftpasienter, 70 pasienter med benign prostatahyperplasi og 28 friske kontroller og sammenlignet den autoimmune responsen i disse gruppene. Vi var i stand til å skille prostatakreftpasienter fra normale kontroller med en nøyaktighet på 83,2%, pasienter med benign prostatahyperplasi fra normale kontroller med en nøyaktighet på 86,0% og prostatakreftpasienter fra pasienter med benign prostatahyperplasi med en nøyaktighet på 70,3%. Ved å kombinere seroreactivity mønster med en PSA-nivå på over 4,0 ng /ml denne klassifiseringen kan forbedres med en nøyaktighet på 84,1%. For utvalgte proteiner kunne vi bekrefte differensial uttrykk ved å bruke Luminex på 84 prøver. Vi gir en minimal invasiv serologisk metode for å redusere falske positive resultater i påvisning av prostatakreft og i henhold til PSA screening for å skille menn med prostatakreft fra menn med benign prostatahyperplasi
Citation. Leid P, Keller A, Milchram L, Harz C, Hart M, Werth A, et al. (2015) Kombinasjon av autoantistoffer Signatur med PSA nivå Aktiverer en meget nøyaktig blodbaserte Differensiering av prostatakreftpasienter fra pasienter med benign prostatahyperplasi. PLoS ONE 10 (6): e0128235. doi: 10,1371 /journal.pone.0128235
Academic Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: 17 juni 2014; Godkjent: 24 april 2015; Publisert: 03.06.2015
Copyright: © 2015 Leidinger et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de mest dødelige kreftformer hos menn over hele verden og den nest hyppigste kreftrelaterte dødsårsaken i USA. I 2012 ble prostatakreft estimert til å utgjøre mer enn 417.000 nye tilfeller og 92.000 kreftrelaterte dødsfall i Europa [1]. Stort sett, er mer enn to tredjedeler av all prostatakreft diagnostisert hos menn i alderen 65 år og eldre. [2] Prostatakreft er ofte preget av en gradvis utvikling og fremgang. [3] Ifølge histologiske mønstre av carcinoma celler prostata kreft fremgang er gradert av Gleason score. godt differensiert carcinoma celler (Gleason score 2-4), moderat differensierte carcinoma celler (Gleason score 5-7), og dårlig differensierte carcinoma celler (Gleason score 8-10) [4] Prostatakreft pasienter med Gleason score 8-10 kjøre en mer enn tre ganger høyere risiko for å dø av prostatakreft i løpet av 10 år enn pasienter med Gleason scorer 2-4 (8,3%). [5] Ja, er sykdommen kureres når det blir tidlig oppdaget . [2]
om lag to tredjedeler av amerikanske menn i alderen 50 år og eldre er jevnlig eller minst en gang-screenet for prostatakreft. [6] Digital rektal undersøkelse (DRE), og prostata-spesifikt antigen (PSA) screening har blitt godt etablerte metoder i prostata kreft diagnose. Imidlertid krever DRE lang erfaring i diagnose av kreft. Videre er DRE ikke et følsomt verktøy for tidlig sykdom. Den oppdager ofte kreft i sene stadier. [7]
PSA, en serin protease, er et organ bestemt molekyl som produseres av prostata epitel. PSA tester innført i 1980 gir mulighet til å oppdage kreft uten en positiv DRE resultat. Ifølge US Food and Drug Administration, som tillot PSA-testing som diagnostisk verktøy i 1994 en PSA-nivå større enn 4 ng /ml regnes som en kritisk verdi. En PSA nivå mindre enn 4 ng /ml tilsvarer normalområdet. Ptil kan oppdages enten som «gratis» (fritt PSA) eller «bundet» (PSA-ACT) form i pasienters serum. [8] Stenman og medarbeidere viste at menn med et høyt nivå av bundet PSA kjøre en høyere risiko for lidelse fra prostatakreft, mens nivået av fritt PSA viste seg å være lavere i prostatakreftpasienter enn hos menn med benign prostatahyperplasi. [9] Partin et al. var i stand til å oppdage prostatakreft med en sensitivitet på 95% og en spesifisitet på 20% av en gratis PSA-screening. [10] Selv om PSA screenings redusere dødeligheten av prostatakreftpasienter, er screening metoden ineffektiv og fører til begrensninger som ofte resultere i en høy rate av falske positive resultater etterfulgt av unødige prostatabiopsier [11-13]. Videre er eldre menn vanligvis har et høyere PSA-nivå som ikke svarer til noen prostata sykdom. [14] Høy PSA-nivåer er også påvises i pasienter som lider av benign prostatahyperplasi. [15] dermed ytterligere screeningsmetoder med høyere virkningsgrad for kreft er nødvendig.
Biomarkører har utviklet seg til et nødvendig klinisk verktøy. Spesielt kreftmarkører må oppfylle flere kriterier. De må ha en høy sensitivitet og spesifisitet, være lett å oppdage, økonomisk, og i betydelig grad uttrykt. Gjeldende studier viste potensialet i autoantistoff screening i ulike typer kreft, for eksempel, lungekreft, brystkreft, eggstokkreft tumor og meningeom. [16-19] autoantistoffer avsløre muligheten for tidlig oppdagelse og påfølgende behandling. Utbruddet av autoantistoff gir også en mer detaljert innblikk i molekylære prosesser i tidlig sykdomsutvikling. Vi har nylig beskrevet en målemetode i blodet ved hjelp av autoantistoffer for å identifisere lungekreft med en følsomhet på 97,9% og en spesifisitet på 97,0%. [20] Videre Wang og medarbeidere etablert en fag-protein microarray for å identifisere autoantistoffer i prostata kreft. [ ,,,0],21] i sin studie, de oppdage prostatakreft med en spesifisitet på 88,2% og en sensitivitet på 81,6%. Faktisk studien også oppdaget flere proteiner med mindre homologi til kjente proteiner.
I denne studien, beskriver vi en protein makromatrise screening for å påvise antistoffer i prostatakreft patients`sera. Totalt analyserte vi 136 blodprøver: 48 prøver av prostatakreftpasienter, 60 prøver av benign prostatahyperplasi, og 28 blodprøver av friske individer. Vi viser at screening tillater diskriminering av sera av prostata kreftpasienter og kontroller. Vi viser også at immunogene antigener kan være nyttig å skille prostatakreftpasienter fra benign prostatahyperplasi pasienter. I tillegg kan pasienter som lider av benign prostatahyperplasi skilles fra kontrollene. Videre har vi fokusert på følgende spørsmål: Kan kombinasjonen av PSA og autoantistoff testing forbedre følsomheten og spesifisiteten for diagnostisering av prostatakreft
PSA-testing som et enkelt diagnostisk metode fører ofte til falske positive resultater. Ny biomarkør kan gi en mulighet til å forbedre følsomheten og spesifisiteten for prostatakreft. Spesifikke autoantistoff screening sammen med PSA-test kan være et nyttig diagnostisk verktøy for å oppdage prostatakreft på et tidlig stadium, og for å redusere prostatakreft relatert dødelighet. Videre kan identifisering av nye immunogene antigener være et første skritt mot utviklingen av nye behandlingsformer.
Materialer og metoder
studiepopulasjonen
Blodprøver av prostatakreftpasienter og pasienter med benign prostatahyperplasi ble hentet fra Department of Urology, Saarland universitetssykehus. Blodprøver fra friske donorer ble innhentet fra Institutt for Hemostaseology og transfusjonsmedisin, Saarland universitetssykehus. Serum ble fremstilt fra serum monovettes og lagret i 2 ml porsjoner ved -70 ° C. Alle prøvene ble oppnådd med pasienters skriftlig informert samtykke før deltakelse. Studien inkludert samtykke prosedyren ble godkjent av den lokale etikkutvalg (Re.-No. 3755). I alt ble 147 sera analysert, som stammer fra 49 prostatakreft (PCA) pasienter, 70 benign prostatahyperplasi (BPH) pasienter og 28 friske mannlige frivillige. Detaljert informasjon om alle pasienter og friske personer er gitt i tabell 1.
Protein makromatrise screening
Vi avskjermet high-density protein macroarrays inneholder 38 016
E
.
coli
uttrykte proteiner av hex1 (human fosterets hjerne cDNA uttrykk) bibliotek med bassenger av 150 sera fra pasienter med ulike kreft og ikke-kreftsykdommer, inkludert to bassenger av PCa sera (5 sera per pool) og ett basseng av 5 BPH sera. [22] totalt 1,827 kloner som var positive for autoantistoffer i minst ett serum, ble valgt ut og sett i duplikater på undergruppen filtre. Disse sub-macroarrays ble screenet med 49 PCa, 70 BPH og 28 normalt serum (se figur S1).
I korte trekk, macroarrays ble vasket to ganger i TBSTT (TBS, 0,05% Tween 20, 0,5% Triton X- -100) og fire ganger i TBS. Etter blokkering med 3% ikke-fettholdig tørrmelk i TBST (TBS, 0,05% Tween 20), ble macroarrays inkubert over natten med fortynnet serum (1: 1000). Etter inkubering ble sera lagret for en andre runde med inkubasjon. De macroarrays ble utsatt for tre vasketrinn med TBST, fulgt av inkubering med 70 ° C strippeoppløsning. Etterpå macroarrays ble vasket to ganger i TBST og fire ganger i TBS. Etter inkubasjon med blokkeringsløsning macroarrays ble utsatt for den andre runde av serum inkubasjon. Macroarrays ble vasket tre ganger i TBST og inkubert med sekundært antistoff (kanin-anti-humant IgG, IgA, IgM-Cy5 (H + L), Dianova, 1: 1000). Til slutt, macroarrays ble vasket fire ganger i TBST, to ganger i TBS og tørket over natten. Signaler ble oppdaget av scanning med Typhoon 9410 skanner (GE Healthcare).
Bildeanalyse og statistikk
Spot intensitetsverdier ble beregnet ved Arcadia, en bildeanalyse programvare som vi utviklet spesielt for protein rekke evaluering [20]. I korte trekk, ble bildet av makromatrise delt i subgrids. Disse subgrids ble videre delt i spot områder som inneholder ett protein spot. Til slutt, ble intensiteten av hver flekk beregnet som middelverdi av alle bildeelementer i det respektive proteinet sted.
Vi utførte standard quantile normalisering for å minimalisere rekke-til-rekke variasjoner. Spesielt for funksjoner på kanten av tabellen vi observert litt minkende kvalitet. De respektive funksjoner kunne imidlertid potensielt skjevhet analysen. Dermed har respektive stedene er merket som ikke er tilgjengelige. Neste, ekskluderte vi 169 protein flekker som var fraværende på mer enn 10 analyserte macroarrays. De resterende 1658 kloner ble brukt til klassifikasjoner av en lineær Support Vector Machine (SVM).
Til sammen 20 repetisjoner av en standard 10-fold kryssvalidering ble utført og bety sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet for de fire klassifisering oppgavene ble beregnet. Som et mål på informasjonsinnholdet i enkle antigener for deres evne til å skille serum fra to forskjellige grupper arealet under mottager-operator-karakteristikk-kurve (ROC) verdier (AUC) ble beregnet. ROC-kurven viser spesifisitet som funksjon av 1-følsomhet. For hvert antigen, ble alle normaliserte intensitetsverdiene for alle sera anvendt som terskler for å diskriminere pasientserum fra kontrollene. For alle disse tersklene, ble pasientsera med intensitet verdi over terskelen anses som sanne positive (TP), pasientsera med intensitet verdi under terskelen som falske negative (FN). Følgelig ble kontrollsera med intensitet verdi under terskelen betraktet som sant negativ (TN), kontrollsera med intensitet verdi over terskelen som falske positive (FP). Deretter følsomhet (TP /(TP + FN)) og spesifisitet (TN /(TN + FP)) av alle terskler ble anvendt for å beregne ROC-kurve og AUC-verdien av det betraktede antigen. Hvis intensitetsverdiene av det betraktede antigen i pasientsera er høyere enn i kontrollsera, AUC-verdier mellom 0 og 0,5. AUC-verdier i området 0,5 til 1 her overfører til en høyere midlere intensitet av antigenet i kontrollsera sammenlignet med pasientsera. Vi vurderte antigener med AUC-verdier under 0,3 eller over 0,7 som informativ for den gitte klassifisering. Til slutt, beregnet vi frekvensen av seroreactivity mot antigenene i de vurderte grupper ved hjelp av en flekk intensitetsgrense på 50 for positiv seroreactivity. Proteinmakromatrise data ble avsatt i offentlig tilgjengelig database Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/hjemmeside, GSE67068).
Validering
for å validere autoantistoffer mot immunogene kloner, vi kjøpte respektive kloner fra Kilde Bioscience, dvs. D02594, E19574, L16556, A22594, og C11549. Innskudd ble sekvensert fra 5 «og 3» ender for å bekrefte identiteten og lengden av de representerte antigener. Sekvensdata viste at klonen D02594 var en hybrid av de to proteinene YBX1 og PDP1, som representerer sin 5 «ende den første 275aa av YBX1 og på sitt 3’end siste 91aa (starter på aa446) av PDP1 med en ukjent linker sekvens imellom. Dette proteinet ble utelukket fra videre analyse. De 4 andre kloner ble bekreftet å inneholde sekvenser av RPS27A, RPL15, DDX54 og RPL7. For å bestemme tilstedeværelse av autoantistoffer mot disse antigener, brukte vi Xmap teknologi (Luminex, Austin, TX, USA). Kort sagt, ble hans-merkede antigener uttrykt i
E
.
coli
henhold til leverandørens anbefalinger, renset ved hjelp av Ni-NTA agarose perler og koblet til magnetiske mikrokuler i henhold til produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner. Femti pl av en beadmix inneholdende 1000 koplet mikrokuler pr analysert protein ble inkubert med sera fra pasienter og kontroller (1: 400 fortynnet i 100 mM Tris-HCl pH 7,0, 1% BSA 300 mM, NaCl 0,1% Tween-20) i 2 timer ved RT på en ristemaskin. Bundet autoantistoffer ble oppdaget ved hjelp av en 1: 1 blanding av 2,5 ug /ml R-Phyco AffiniPure F (ab «) 2 Frag Gt Anti-Hmn IgG [Fcy] (Jackson Immunoresearch Art.nr. 109-116-098) og 2,5 ug /ml R-Phyco AffiniPure F (ab «) 2 Frag Gt Anti-Hmn IgG [F (ab») 2] (Jackson Immunoresearch Art.nr. 109-116-097). Etter 1 time inkubering med sekundære antistoffer, ble kulene vasket tre ganger med PBS-Tween 0,05% og målt med Luminex Flexmap 3D. Foruten standard hypotesetester som t-test eller analyse av variansen, har AUC beregnet. Til slutt ble målingene korrelert til Gleason score og PSA nivåer.
Resultater
Totalt 1,827 cDNA kloner ble screenet med 147 serumprøver, inkludert 49 PCa sera, 70 BPH sera, og 28 sera fra friske menn (tabell 1). Ut av disse sera vi valgt en alders matchet undergruppe som inkluderte 44 PCa og BPH sera, hver med en median alder på 67 år. I tillegg sammenlignet vi undergrupper av 36 sera fra PCA pasienter med PSA-nivå 4 ng /ml og 33 sera av BPH pasienter også med PSA-nivå 4 ng /ml.
Frekvens av immunogene kloner
For å minimere matrise-til-matrise variasjoner i 147 analyserte macroarrays ble normalisert ved hjelp av standard quantile normalisering. Vi velger en flekk intensitet terskel på 50 for bestemmelse av positive seroreactivity. Vi utelatt alle cDNA-kloner som viste mangel på seroreactivity på mer enn 10 av de 147 rekker. Av de gjenværende 1658 cDNA-kloner, 1612 kloner reagerte med minst en PCa serum. Hyppigheten av seroreactivity varierte fra 2,3% for de cDNA-klon reagerte minste med PCA sera, til 97,7% for de mest reaktive cDNA-klon. Vi fant 1613 kloner som reagerte med i det minste en BPH serum. Hyppigheten av seroreactivity varierte fra 2,3% til 95,5%. Interessant, 1,533 kloner reagerte med normalt serum (frekvenser fra 3,6% til 96,4%. En sammenligning av de ovenfor nevnte klonene viste en overlapping på 1,485 kloner mellom PCa, BPH og normalt serum. Disse kloner kan være såkalte naturlige autoantistoffer som er til stede i hvert serum fra friske personer på bemerkelsesverdig konstant nivå og preget av minimal individuelle kvantitative variasjoner. [23] den Venn-diagram i figur 1 viser fordelingen av de reager kloner.
Venn-diagram viser fordelingen av 1658 å reagere kloner for de tre serum gruppene (PCA, BPH, normal). Mesteparten av klonene er reaktive i alle de tre gruppene, mens et lite antall kloner er bare reaktivt i hver enkelt gruppe.
Som de fleste de analyserte antigenene var reaktive i sera av PCA pasienter, BPH pasienter, så vel som friske kontroll de klonene syntes ikke å være meget meningsfylt for ytterligere nærmer seg. Derfor fokuserte vi på de kloner som bare reagerte med sera fra en av de tre serum grupper , dvs. enten PCa sera, eller BPH sera eller normal sera. Her har vi funnet ti kloner bare reaktivt med i det minste en PCa serum, 12 kloner som bare er reaktiv med i det minste en BPH serum, og 5 kloner bare reaktivt med i det minste ett normalt serum. Når det gjelder de seroreactivity frekvenser for hver serumgruppe resultatene var noe skuffende på det meste bare syv av 49 PCa sera omsettes med PCA-spesifikke antigener, på det meste bare syv av de 70 BPH sera omsettes med BPH spesifikke antigener, og bare en normalt serum omsettes med de 5 spesifikke antigener som kun finnes i normalt serum. Derfor ser det ut til at disse antigenene kan reflektere individuelle variasjoner.
Informasjon innhold av immunogene kloner
Som vurderer kun de seroreactivity frekvenser pr serum gruppen synes ikke å være et godt mål, vi beregnes for hver cDNA klone området under mottageroperatøren egenskaper kurven (AUC), som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. AUC er et mål for den informasjonsinnholdet i hver enkelt antigen for separasjon av to forskjellige serumgrupper fra hverandre. Her ble det klart, at kloner som reagerer med mer enn ett serum gruppe kan imidlertid ha en høy informasjonsinnhold for visse separasjoner.
AUC-verdiene av 1,658 analyserte klonene, inkludert 461 i-ramme kloner, er oppsummert i tabell 2. Vi rangert de cDNA-kloner i henhold til informasjonen innholdet de har bidratt til de forskjellige klassifiserings oppgaver. Kloner med en AUC-verdien 0.7 eller 0.3 ble ansett for å være svært lærerikt for en gitt klassifisering oppgave.
For diskriminering av PCa og normal sera, 199 kloner (12%) ble vurdert å være informativ, inkludert 52 i-frame kloner. Blant de informative kloner, 78 kloner viste AUC 0.7, inkludert 32 i-frame kloner og 121 kloner viste AUC 0,3, inkludert 20 i-ramme kloner. Den ut-av-ramme klon D20552 med en sekvenshomologi til hjernen kreatinkinase (CKB) viste den laveste AUC-verdien (AUC = 0,142) for diskriminering av PCa og normalt serum. Denne klonen ble også rikt for diskriminering av BPH og normalt serum (AUC = 0,190), men ikke for diskriminering av PCa og BPH sera (AUC = 0,466). Den out-of-frame klone E03526 med sekvenshomologi dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 (DDAH1) viste den høyeste AUC-verdien (AUC = 0,811). Igjen, denne klonen ble også rikt for diskriminering av BPH og normalt serum (AUC = 0,760), men ikke for diskriminering av PCa og BPH sera (AUC = 0,558).
Klonen D02594 med sekvenshomologi til nuklease følsomt element bindende protein 1 (YBX1) var i leseramme klon med den laveste AUC-verdien (AUC = 0,209) og klonen A06579 med sekvenshomologi til protein (peptidyl-prolyl cis /trans-isomerase) (PIN4) var i leseramme klon med den høyeste AUC-verdien (AUC = 0,806).
for diskriminering av BPH og normale sera, 110 kloner (6,63%), inkludert 24 i-ramme-kloner ble ansett for å være informativt. Blant dem, 39 kloner viste AUC 0.7, inkludert 5 i-frame kloner og 71 kloner viste AUC 0,3, inkludert 6 i-ramme kloner. Den ut-av-ramme klon C18596 viste den laveste AUC-verdien (AUC = 0,144) for diskriminering av BPH og normalt serum, dvs. denne klon viste en sterkere immunrespons med sera fra pasienter med BPH sammenlignet med normalt serum. Denne klonen ble også rikt for diskriminering av PCa og normalt serum (AUC = 0,236) og hadde en sterkere immunrespons i sera av PCA pasienter sammenlignet med normale sera. Men for diskriminering av BPH sera og PCa sera klone C18596 nådde bare en AUC verdi på 0,528 og hadde derfor mindre informasjonsinnhold for dette skillet. Den ut-av-ramme klon E13519 med en sekvenshomologi med Oksydase (cytokrom c) sammenstillingen 1-lignende (OXA1L) viste den høyeste AUC-verdien (AUC = 0,782) som er spesifikke for diskriminering av BPH og normale sera, dvs. høyere immunogenisitet i normal sera enn i BPH sera. Men denne klonen hadde ingen informasjonsinnhold for separering av PCa fra normalt serum (AUC = 0,646) og for separering av BPH fra PCa (AUC = 0,446). For diskriminering av BPH og normale sera klonen E19574 med sekvenshomologi til pseudogen lik ubiquitin og ribosomalt protein S27a forstadium ble identifisert som den mest informative i leseramme klon med AUC 0,3, dvs. større immunrespons i sera fra pasienter med BPH enn i normalt serum (AUC = 0,175). Den i leseramme klon L16556 med sekvenshomologi til ribosomalt protein L15 (RPL15) ble identifisert som den mest informative i leseramme klon med AUC 0,7, dvs. høyere immunogenisitet i normal serum sammenlignet med sera av BPH pasienter (AUC = 0,773).
Når man sammenligner PCa og BPH sera, 99,3% (1646 kloner) av immunogene klonene viste AUC-verdier mellom 0,3 og 0.7, noe som betyr at de er ikke-informative. Bare 18 informative kloner (1,09%), inkludert fire i-ramme kloner, forble. Blant dem, 5 kloner viste AUC 0,3 og 13 kloner viste AUC 0,7. Den ut-av-ramme klon N22510 med en sekvens homologi til MARCKS liknende 1 (MARCKSL1) viste den høyeste AUC-verdien (AUC = 0,773) for diskriminering av PCa og BPH. Klone A22594 viste den laveste AUC-verdien (AUC = 0,266). Begge kloner ble også rikt for diskriminering av BPH og normale sera, men ikke for PCa sera lignet med normalt serum. Sistnevnte klon A22594 var i leseramme og derved klonen med lavest AUC. Klonen C11549 med sekvenshomologi til 60S ribosomalt protein L7 var i leseramme klon med den høyeste AUC-verdien (AUC = 0,710).
For diskriminering av sera fra pasienter med forskjellige sykdommer i det samme organ, det vil si , PCA eller BPH, tok vi også pre-operative PSA verdi i betraktning. Derfor valgte vi 36 PCa sera og 33 BPH sera med PSA ≥ 4,0 ng /ml fra den første studiepopulasjonen. Overlapp til før nevnte alders matchet serum kohorten var 32 PCa og 17 BPH sera. Følgende klassifisering avdekket 166 informative klonene, inkludert 42 i-ramme kloner. Blant de informative kloner, 81 kloner viste AUC 0.3, inkludert 28 i-frame kloner og 91 kloner viste AUC 0,7, inkludert 14 i-ramme kloner. I diskriminerings PCa versus BPH, hver med PSA ≥ 4,0 ng /ml, den ut-av-ramme kloner N12603 og N22510 ga de beste AUC-verdiene for 0,174 og 0,838, respektivt. Clone N12603 har sekvenshomologi kolinerg reseptor nikotin alfa (CHRNA2) og klone N22510 til MARCKS lignende 1 (MARCKSL1). Interessant, den sistnevnte klonen N22510 var også klonen med den høyeste AUC-verdien for separering PCa versus BPH, uavhengig av PSA-nivå.
kloner A18602 (sekvenshomologi til ribosomalt protein S2 (RPS2)) og J04520 (sekvens homologi til Y boks bindende protein 1 (YBX1)) var de i ramme kloner med de beste AUC verdier av 0,188 og 0,818, henholdsvis.
Klassifisering resultater
Som beskrevet i Materialer og metoder delen, ble klassifisering utført av en lineær Support Vector Machine (SVM). Her ble 20 repetisjoner av en standard 10-fold kryssvalidering utført og mener sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet for fire klasse oppgaver ble beregnet. Alle klassifiserings Resultatene er detaljert i tabell 3. De beste resultater ble oppnådd ved klassifisering BPH i forhold til normal med en nøyaktighet på 86%. Klassifiseringen PCa versus normal ga en nøyaktighet på 83,2%. Det verste klassifisering nøyaktighet på 70,3% ble oppnådd for alders matchet prøvene PCA versus BPH. Men, med tanke på PSA nivå av 4,0 klart forbedret klassifiseringsresultatene. Her fikk vi en nøyaktighet på 84,1%.
Validering
Siden high-throughput teknologier ofte føre til falske positive biomarkør resultater, validering av uavhengige teknologi er avgjørende. Fra forrige analyserer vi plukket fem kloner: D02594, E19574, L16556, A22594, og C11549. Disse tilsvarer proteiner RPS27A, RPL15, DDX54 og RPL7. Siden re-sekvensering viste at klonen D02594 var en hybrid av to proteiner YBX1 og PDP1, det ble utelatt fra den statistiske analysen. Klonene ble screenet med en kohort av 84 personer, inkludert 27 PCA pasienter, 30 BPH pasienter og 27 kontroller. En analyse av varians viste betydelige resultater for DDX54 (p = 0,03) og RPL7 (p = 0,04). En tredje klone, RPL15, litt overskredet betydningen terskel (p = 0,074).
I screeningforsøk, DDX54 viste en økt median seroreactivity i kontrollsera (44,9) og PCA pasienter (44,6) sammenlignet med BPH ( 41.2) pasienter. Denne høyere reaktivitet i kontroller i forhold til BPH pasienter har blitt bekreftet av validerings analyse (figur 2A). For det andre protein, RPL7, de første resultatene økte autoantistoffer i BPH pasienter (44,8) sammenlignet med PCA pasienter (39,0). Denne trenden ble også observert i valideringsforsøk (figur 2B). Selv om litt ikke statistisk signifikant, ble den generelle trenden med høyere seroreactivity mot RPL15 i normale prøver i forhold til både PCa og BPH pasienter med hell gjengitt i validering (Fig 2C). Ved å korrelere protein uttrykk til PSA nivåer vi ikke observert signifikante resultater.
Box-Whisker tomter for reaktivitet mot DDX54 (A), RPL7 (B) og RPL15 (C) med serum fra pasienter med benign prostata (BPH), prostata carcinom (PCA) og friske kontroller (N) i protein makromatrise (venstre panel) og Luminex validering (høyre panel). For hver gruppe av boksene angir den 2. og 3. kvartil av seroreactivity, hårkrystallene viser minimums- og maksimumsverdi. De horisontale svarte linjene viser medianen seroreactivity i gruppen. Lignende seroreactivity trender er indikert med hakeparenteser.
Diskusjoner
Det er vanlig enighet om at PSA screening har redusert dødeligheten av PCA pasienter i årevis. Likevel er PSA-testing fortsatt et omstridt tema for det fører ofte til falske resultater, overdiagnostikk og falsk terapi går sammen med høye kostnader. [24] Identifisering av ytterligere biomarkører, f.eks PCA3, GSTP1, AMACR, eller mirnas, avslører mulighet til å forbedre oppdage prostatakreft. [25] i tillegg nye biomarkører kan forbedre overvåking og gi et mer detaljert bilde til kreft fremgang og utvikling.
i vår studie presenterer vi en kombinasjon av autoantistoff signatur med PSA-nivå. Vi vist et sett av 1,827 cDNA-kloner med 49 PCa sera, 70 BPH sera, og 28 sera fra friske individer med protein makromatrise analyse. I tillegg sammenlignet vi seroactivity av PCA pasienter, BPH pasienter og kontroller ved å beregne AUC-verdier. AUC 0,3 og 0.7 ble ansett som informativ. Totalt har vi identifisert 199 informative kloner (inkludert 52 i-frame-kloner) for klassifisering av PCa versus normale, 110 informative kloner (inkludert 24 i-frame-kloner) for klassifisering av BPH versus normal, og bare 18 informative kloner (inkludert 4 i-frame-kloner) for klassifisering av PCa versus BPH. Vurderer bare PCa og BPH sera med PSA nivåer 4,0 ng /ml vi har oppdaget 166 kloner (inkludert 42 i-frame-kloner) for klassifisering av PCa versus BPH.
Vi var i stand til å skille sera fra PCA pasienter og kontroller med en nøyaktighet på 83,2%, en sensitivitet på 70,2%, og en spesifisitet på 91,5%. BPH sera og normalt serum ble separert med en nøyaktighet på 86,0%, en sensitivitet på 73,9%, og en spesifisitet på 93,6%. Det verste klassifisering nøyaktighet med 70,3% ble oppnådd for PCa versus BPH. Interessant, forbedrer klassifiseringen resultat etter tatt PSA nivå av 4,0 ng /ml i betraktning. Her separeres vi PCa sera og sera BPH med en nøyaktighet på 84,1%, en sensitivitet på 84,5%, og en spesifisitet på 83,8%. Dette er viktig fordi denne metoden gjør det mulig å skille ondartet sykdom fra godartet sykdom.
Våre resultater er basert på konkrete reaksjoner i immunsystemet. Foruten PSA og andre biomarkører kreftassosierte antigener kan være veldig spesifikk markør og egnet som diagnostisk verktøy. Immunsystemet gjenkjenner kreftceller ved å produsere spesifikke antistoffer mot disse cancerassosierte antigener. Autoantistoffer lett kan oppdages i patients`sera. Dessuten har de en lang halveringstid og kan påvises ved lave kostnader. [26] De identifiserte antigener påvist i sera fra pasienter og PCA BPH pasienter kan tjene som biomarkører eller som mål for fremtidig behandling av pasienter med forskjellige prostatalidelser. Antigenene vi funnet kan spille en funksjonell rolle i utviklingen av prostatakreft. Totalt fant vi 12 fag-peptid kloner med homologi til kjente proteiner. Kloner med homologi til CKB, DDAH1, YBX1, PIN4, OXA1L, pseudogen lik ubiquitin og ribosomalt protein S27a forløper, og RPL15 var informativt for diskriminering av normal sera og PCa og BPH, henholdsvis. Kloner med homologi til 60S ribosomalt protein L7, og MARCKS1 var informativt for diskriminering av PCa sera og BPH sera. Kloner med homologi til CHRNA2, RPS2, YBX1, og MARCKS1 var informativt for diskriminering av PCa sera og BPH sera tatt PSA-nivå i betraktning. Interessant, fag-peptid-klone med en homolog sekvens til MARCKSL1 var svært lærerikt for klassifisering av PCa versus BPH med og uten tanke på PSA-nivå. MARCKSL1 er et medlem av MARCKS familien, en gruppe proteiner som er involvert i den kalmodulin (CaM) signalveien, protein kinase C (PKC) signalveien, og i reguleringen av aktin cytoskjelettet. [27] MARCKS kan tilknyttes
