Abstract
Berberine har blitt identifisert med anti-proliferative effekter på ulike kreftceller. Mange forskere har prøvd å belyse de anti-kreft mekanismer berberine basert på forskjellig uttrykt gener. Men kanskje forskjellig alternativ spleising gener indusert av berberine også bidra til dens farmakologiske virkninger og har ikke blitt rapportert ennå. Videre er den potensielle funksjonell kryss talende mellom de to sett av gener som fortjener videre utforsking. I denne studien ble RNA-seq teknologi brukes til å oppdage de differensielt uttrykte gener og forskjellig alternative spleisede gener i BEL-7402 kreftceller indusert av berberine. Funksjonell anrikning-analyse indikerte at disse gener ble hovedsakelig anriket på p53 og cellesyklussignalveien. I tillegg ble det statistisk bevist at de to sett av gener ble lokalt ko-anriket langs kromosomet, som er nært forbundet med hverandre basert på protein-protein interaksjon og funksjonelt lik med Gene Ontologi treet. Disse resultatene antydet at de to sett av gener som reguleres av berberin kan være funksjonelt kryss omtalte og i fellesskap bidrar til dens cellesyklus stansende virkning. Det har gitt nye ledetråder for videre forskning på de farmakologiske mekanismer berberine samt andre botaniske stoffer
Citation. Sheng Z, Sun Y, Zhu R, Jiao N, Tang K, Cao Z, et al . (2015) Funksjonell Cross-Talking mellom forskjellig uttrykt og alternativt spleisede gener i human lever kreft celler behandlet med Berberine. PLoS ONE 10 (11): e0143742. doi: 10,1371 /journal.pone.0143742
Redaktør: Emanuele Buratti, International Centre for genteknologi og bioteknologi, ITALIA
mottatt: May 14, 2015; Godkjent: 09.11.2015; Publisert: 25.11.2015
Copyright: © 2015 Sheng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National High Technology Research and Development Program ( «863» Program) Kina (2012AA020405), og finansiering av departementet Helse (2012ZX10005001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : DASG, Forskjellig Alternative spleiset gener mellom to prøver; °, uttrykt forskjellig gener mellom to prøver
Innledning
Alternativ spleising er et tett regulert prosess i løpet av genuttrykk som kan produsere ulike former av et protein fra det samme genet. Videre har det blitt bevist at alternativ spleising kan også bestemme bindingsegenskaper, intracellulær lokalisering, enzymatisk aktivitet, proteinstabilitet og posttranslational modifikasjoner av et stort antall proteiner [1]. I de senere år mer og mer farmakologiske forskere har funnet at små molekylære stoffer kan utøve deres farmakologiske effekter ikke bare gjennom regulerer transkripsjonsnivåer av gener, men også ved endring av genet alternativ spleising [2].
Berberine, en isokinolin kvaternært alkaloid isolert fra Berberis arter [3], har et bredt spekter av farmakologiske effekter, slik som anti-mikrobe, anti-diabetes og anti-inflammasjon [4]. Klinisk, har det vært brukt til å behandle en rekke lidelser, inkludert koronarsykdom, diabetes, ikke-alkoholisk fettleversykdom, hyperlipidemi, metabolsk syndrom, overvekt og polycystisk ovariesyndrom (https://www.clinicaltrials.gov/). Nylig har akkumulere studier har funnet at kines besatt også potent anticancer aktivitet, med få eller minimale uønskede toksiske effekter [5, 6]. Derfor har mange forskere forsøkt å belyse de anti-kreft mekanismer berberine basert på genet differensial uttrykk. For eksempel er det rapportert at berberin kunne indusere apoptose i HepG2 celler gjennom AMPK-mediert reaksjonsvei mitokondriell ved å øke forholdet mellom Bax /Bcl-2 [7]. I vår forrige undersøkelse, har vi også funnet ut at berberine kan indusere G1 cellesyklus arrest i BEL-7402 celler delvis via forstyrre samspillet av calmodulin med CaMKII og blokkerer påfølgende p27 protein degradering. [8]
Selv om disse arbeidene har gitt noen grunnleggende kunnskap om anticancer mekanisme berberine, alternativ spleising i kreftceller etter behandlet med berberine har ikke blitt rapportert ennå. For det første har det vært antydet at mange antikreftmidler kan hemme veksten av kreftceller ved å endre gen alternativ spleising [9-11]. I tillegg er det rapportert at gentranskripsjon og alternativ spleising kan være fysisk og funksjonelt koplet [12, 13], for derved i fellesskap bidrar til de farmakologiske virkninger av disse stoffene. Derfor er det nødvendig å samtidig måle differensielt uttrykte gener (degs) og differensielt alternativt spleiset gener (DASGs) i kreftceller etter behandling med berberin og systematisk å undersøke hvorvidt det er noen form for funksjonell kryss snakker mellom disse to sett av gener .
for spørsmålet er nevnt ovenfor, senest neste generasjons sekvenseringsteknologi (RNA-seq) ble brukt for å oppnå transcriptomic profilering av BEL-7402 celler etter berberine behandling. Deretter de degs og DASGs indusert av berberine ble nøye registrert av en rekke verktøy for sekvensanalyse. Til slutt, den funksjonelle crosstalk mellom disse degs og DASGs ble statistisk analysert og deres mulige bidrag til anticancer effekten av berberine ble diskutert.
Materialer og metoder
Cell kultur
etablert human leverkreft cellelinje (BEL-7402, kat. nr .: TCHu_10) [8, 14, 15] ble kjøpt fra og deponert i cellen bank av instituttet for biokjemi og cellebiologi, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science (https://www.cellbank.org.cn/) og vennlig levert av Dr. Xuan Liu (Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, PRChina). Celler ble opprettholdt i en fuktet 37 ° C atmosfære inneholdende 5% CO
2 og dyrket i RPMI-1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM /L-glutamin, 50 enheter /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin. I denne studien, har vi slått sammen 3 ~ 5 biologiske gjentas inn i en RNA-seq eksperiment for å oppnå den samme mengde av total RNA-innhold. Mer spesifikt, ved celledyrking seksjon, kreftceller i 8 ~ 10 forskjellige petriskåler ble delt i to like grupper. Den ene gruppen ble brukt som berberine behandlede gruppen, den andre ble brukt som kontroll /ubehandlet gruppe.
RNA isolering
For utvinning av total RNA ble cellene sådd ut på 10-cm plater (Corning, Acton, MA, USA) i komplett medium i 12 timer. Deretter 50 mikrometer berberine (renhet ≥ 98%, Tauto Biotech, Shanghai, Kina, IC50 ifølge Ref. [8]) ble tilsatt, og igjen i kontakt i 24 timer. Etter dette ble cellene renset i PBS og lysert i TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Residual forurensende genomisk DNA ble fjernet fra total RNA brøk med Turbo DNA-free kit (Ambion, Austin, TX, USA). mRNA ble isolert fra DNA-fri total-RNA ved hjelp av Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Til slutt, for å få nok mengde mRNA innhold for sekvensering, ble de totale RNA prøver fra hver gruppe samlet sammen som en samleprøve.
transkriptomet sekvense
mRNA utvalg, bibliotek forberedelse og sekvensering ble utført ved Shanghai ceneter for Bioinformation Technology (SCBIT) på en Illumina Hiseq 2000 sekvense plattform i henhold til produsentens spesifikasjoner. Kort fortalt mRNA ble valgt ved hjelp av oligo (DT) prober og deretter fragmentert ved hjelp av toverdige kationer. cDNA ble syntetisert ved anvendelse av tilfeldige primere, modifisert og anriket for feste til Illumina strømningscellen. Vi sekvensert to 60-syklus 100 bp × 2 parvise end baner, genererer ~ 83100000 leser.
Les justering
Rå sekvensering leser ble trimmet ut Ns og lav kvalitet regioner (gjennomsnittlig basen kvalitet score i en 5-mer skyvevindu mindre enn 20, det vil si sekvensefeilrate ≤1%). Les-parene med minst 36 bp igjen i hver lese ble holdt som ren leser. Sekvensekvaliteten ble vurdert ved FastQC [16]. Deretter ren leser ble kartlagt til menneskelig referanse genom (Ensembl GRCh37.66 = hg19) bruker aligner Tophat [17] (versjon 2.0.6) med parametere (-r /-Indre-mate-distanse: 70, -g /-max -multihits: 1, -ingen-dekning-søk, -no-roman-junc, de andre som standard). Utgangene fra Tophat ble brukt som innganger for HTSeq [18] og AltAnalyze [19] for å utføre gen differensialuttrykk eller alternativ spleising analyse respektivt.
Differential gene expression analyse
degs (uttrykt forskjellig gener) refererer til de gener med betydelige endringer i deres uttrykk nivå. For det første ble antallet leser tilordnet til den genomiske region av hvert gen for hver prøve beregnet med HTSeq [18]. Deretter DESeq [20] ble brukt til å vurdere forskjellen i genekspresjon mellom forskjellige prøver. Til slutt, degs ble filtrert av følgende regler:. 1) den absolutte verdien av log2 [folde-change] var større enn 1. 2) p-verdien var mindre enn 0,05
Forskjellig gen alternativ spleising analyse
DASGs (Forskjellig alternative skjøtes gener) refererer til disse genene med ingen eller små variasjoner i sin helhet-genuttrykk nivå, men vesentlige endringer i deres ekson-bruk, spesielt de alternative eksoner (fig 1). Differensial skjøting analyse beskriver forskjellene i alternativ spleising nettstedbruk mellom to prøver, som er avgjørende for studier som involverer mekanismer for alternativ spleising og regulering, og i stand til å avdekke funksjonelle mangfold som er savnet av differensial genekspresjonsanalyser [21]. Dusinvis av tilgjengelige verktøy og pakker, for eksempel Cuffdiff2 [22], miso [23], DEXseq [24], DEGseq [25], DiffSplice [26], skjøting kompass [27], AltAnalyze [19] og etc., tok konseptuelt ulike tilnærminger som kan identifisere differensial spleising på nivå med isoformen /avskrift, ekson, eller begge deler. Imidlertid er valget av en egnet tilnærming for en undersøkelse er avhengig av den eksperimentelle objektiv og forventet resultat. Blant disse metodene og pakker, bare AltAnalyze gir et grafisk brukergrensesnitt, mens resten blir drevet på commend linjen. Dessuten gir AltAnalyze en praktisk arbeidsflyt for å trekke ut de betydelige alternativ spleising regulerings hendelser og deretter undersøke de potensielle biologiske konsekvensene av slike spleising hendelser og relaterte mekanismer i sammenheng med molekylære interaksjoner og bindingssteder [19]. Flere algoritmer er tilgjengelige i AltAnalyze å identifisere individuelle funksjoner (eksoner eller veikryss) eller gjensidige veikryss som er ulikt regulert i forhold til genuttrykk endringer. I dette arbeidet ble enkelt funksjon analyse (Skjøting Index, SI) utføres umiddelbart etter gjensidige koblingsanalyser (Analyse av skjøting av isoform Gjensidighet, ASPIRE) [28] på den samme listen over uttrykt funksjoner, som tillater oss å undersøke alternative eksoner spådd av par av gjensidige veikryss i tillegg til de spådd av en enkelt regulerte eksoner /veikryss (se AltAnalyze-Manual). Spleising indeksen er en måling av forskjellig spleising mellom to prøver. Eksoner med SI verdi større enn 1 betyr mer inkludering av exon i den modnet mRNA under skjøting prosessen i den behandlede prøve sammenlignet med kontrollprøven, mens de med SI verdi som er mindre enn 1 betyr mindre inkludering men mer hopper av ekson, og disse med sI verdi lik 1 betyr at det ikke er noen endring i bruken av exon.
A. Uttrykket eller alternativ spleising av DPM1 genet forble uendret etter berberine behandling. B. Skjøte mønster av NFKBIA gen forble uforandret etter berberin behandling som indikert ved spleising indeksen (SI) verdien av hver av sine eksoner. Med uttrykket av NFKBIA genet ble oppregulert ved mer enn 2-ganger etter berberin behandling (p 0,05) ettersom hver av sine eksoner ble overuttrykt. C. Skjøte mønster av RLIM genet ble endret ved berberin behandling som indikert ved SI verdien av exon 2 (SI 0,5) i løpet av RLIM genet. Men uttrykket av RLIM genet ikke endret seg vesentlig etter berberine behandling. Relativ ekspresjon, det relative ekspresjonsnivå av genet eller alle eksoner i forhold til kontrollprøven.
*, DEG;
#, DSAG.
Forskjellig alternativ spleising analyse ble utført med AltAnalyze med standard parametere. For det første var det tre kriterier for eksoner å utføre forskjellig genet alternativ spleising analyse: 1) Minst fem leser ble kartlagt til exon; 2) RPKM (Leser Per Kilo-base av ekson modell per million kartlagt leser) verdien av ekson var større enn 0,3; 3) uttrykket endring av det tilsvarende genet var mindre enn 2-ganger. Deretter ble to ekson-sentriske algoritmer brukes til å oppdage de forskjellig alternativ spleising eksoner: Skjøting Index (SI) og analyse av skjøting av isoform Gjensidighet (ASPIRE) [28]. SI verdi for hvert exon eller veikryss ble beregnet som nedenfor. Product: (1)
I hvilke,
RPKM product: (
exon
i
) og
RPKM plakater (
gen
) ble ekspresjonen verdien av den i-te ekson og genet respektivt. I SI-algoritmen, eksoner med SI 2 ganger ble kalt AS-exons_SI. I streber algoritme, eksoner med ΔI ble 0,2 kalt AS-exons_ASPIRE. Detaljene i disse to algoritmer har blitt beskrevet i AltAnalyze arbeidsflyten (https://www.altanalyze.org/). Bare overlappet AS-eksoner i begge algoritmer ble valgt for videre funksjonell analyse. Og de genene som inneholder disse eksoner ble kalt forskjellig alternative spleisede gener (DASG).
Gene Sett Funksjonelle Enrichment Analyse
Gene sett berikelse analyser ble utført for funksjonell annotering av de degs og DASGs separat. Funksjonell annotasjonsverktøy i David Bioinformatikk ressurser [29] ble brukt til å utføre disse analysene. De genet ontologi (GO) [30] biologiske prosess vilkårene eller Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) [31] trasé med anrikning p-verdi mindre enn 0,05 (modifisert Fishers eksakte test), og mer enn to gener ble ansett som vesentlig beriket funksjoner for videre analyse.
lokale co-berikelse analyse sammen kromosom sekvenser
for å teste om degs og DASGs viste lignende berikelse fordeling langs kromosomene, lokale co-berikelse analyse ble utført. For det første, en berikelse score (
ES
) ble beregnet for et gen innstilt på hvert kromosom band, som også ble vist som intensiteten av den region som vist i figur 2A [32]. Gitt genet satt
X
:
{x
en
,
x
2
,
… x
N
}
, kromosom bandet
B
:
{b
1
,
b
2
,
… b
M
}
, antall genene i hvert band
g
:
{g
en
,
g
2
,
… g
M
}
, deretter
ES
poengsum ble beregnet som følgende. product: (2)
A. Global intensitet tomt på posisjons berikelse for degs og DASGs. Hver celle representerer en kromosomal bånd og intensiteten av fargen er proporsjonal med den tilsvarende anrikning av degs eller DASGs i dette båndet, som er normalisert med både den totale mengde av gener i bandet, og antallet av enten degs eller DASGs. Hver kolonne representerer kromosomet inneholder alle band og farge, enten blå eller rød, i forkant av kolonnen skille klassen av gener fra degs og DASGs. B. Fiolinen tomten for posisjons co-berikelse score (avstand) mellom to gensettene. Kurven dekker gule regionen representerer avstanden distribusjon av to tilfeldig gensettene i samme størrelse på degs og DASGs hhv. En kortere avstand betyr en høyere co-berikelse av disse to genene bestemmer. Den rød diamant punktet refererer til avstanden mellom degs og DASGs
Deretter en
ES
scorer vektor
EX product::.
{ex
en
,
ex
2
,
… ex
M
}
ble fikk for gen set
X
over alle band i
B
. Tilsvarende en annen vektor
EY
:
{ey
en
,
ey
2
,
… ey
M
}
kunne fått et annet gen set
Y
. Endelig likheten (
LCE
) mellom de to fargebånd
X Hotell og
Y
ble målt som euklidske avstanden mellom dem. Product: (3)
Global nærhet i protein-protein interaksjon (PPI) nettverk
For å evaluere den topologiske nærhet mellom degs og DASGs i PPI nettverket, gjennomsnittlig korteste banelengde mellom dem ble brukt som mål. Gjennomsnitt korteste banelengden er et begrep i nettverkstopologi som er definert som det gjennomsnittlige antall trinn langs de korteste baner for alle mulige par av nettverksnodene, som er et mål på effektiviteten av informasjonen transport i nettet [33]. Dette tiltaket er også aktuelt på to-subnett problemer ved å beregne gjennomsnittlig veistrekningen for alle mulige par av noder fra disse to nettverk, x og y. (4) Hvor dis (i, j) er den korteste veien avstanden mellom
i
-te gen av delsett x og den j-te-genet av delsett y. I denne analysen ble bakgrunnen nettverk bygget med hele PPI data fra online database Humant protein Referanse Database (HPRD).
Funksjonell semantiske likheten på Gene ontologi (GO) treet
På treet av Gene ontologi, er gener kategorisert i ulike funksjonelle grupper navngitt som GO vilkår basert på de biologiske prosesser der de er involvert. Basert på grafen strukturen av GO, ble semantiske likheten mellom hvilke som helst to GO betingelser beregnet som beskrevet i Wang et.al [34] ved hjelp av GOSemSim pakke [35]. Da den semantiske likheten mellom to gensettene som degs og DASGs kan beregnes som gjennomsnittet av alle mulige par av GO vilkår som involverer gener i disse to genene bestemmer. Gitt to lister med GO vilkår,
gå
1 Hotell og
gå
2
involverer gener i to gensettene,
X Hotell og
Y
, den semantiske likheten
SemSim
ble definert som: (5) Hvor
N
GO
er den totale mengden av GO termer brukes for semantisk likhet beregningen.
resultater
oppsummering av RNA-seq resultater for BEL-7402 celler behandlet med berberine
hele transcriptomic profilering av BEL-7402 celler behandlet med eller uten berberine ble vurdert ved basepar oppløsning via RNA sekvensering. Etter lav kvalitet leser (som nevnt i Les innretting delen, Materialer og metoder) ble renset, ca 30 millioner leser ut av ~ 41500000 rå leser (leser retention rate: 70%, GC innhold: 45 ~ 46%, sekvens lengde: 36 ~ 100 bp) ble kartlagt til referanse genomet for hver prøve (tabell 1). Ifølge «
Standard
,
Retningslinjer og Best Practices for RNA-Seq
» vedtatt av KODE [36], er dette sekvense dybde god for dette uttrykket analyse og er akseptabelt for alternativ spleising analyse i menneskelig transkriptom.
uttrykt forskjellig og alternativt spleisede gener indusert av berberine behandling
etter å ha analysert ved hjelp DESeq programvare, RNA-seq returnerte resultatene 343 degs i BEL-7402 celler etter behandling med berberine, med 111 oppregulert og 232 nedregulert (tabell A i S1-fil). Det er interessant biologisk prosess som reaksjon på bakterien (GO: 0009617) ble funnet å være betraktelig beriket med oppregulert degs (tabell 2), noe som er i overensstemmelse med den kliniske bruken av berberin som et bredspektret antimikrobielt medisin [3]. Og vi fant gener relatert til positiv regulering av angiogenese ble signifikant nedregulert av berberine, som står for den anti-angiogenetic aktivitet av berberine rapportert i tidligere arbeider. [37-39] Ifølge KEGG vei berikelse analyse, degs ble betydelig anriket på p53 signalveien (hsa04115) og flere kreftrelaterte trasé som Jak-STAT signalveien (hsa04630), apoptose (hsa04210) og Pathways i kreft ( hsa05200) (tabell 3). Den Jak-STAT signalveien er en stor signale som er involvert i regulering av immunsystemet, noe som tyder immunitet regulerende aktivitet av berberin kan bidra til sin anti-kreft-effekt.
I mellomtiden, alternativt spleising analyse ble utført med AltAnalyze programvare. Resultatene viste at 1083 differensielt alternativt spleisede eksoner, svarende til 867 DASGs (tabell B i S1-fil) ble identifisert i BEL-7402 kreftceller etter berberin behandling. Tatt RLIM-genet som et eksempel (figur 1), ble inkludering nivået av exon 2 i modnet mRNA vesentlig endret (spleising indeks 0,5) etter berberin behandling, mens det var bare en liten endring i sin helhet genekspresjon nivå. I sammenligning med RLIM, var det betydelig variasjon (folde-change 6) i gen-ekspresjon nivå av NFKBIA (som et eksempel på DEG), men ingen vesentlige endringer (spleising indeks ≈ 1) i inkluderingen av dens eksoner (Fig 1). Som vist i tabell 2, ble DASGs involvert i en rekke biologiske prosesser som cellesyklusen (GO: 0007049), kromosom organisasjon (GO: 0051276), makromolekylære kompleks sammenstilling (GO: 0065003), og cellulær respons på stress (GO: 0033554). Pathway anrikning analyse representeres at disse DASGs ble anriket med PI3K-AKT-mTOR signalveien (har: 04 150) og regulering av aktin cytoskjelettet (har: 04810) (tabell 3), som alle sterkt beslektet med cellesyklus prosess og celle proliferasjon [40 ]. Åpenbart disse resultatene antydet at disse DASGs kan også ha sammenheng med kreft handling av berberine.
Statistisk analyse av den funksjonelle kryss snakker mellom degs og DASGs
For å undersøke om det er noen form funksjonell tverr snakker mellom degs og DASGs, ble statistiske tester utført av tre primær men ulike perspektiver.
Lokale co-berikelse blant kromosom sekvenser.
Intuitivt det bør testes først hvorvidt disse degs og DASGs er beriket sammen på samme eller nærliggende områder på kromosomene. For å utføre denne oppgaven, ble en berikelse stillingen tildelt hvert bånd på alle kromosomene for henholdsvis DASGs og degs [32]. Som vist i figur 2A, de degs og DASGs utstilt ganske forskjellige berikelse distribusjoner globalt. Men mønstre kan bli funnet i hver lokale regionen. De fleste av de DASG-beriket nettsteder er på eller nær områder beriket av degs. For å kvantifisere co-berikelse mønster mellom degs og DASGs ble euklidsk distanse (0,941) beregnet mellom resultatet berikelse på alle kromosom band av degs og DASGs. For å teste den statistiske betydningen av avstanden mellom degs og DASGs, simuleringer ved tilfeldig prøvetaking to gensettene i samme størrelse på degs og DASGs ble utført for 10000 ganger for å produsere fordelingen av euklidske avstanden mellom to gensettene på kromosomene . Som vist i figur 2B, er avstanden mellom degs og DASGs var betydelig kortere enn de som er mellom tilfeldig prøvesett. Resultatene viste tydelig at degs og DASGs er fysisk co-beriket på de tilsvarende kromosomene.
Globalt nærhet basert på protein-protein interaksjon (PPI) nettverk.
Etter over resultatet, tilleggs innsats ble tatt for å måle den funksjonelle sammenheng mellom disse to genene bestemmer basert på PPI-nettverk. I begynnelsen ble 100000-time tilfeldige simuleringer utført for å bygge fordelingen av gjennomsnittlig korteste veien avstanden mellom to gensettene i de samme vekter som degs og DASGs [33]. Deretter ble det i gjennomsnitt avstanden mellom degs og DASGs beregnet og sammenlignet med distribusjonen. Som vist i figur 3, er det tidligere langt borte fra gjennomsnittet av den simulerte fordelingen ved en statistisk signifikans på p-verdi 0,05. Resultatene indikerte at disse degs og DASGs kan være nært forbundet via protein-protein-interaksjon.
A. Et eksempel illustrasjon av nærhet mellom to gensettene. Hver sirkel punkt representerer en node i nettverket og hver linje representerer kanten mellom to noder. Den rød-farget banen er den korteste veien mellom X og Y i dette nettverket, noe som er med 3 trinn. Den høyre del er matrisen av korteste veilengde mellom alle mulige par av to gensettene (set_1 {Y, C, D}, set_2 {X, A, F}). Og deres gjennomsnitt korteste banelengden er 2.78. B. Den blå kurven over den gule histogrammet passer fordelingen av nærhet mellom to tilfeldig gensettene i samme størrelser av degs og DASGs hhv. Den røde stiplede linjen refererer til avstanden mellom degs og DASGs. P-verdien representerer den andelen av genet faste par med kortere avstand enn mellom degs og DASGs.
Funksjonell semantiske likheten på Gene ontologi (GO) treet.
Mens degs og DASGs ble funnet å ha en vesentlig kortere avstand sammenlignet med tilfeldige samplet gensettene ifølge PPI nettverk, er denne typen av funksjonelle sammenheng er indirekte og ikke med sterk biologisk betydning. Således ble en enklere metode som anvendes for å måle den funksjonelle sammenheng mellom degs og DASGs basert på de biologiske prosessene som påvirkes av dem [35]. For å balansere beregnings effektivitet og måling robusthet, de GO biologiske prosessbetingelser med minst 10 gener ble velger som referanse biologiske prosessen sett (figur 4A). En semantisk likhet poengsum var tilordnet hver to GO betingelser basert på grafen struktur av GO, som vist på fig 4B. Deretter et gjennomsnitt semantisk likhet Poengsummen ble beregnet over alle par av GO vilkår henholdsvis fra de biologiske prosessene som er berørt av degs og DASGs ved hjelp av beste-match gjennomsnitt strategi. Og prosedyrer ble utført på to tilfeldig samplet gensettene i samme målestokk som degs og DASGs til 10000 ganger for å få fordelingen av den gjennomsnittlige semantiske likhet. Som vist i figur 4C, er den gjennomsnittlige semantiske likheten mellom degs og DASGs ekstremt høyere enn to tilfeldige sett-pickup, som indikerer at disse to sett genene kan være funksjonelt tilkoblet.
A. Kaken plottet viser hvor stor andel av GO vilkår med tilsvarende genet nummer. Den barplot representerer antall GO vilkår med gener mer enn hver cutoff av genet nummer. Og den delen av GO vilkår med mer enn 10 gener ble valgt for videre beregning. B. heatmap av GO semantiske likheten mellom hver to utvalgte GO vilkår. Jo varmere farge er, desto høyere er likheten mellom de to perioder. C. Kurven representerer fordelingen av semantiske likheten mellom to tilfeldig samplet gensettene i samme størrelse på degs og DASGs hhv. Den rød diamant punktet refererer til den semantiske likheten mellom degs og DASGs.
Diskusjoner
transkripsjon og alternativ spleising er to viktige biologiske prosesser i løpet av genuttrykk, som til sammen bestemmer proteomet av celler under en viss tilstand. I denne studien, for å utforske den funksjonelle forbindelse mellom differensielt uttrykte gener og differensielt alternative spleisede gener i kreftceller behandlet med berberin, ble mRNA profilering av BEL-7402-celler oppsamlet via en RNA-seq. Deretter både degs og DASGs indusert av berberine ble nøye identifisert av en pakke med sekvensanalyse programvare. Basert på degs funksjonelle berikelse analyse, ble to mulige mekanismene bak cellesyklus arrest eiendom for berberine slått som nedenfor.
Berberine kan indusere p53-avhengig G1 fase arrestasjonen av BEL-7402 kreftceller. Etter BEL-7402 celler ble behandlet med berberine, fem gener (
BBC3
,
FAS
,
CCNG2
,
GADD45B
, og
IGFBP3
) var oppregulert og to gener (
CASP9
,
THBS1
) ble nedregulert (tabell C i S1 File) i p53 signalveien. Spesielt de fem oppregulert gener er nedstrøms mål av p53 [41-45]. I mellomtiden, p53, ble funnet å bli uttrykt på et beskjedent nivå i BEL-7402-celler før og etter behandling berberin. Vill-type p53-status i BEL-7402 cellelinje ble også bekreftet av andre forskere [46, 47]. Disse resultatene antydet at p53 signalveien kan bli påvirket i henhold berberine forstyrrelse. Som kjent, er p53 en viktig cellesyklus kontrollpunkt-protein som vil føre til cellesyklus-stans reagerer på DNA-skade [48]. To cellesyklus-relaterte gener (CDKN2D, GADD45B), som er i den nedstrøms banen til p53, ble funnet å være oppregulert etter berberin behandling. De kunne hemme aktiviteten av CDK som regulerer G1-S-faseovergang. Og cellesyklus arrest i G1 fase i BEL-7402 celler indusert av berberine ble også funnet i vårt tidligere arbeid gjennom flowcytometrisk analyse. [8] Til sammen våre resultater indikerte at berberine kan hemme BEL-7402 celleproliferasjon ved å indusere G1 cellesyklus arrest i et p53-avhengig måte. I tillegg, p53-avhengig cellesyklus-stans ved G1 fase ble også rapportert i flere andre kreftcellelinjer etter at berberin behandling. [37-39] Våre tidligere studier har rapportert cellesyklus-stans virkning av berberin ved å målrette kalmodulin, som kan være oppstrømssignalet av p53 trasé [8].
Berberine kan undertrykke produksjonen av inflammatoriske cytokiner gjennom NFkB inhibering. RNA-seq Resultatene indikerte at
NFKBIA product: (
IKB
) var signifikant oppregulert ved berberine behandling (tabell D i S1 File). Som en inhibitor av NFkB,
IkB
kan hindre translokasjon av NFkB fra cytoplasma til kjernen [49]. Tidligere studier har vist at inhibering av NFKB kan innvirke på ekspresjonen av mange inflammatoriske faktorer som kan fremme tumorcellevekst og anlegget tumorinvasjon og metastase [50]. I denne studien fem cytokiner (
IL-6
,
IL-8
,
IL1A
,
IL-33 Hotell og
IL11
) (tabell D i S1-fil) ble funnet å bli nedregulert etter berberin behandling i henhold til de RNA-seq resultater. Spesielt, har alle disse cytokiner blitt rapportert som proinflammatoriske faktorer. For eksempel
IL-6 Hotell og
IL-8
ble rapportert å være betydelig høyt uttrykt og spiller en viktig rolle i migrasjon og bærekraftig spredning av menneskelige leveren kreftceller [51-53].
