Abstract
Paclitaxel spiller en viktig rolle i behandlingen av kreft i eggstokkene; er imidlertid motstanden mot paclitaxel hyppig observert. Dermed vil ny terapi som kan overvinne motstanden paclitaxel være av betydelig klinisk betydning. Vi evaluerte antiproliferative virkningene av en antimitosemekanisme og antivascular agenten BPR0L075 i paclitaxel-resistent eggstokkreft celler. BPR0L075 viser potent og bredspektret cytotoksisitet ved lave nanomolare konsentrasjoner (IC
50 = 2-7 nM) mot begge foreldrenes eggstokkreft celler (ovčar-3, Skov-3, og A2780-1A9) og paclitaxel-resistente underlinjer ( OVCAR-3-TR, SKOV-3-TR, 1A9-PTX10), uavhengig av ekspresjonsnivåene av multimedikamentresistens transportør-P-gp og klasse III β-tubulin eller mutasjon av β-tubulin. BPR0L075 blokker cellesyklus i G2 /M fase i paclitaxel-resistente celler mens lik konsentrasjon av paklitaksel behandling var ineffektiv. BPR0L075 induserer celledød av en dual mekanisme i foreldre og paclitaxel-resistent eggstokkreft celler. I de parentale celler (OVCAR-3 og SKOV-3), BPR0L075 indusert apoptose, gjenspeiles av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spalting og DNA-stige formasjonen. BPR0L075 indusert celledød i paclitaxel-resistent eggstokkreft celler (OVCAR-3-TR og Skov-3-TR) er først og fremst på grunn av mitotisk katastrofe, dokumentert av dannelsen av giganten, multinucleated celler og fravær av PARP cleavage. Immunblotanalyse viser at BPR0L075 behandling indusert oppregulering av cyclin B1, BubR1, MPM-2, og Survivin proteinnivåer og Bcl-XL fosforylering i parentale celler; men i resistente celler, de endogene uttrykk for BubR1 og survivin ble tømt, BPR0L075 behandling klarte å indusere MPM-2 uttrykk og fosforylering av BCL-XL. BPR0L075 indusert celledød i både foreldrenes og paclitaxel-resistent eggstokkreft celler går gjennom caspase-3 uavhengige mekanismer. I konklusjonen, viser BPR0L075 potente cytotoksiske effekter i eggstokkreft celler med potensial til å overvinne paclitaxel motstand ved å omgå efflux transportører og indusere mitotisk katastrofe. BPR0L075 representerer en roman microtubule terapeutisk å overvinne multiresistens og utløse alternativ celledød av mitotisk katastrofe i eggstokkreft celler som er apoptose-resistente
Citation. Wang X, Wu E, Wu J, Wang TL, Hsieh HP Liu X (2013) En antimitosemekanisme og Antivascular Agent BPR0L075 seirer multiresistens og induserer Mitotisk Catastrophe i Paclitaxel-Resistant eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (6): e65686. doi: 10,1371 /journal.pone.0065686
Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 21 november 2012; Godkjent: 24 april 2013; Publisert: 06.06.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Texas Tech University Health Sciences Senter (TTUHSC) School of Pharmacy (X. Liu). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige malignitet av gynekologisk kreft, resulterer årlig i løpet av 14 000 amerikanske og 114.000 på verdensbasis dødsfall. Til tross for fremskritt i diagnostikk og behandling, fem-års overlevelse for stadium IV pasienter er ca 18% [1], [2]. Manglende evne til å overvinne resistens og hemme metastase representerer den viktigste årsaken til behandlingssvikt [3]. Innovative og effektive nye behandlingsformer som vinne resistens er kritisk nødvendig for å forbedre overlevelse og livskvalitet for pasienter med denne sykdommen.
microtubule stabiliserende midler slik som taxaner, epotiloner og mikrotubulidynamikk-destabiliserende midler, for eksempel
Vinca
alkaloider er blant de mest effektive kjemoterapeutika som brukes i klinikken [4]. Imidlertid er en av de største hindringer utviklet seg i klinikken er multimedikamentresistens (MDR). Spesielt for paclitaxel, til tross for betydelig første reaksjon for avansert eggstokkreft ved hjelp av paclitaxel og cisplatin basert kombinasjonsbehandling, det store flertallet av pasientene tilbakefall og utvikle resistens [5], [6]. Paclitaxel motstand er multifaktoriell, blant annet opp-regulering av membran legemiddel effluks transport P-glykoprotein (P-gp) [7], [8], mutasjoner i β-tubulin-genet [9], [10], [11], [12 ], endringer i ekspresjonen av p-tubulin-isotyper [13], [14], avvikende signaltransduksjonsveier [15], [16], og endringer i apoptotiske regulatoriske proteiner slik som Bcl-2 [17], [18] og inhibitor av apoptose protein survivin [19]. Identifiseringen av romanen antimitosemekanisme agent som kan overvinne taxan motstand, viser overkommelig aktivitet i taxan-ildfast svulster kan potensielt gi kliniske fordeler for pasienter med avansert eggstokkreft.
BPR0L075 [6-metoksy-3- (3 «, 4 «, 5»-trimetoksy-benzoyl) -1 H-indol] er en ny syntetisk indol forbindelse som inhiberer tubulin polymerisering ved binding til den colchicin-bindingssetet av tubulin [20]. BPR0L075 er strukturelt relatert til den klassiske tubulin-bindende og vaskulær forstyrre agenten combretastatin. BPR0L075 har vist antimitosemekanisme og antiangiogen aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo product: [20], [21]. Vi rapporterte at BPR0L075 vises vaskulær forstyrrende aktivitet ved å indusere rask, riktignok midlertidig svulst vaskulær nedleggelse og fører til reduksjon av tumor perfusjon i ortotopiske menneskelige brystkreft xenografter [22]. BPR0L075 arrestasjoner menneskelige livmorhalskreft KB celler i G2 /M mitotisk sjekkpunkt, og induserer celle apoptose (IC
50 = 3,6 nM) av perturbing mitokondriemembranen potensial og aktivering av caspase-3 kaskade [20]. BPR0L075 besitter god selektivitet mellom normale celler og kreftceller, med IC
50 verdi i normale fibroblast Detroit 551 celler høyere enn 1 mikrometer [20]. BPR0L075 viser monoterapi antitumor aktivitet mot veksten av menneskelige mage og livmorhalskreft xenografter [20]. Det synergi forbedrer også antitumor aktivitet mot humant lunge, colorectal og cervical tumorxenotransplantater når kombinert med cisplatin [21].
I denne studien har vi observert at BPR0L075 var svært aktiv i paclitaxel-resistent eggstokkreft celler og foreldre celler med IC
50 verdier ved ensifret lav nanomolare konsentrasjoner. BPR0L075 indusert apoptose i foreldre eggstokkreft celler. I motsetning til den induserte mitotisk katastrofe i paclitaxel-resistent eggstokkreft celler dokumentert av dannelse av store, multinucleated polyploide celler. BPR0L075 representerer en ny og lovende microtubule terapeutisk å overvinne taxan motstand og utløse alternativ celledød av mitotisk katastrofe i celler som er apoptose-resistente.
Resultater
BPR0L075 Viser Potent Cytotoksisitet i paclitaxel-resistente Menneskelig ovarialcancer Cells
Vi testet cytotoksisitet av BPR0L075 i menneskelig eggstokkreft cellelinjer Skov-3, ovčar-3, og A2780-1A9 samt paclitaxel-resistente underlinjer Skov-3-TR, ovčar-3 -TR, og 1A9-PTX10, som ble valgt ut under kontinuerlig eksponering av 0,25 uM paclitaxel (SKOV-3-TR), 0,5 uM paclitaxel (OVCAR-3-TR), og 15 ng /ml paclitaxel og 5 mg /ml verapamil ( 1A9-PTX10), henholdsvis. Figur 1A viser at, i likhet med paclitaxel, BPR0L075 viste sammenlignbar antineoplastiske aktivitet i å drepe foreldre eggstokkreft celler ved lave nanomolare konsentrasjoner. Imidlertid BPR0L075 var mer effektiv enn paclitaxel mot paclitaxel-resistente eggstokkreft celler, nesten fullstendig beholdt sin cytotoksiske effekt mot disse resistente underlinjer, hvor paclitaxel var praktisk talt ineffektiv. Figur 1B oppsummerer IC
50 verdier av BPR0L075, paclitaxel, og doxorubicin mot veksten av disse humane eggstokkreft celler og deres resistente underlinjer etter 4 dagers kontinuerlig eksponering. Den Skov-3-TR og ovčar-3-TR-celler viste høy motstandsforhold ( 400 ganger) for paclitaxel sammenlignet med tilsvarende foreldrecellene. 1A9-PTX10 celler vises moderat motstand ratio (98 ganger) for paclitaxel. Disse paclitaxel-resistente celler viste også kryssresistens mot doxorubicin (1,8 til 12 ganger). BPR0L075 vises lignende følsomhet i alle sammenkoblede foreldre og paclitaxel-resistent eggstokkreft cellelinjer med IC
50 verdier i området 2-7 nM (figur 1B).
(A) Former menneskelige eggstokkreft celler (SKOV- 3, OVCAR-3, og A2780-1A9) og paclitaxel-resistente underlinjer (Skov-3-TR, OVCAR-3-TR, og 1A9-PTX10) ble behandlet med BPR0L075 (rød sirkel) eller paclitaxel (blå firkant) på tre -15 nM konsentrasjoner for 4 dager, og cytotoksisiteten ble evaluert ved SRB-analysen. Fraksjon av celleoverlevelse i forhold til kontrollene representerer middelverdi ± SD av 12 bestemmelser. (B) Oppsummering av P-gp uttrykk, SIII-tubulin uttrykk, og følsomhet over sammenkoblede eggstokkreft cellelinjer til paclitaxel, doxorubicin, og BPR0L075 behandling. Tall i parentes representerer graden av resistens (x-ganger), uttrykt som forholdet mellom IC
50-verdier sammenlignet med de tilsvarende foreldrelinjene. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
BPR0L075 er ikke et substrat for utstrømning transportører, og Aktiv i eggstokkreft celler med endrede SIII-tubulin uttrykk og β-tubulin Mutation
Immunoblotting analyse viste at de resistente cellene OVCAR-3-TR og Skov-3-TR har høy ekspresjon av P-gp-proteinet, mens de paren OVCAR-3 og SKOV-3-celler ikke har noen detekterbar P-gp uttrykket (figur 2A). For å bekrefte at BPR0L075 ikke er et substrat for efflukspumper, målte vi de intracellulære BPR0L075 nivåene i de to parene av cellelinjer OVCAR-3 /OVCAR-3-TR og SKOV-3 /SKOV-3-TR ved anvendelse av en sensitiv LC /MS /MS-metoden (figur 2B). Begge par av celler erholdt liknende intracellulære BPR0L075 konsentrasjoner etter BPR0L075 behandling (20 nM i 6 timer, figur 2C) med ingen statistisk forskjell (
P
0,05). BPR0L075 er ikke et substrat for en ATP-bindende kassett sekretoriske transportøren brystkreft motstand protein (BCRP), gjenspeiles av den tilsvar cytotoksisitet i humane brystcancer MCF7-celler (IC
50 = 3,5 nM) og mitoksantron bestandig MCF7 /MX-cellene (IC
50 = 4,0 nM), MCF7 /MX-celler er kjent for å overuttrykke BCRP [23], [24], [25]. Sammen, viser resultatene at effluks transportøren P-gp har bidratt til den valgte paclitaxel motstand i SKOV-3-TR og OVCAR-3-TR-celler, men BPR0L075 er ikke et substrat for efflukspumper, hvilket bidrar til dens evne til å overvinne paclitaxel motstand .
(A) Western blot analyse av P-gp og SIII-tubulin uttrykk i de sammenkoblede eggstokkreft cellelinjer. Pan β-tubulin og β-aktin var lasting kontroller. (B) LC /MS /MS-analyse av intracellulære BPR0L075 nivåer, med LC kromatogram som viser retensjonstiden for intern standard [1- (1H-indol-3-ylkarbonyl) -1 H-imidazol] og BPR0L075 som 2,2 og 2,8 min, respektivt . Masse overganger av m /z 212 → 144 for intern standard og m /z 342 → 195 for BPR0L075 ble overvåket for kvantifisering. (C) De intracellulære BPR0L075 nivåene i de sammenkoblede ovarie cancer-cellelinjer. Celler ble inkubert med 20 nM BPR0L075 i 6 timer, og deretter ble cellene vasket, høstet, og lysert for LC /MS /MS-måling. Barer representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige tester. Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert (
P
0,05, student
t
-test)
Paclitaxel motstand fenotype er ofte forbundet med endring av klassen. III β-tubulin isotype uttrykk [26]. Vi observerte differensial uttrykk for tubulin-isotype SIII-tubulin i foreldre og paclitaxel-resistent eggstokkreft celler. Begge OVCAR-3 og SKOV-3-celler har høye uttrykk for SIII-tubulin, men etter valg med paclitaxel, ekspresjonen av SIII-tubulin markert redusert (figur 2A), den endring av SIII-tubulin uttrykk i resistente celler ikke påvirker følsomheten til BPR0L075. De 1A9-PTX10 celler er kjent for å oppvise en ikke-resistent fenotype MDR1, de havn β-tubulin mutasjon med nedsatt paclitaxel interaksjon med tubulin [27], [28], [29], [30] (figur 1B). Mutasjon av β-tubulin ikke negativt påvirke BPR0L075 indusert cytotoksisitet i 1A9-PTX10 celler (figur 1). Sammen er BPR0L075 cytotoksiske til celler med høy P-gp og BCRP uttrykk; cytotoksisitet er uavhengig av SIII-tubulin uttrykk nivåer eller β-tubulin mutasjonsstatus.
BPR0L075 induserer G2 /M arrest i Begge foreldre og Paclitaxel bestandig eggstokkreft celler
Vi fulgte cellesyklusen progresjon i både foreldrenes og paclitaxel-resistente celler etter BPR0L075 behandling. Som vist i figur 3, BPR0L075 behandling (10-100 nM, legemiddelnivåer kan oppnås i mus xenotransplantater [22]) i 24 timer resulterte i tap av cellepopulasjonen fra G0-G1 faser, med samtidig akkumulering av celler i G2 /M fase i begge OVCAR-3 og OVCAR-3-celler TR. I forhold til den robuste cellesyklus arrest etter BPR0L075, paclitaxel-resistente celler utstilt defekt mitotisk respons til paclitaxel, som ikke klarte å arrestere i mitosen selv behandlet med 100 nM av paclitaxel (data ikke vist). For OVCAR-3-TR-celler, polyploide celler ( 4N DNA) dukket opp etter BPR0L075 behandling sammenligne med OVCAR-3 celler. Vi har også undersøkt tidsforløpet av BPR0L075 indusert cellesyklus arrest når de ble behandlet med 10 nM BPR0L075. BPR0L075 begynte å blokkere OVCAR-3-celler i G2 /M fase så tidlig som 12 timer, og utviklet for å fullføre rest fra 24 til 48 timer i begge OVCAR-3 og OVCAR-3-celler TR. BPR0L075 behandlet OVCAR-3-TR celler ga opphav til en betydelig andel av polyploide celler (DNA innhold 4N) på 24-48 timer (Figur 3, piler). Tilsvarende BPR0L075 behandling også indusert treringstrinnet og tidsavhengig cellesyklusarrest i G2 /M fase i både SKOV-3 og SKOV-3-TR-celler, med høy fraksjon av polyploide celler i SKOV-3-TR (fig S1 ). Mitotisk celledød eller mitotisk katastrofe er ofte forbundet med vekst arrest i G2 /M-fasen av cellesyklusen, etterfulgt av dannelse av store polyploide celler [31], [32], disse polyploide celler observert antyder at BPR0L075 indusert mitotisk katastrofe i paclitaxel -resistente eggstokkreft celler.
OVCAR-3 og OVCAR-3-TR-celler ble behandlet med etanol kjøretøy eller BPR0L075 (10-100 nM) i 24 timer eller 10 nM BPR0L075 for angitte varigheter (0-48 timer ), farget med propidiumjodid og analysert ved flow-cytometer. Cellesyklus profilene er presentert som tredimensjonale overlegg. X-aksen viser intensiteten av propidiumjodid fluorescens, noe som indikerer cellulært DNA-innhold i ulike cellesyklusfaser. Y-aksen representerer de celletellinger; og z-aksen viser konsentrasjonen eller tidspunktene for BPR0L075 behandling. 2N, celler som er bosatt i G0-G1 fasen av cellesyklus; 4N, celler i G2-fasen eller mitose. BPR0L075 induserer betydelig G2 /M arrest fulgt av utseendet til en sub-G1 befolkningen i begge foreldrenes og resistente celler, med polyploide celler (piler) bare i resistente celler. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
BPR0L075 forstyrrer microtubule Cytoskjelett og induserer Mitotisk Catastrophe i Paclitaxel bestandig eggstokkreft celler
Vi har undersøkt effekten av BPR0L075 på organiseringen av microtubule nettverk av eggstokkreft celler ved immunfluorescens farging av α-tubulin (grønn). Som vist i figur 4, ethanol kjøretøy behandlet OVCAR-3 og SKOV-3-celler som hadde godt organisert typiske radiale mikrotubul nettverks matriser; i motsetning til dette BPR0L075 (20 nM i 18 timer) ble behandlet OVCAR-3 og SKOV-3-celler som hadde avrundet form, kondensert kromosomer, med oppbrytning av mikrotubul fibrene i de celler som ledsaget av cellulær deformasjon. For paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler, ble de lange mikrotubul fibre sjelden sett i bærerbehandlede celler, med enda mindre farging etter behandling av BPR0L075. BPR0L075 behandlede resistente celler viste også egenskapene av mitotisk katastrofe som definert av dannelsen av gigant, flerkjernede celler (figur 4, piler).
Dekkglass inneholdende OVCAR-3 og Skov-3 foreldre og paclitaxel-resistente celler ble eksponert til medium inneholdende etanol kjøretøy eller 20 nM av BPR0L075 i 18 timer. Cellene ble løst, dekk ble deretter farget med anti-α-tubulin antistoff (AlexaFluor 488, grønn) for microtubules og 4,6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, blå) for cellekjerner, og observert av Olympus IX81 fluorescens mikroskop . Kontrollforeldrecellene viste typiske radial mikrotubulidynamikk arrays. BPR0L075 behandling forstyrret microtubule cytoskjelettet i både foreldrenes og resistente eggstokkreft celler. Hvite piler viser de gigantiske, multinucleated cellene karakteristiske av mitotisk katastrofe. Scale bar, 10 mikrometer.
Paclitaxel bestandig eggstokkreft celler Vis deregulert Mitotisk Response og Nedbryting av Surviving
Vi har analysert de viktigste molekylære hendelser assosiert med BPR0L075 indusert cellesyklus arrest. Cyclin B1 er en cellesyklus regulatorisk protein som er involvert i mitose og uttrykt hovedsakelig i G2 /M fasen av cellesyklus. Western blot analyse viste at basal uttrykk for cyklin B1 i paclitaxel-resistent OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler var signifikant lavere enn de i OVCAR-3 og SKOV-3-celler. BPR0L075 behandling (10-100 nM for 24 timer) forårsaket en konsentrasjonsavhengig økning i cyklin B1 nivåer i begge foreldrecellelinjer og paclitaxel-resistente underlinjer (figur 5A, B). BPR0L075 behandling også indusert oppregulering av mitotisk spindel sjekkpunkt protein BubR1 i foreldre OVCAR-3 og SKOV-3-celler. I paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og Skov-3-tr-celler, den endogene ekspresjon av BubR1 ble detekterbar (figur 5A, B). Vi overvåket også MPM-2-proteinet, et etablert markør av mitotiske celler som gjenkjenner en gruppe av fosforylerte former av proteiner som er fosforylerte bare i mitosen [33], [34]. BPR0L075 behandling (10-100 nM for 24 timer) forårsaket umiddelbar induksjon av MPM-2 i parentale celler, men ikke i de resistente underlinjer som har mitotiske defekter (figur 5A, B). Vi har også observert den endogene ekspresjon av Survivin, en regulator mitose og inhibitor av apoptose protein, i OVCAR-3 og SKOV-3-celler (figur 5A, B). BPR0L075 mediert mitotisk stopp er forbundet med induksjon av Survivin på en konsentrasjonsavhengig måte i parentale celler, som bevarer en overlevelsesreaksjonsveien for kreftceller. I motsetning til dette ble det Survivin uttrykket utarmet på de OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer, BPR0L075 behandling ikke klarte å indusere Survivin opp-regulering i den paclitaxel-resistente celler (figur 5A, B).
BPR0L075 behandlings (10-100 nM i 24 timer) induserte endringer i cyklin B1, BubR1, MPM-2, og survivin uttrykk i OVCAR-3 /OVCAR-3-celler TR (A) og SKOV-3 /SKOV-3- TR-celler (B). BPR0L075 behandling (10 nM) induserte endringer i PARP, BCL-XL, og BCl-2-proteiner på forskjellige tidspunkt (0-72 timer) i OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-celler (C) og SKOV-3 /SKOV- 3-TR-celler (d). 50 ug av proteinet Lysatet ble lastet på SDS-PAGE og Forsøkene ble gjentatt og representative blot er vist.
BPR0L075 induserer fosforylering av Bcl-XL i parentale celler, men ikke i paclitaxel-resistente Ovarian kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
BCL-2 familie proteiner er viktige regulatorer av apoptose, og deres uttrykk nivåer har blitt foreslått å korrelere med følsomhet for paclitaxel [35], [36], [37]. De OVCAR-3 og SKOV-3 cellelinjer uttrykte ikke Bcl-2-protein til et immunodetectable nivå, men ble funnet å uttrykke høye nivåer av BCL-XL. I motsetning til dette, for det OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer, Bcl-2-protein-nivå var lett synlig som assosiert med redusert ekspresjon av Bcl-XL (figur 5C, D). Når behandlet foreldre celler med 10 nM BPR0L075, den fosforylert form av BCL-XL dukket opp på 12-72 timer, dokumentert av elektro mobilitet skift på immunoblotter (figur 5C, D). Men gjorde lik eksponering av BPR0L075 ikke indusere BCL-2 eller BCL-XL fosforylering i OVCAR-3-TR og Skov-3-TR underlinjer. BPR0L075 behandling redusert BCL-XL nivåer i OVCAR-3-TR og Skov-3-TR celler uten å påvirke de BCL-2 nivåer (figur 5C, D).
BPR0L075 celledød er Caspase-3 Independent i både foreldre og Paclitaxel bestandig eggstokkreft celler
BPR0L075 behandling indusert proteolytisk spalting av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) fra en MW 116 kd polypeptidet til en MW på 85 kDa fragment i OVCAR-3 og SKOV-3-celler i en tids (figur 5C, D) og treringstrinnet (figur 6A, B) avhengig måte. Imidlertid PARP spaltning ble ikke observert i OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler (figur 5C, D, 6A, B), til tross for det faktum at den BPR0L075 behandling drepte både paren og resistente celler med lignende IC
50 verdier (figur 1). Vi observerte også at BPR0L075 behandling induserte DNA-stige formasjon, et kjennetegn på celle apoptose, i SKOV-3 og OVCAR-3-celler, men ikke i SKOV-3-TR og OVCAR-3-TR underlinjer (figur 6C). Ved hjelp av western blot-analyse, observerte vi ingen aktivering av kaspase-3 (tap av procaspase 3 eller utseendet til den spaltede caspase-3) i begge paren og resistente celler etter BPR0L075 behandling enten ved hjelp av antistoffer som er spesifikke føres procaspase-3 eller spaltet caspase-3 ( Figur 6A, B). For ytterligere å bekrefte en caspase-3 uavhengige celledød vei, forbehandlet vi cellene med en caspase-3 spesifikke og irreversibel inhibitor (20 mikrometer Z-DEVD-FMK) eller negativ kontroll inhibitor (20 mikrometer Z-FA-FMK) 24 timer før tilsetning av BPR0L075. ble ikke observert noen statistisk signifikant forskjell i cytotoksisitet for hvert par av cellelinjer (figur 6D,
P
0,05, student
t
-test); kaspase-3 inhibitor forhindret ikke celledød i både paren og resistente celler. Mitotisk katastrofe er kjent for å føre til celledød av caspase-2 og caspase-3-avhengige og uavhengige mekanismer [38]. Vi sjekket caspase-2-aktivering etter behandling med BPR0L075, ble caspase-2 spalting ikke påvist i både paren og resistente celler (figur 6A, B). Sammen utgjør de data indikerer at caspase-2 og caspase-3 uavhengig celledød var involvert i både paren og paclitaxel-resistente eggstokkreft celler; den dominerende celledød veien var ved apoptose i parentale celler, og mitotisk katastrofe i resistente eggstokkreft celler.
Western blot-analyse av PARP, caspase-2, og caspase-3 etter BPR0L075 (10-100 nM) behandling i 24 timer i OVCAR-3 /OVCAR-3-celler TR (A) og SKOV-3 /SKOV-3-TR-celler (B). β-actin ble lastet kontroll. (C) DNA-ladder-analyser i celler behandlet med 10 nM BPR0L075 i 72 timer. Genomisk DNA ble utsatt for 1% agarosegel-elektroforese. Gelen ble farget med etidiumbromid og DNA-båndene ble visualisert under en ultrafiolett-transilluminator. (D) Virkning av kaspase-3 inhibitor på BPR0L075 indusert cytotoksisitet. Celler ble forbehandlet med caspase-3-inhibitor (20 pM Z-DEVD-FMK) eller negativ kontroll-inhibitor (20 pM Z-FA-FMK) i 24 timer før inkubering med 10 nM BPR0L075 i ytterligere 72 timer. Ved avslutning av inkubasjonen ble cellelevedyktigheten bestemt ved SRB-analysen. Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert av cytotoksisitet for hvert par av cellelinjer (
P
0,05, student
t
-test). Data representerer gjennomsnittlig ± SD.
diskusjon
Paclitaxel er en av de mest vellykkede og kjemoterapeutiske midler anvendes for behandling av et bredt spekter av humane maligniteter, inkludert faste tumorer og hematologiske maligniteter [4], [39]. Paclitaxel er kjent for å binde til P-tubulin og fremme dens sammenstilling til mikrotubuli [40], noe som fører til cellesyklus-stans i G2 /M fase, aktiverer mitotisk spindel «checkpoint», og til slutt fører til apoptotisk celledød [4]. Paclitaxel er et front-linje middel for ovarian cancer kjemoterapi, sammen med platinaderivater. Imidlertid er behandling av fremskreden ovariecancer med paclitaxel hindret ved utvikling av medikamentresistens. Identifisere nye agenter som vinne paclitaxel motstand er stort behov for. BPR0L075 er en heterosyklisk 3-aroylindole microtubule-destabiliserende agent, som forstyrrer tumorcelle mikrotubulidynamikk, fører til kreft cellesyklus arrest og celledød av caspase-3-mediert apoptose [20] og antiangiogenic effekter [21]. I tillegg forstyrrer BPR0L075 tumor blodkar og avsluttes svulst blod perfusjon
in vivo product: [22]. I denne studien har vi testet effekten og mekanismen for BPR0L075 i behandling av paclitaxel-resistent eggstokkreft celler.
Våre resultater viser at eggstokkreft cellelinjer som motstandsdyktig mot microtubule stabiliserende middel paclitaxel kan forbli følsomme for microtubule -destabilizing agenten BPR0L075. BPR0L075 vist potent cytotoksisitet i begge paren eggstokkreft celler og deres paclitaxel-resistente underlinjer med IC
50-verdier i området rundt 5 nM, mens lik konsentrasjonen av paclitaxel-behandling var ineffektiv i svært resistente eggstokkreft celler (figur 1). Disse paclitaxel-resistent eggstokkreft celler viste også kryssresistens mot andre kjemoterapeutika som doxorubicin (figur 1B). Denne observasjonen er i overensstemmelse med den tidligere rapport som BPR0L075 er effektiv mot multiresistente humane cervikale karsinom KB-celler som er resistente mot vinkristin, paclitaxel, og kolkisin [20]. Våre resultater tyder på at BPR0L075 er en potensiell nyttig middel i å kontrollere multiresistente eggstokkreft celler.
Våre data viser at BPR0L075 seirer to viktigste resistensmekanismer til paclitaxel, dvs. MDR1 motstand skyldes P-glykoprotein overekspresjon og endring av klasse III β-tubulin isotype uttrykk. De paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer viste overekspresjon av P-gp (figur 2A), et efflux pumpen i stand til å hemme retensjon av taxaner og andre kationiske legemidler [41]. BPR0L075 er ikke et substrat for P-gp og BCRP efflukspumper, dokumentert av tilsvar BPR0L075 intracellulære nivåer oppnådd i foreldre og resistente underlinjer (figur 2C) og sammenlignbar IC
50 verdier i MCF7 og MCF7- /MX celler. Begge OVCAR-3 og SKOV-3-celler har høy ekspresjon av klasse III β-tubulin, mens den OVCAR-TR og SKOV-3-TR viste markert redusert ekspresjon av klasse III β-tubulin (figur 2A), som antyder at forandringen av klasse III β-tubulin uttrykk påvirker følsomheten til paclitaxel men ikke BPR0L075. BPR0L075 er også meget effektiv i å drepe 1A9-PTX10 celler med β-tubulin genmutasjon [27], [28] (figur 1). Våre resultater støtter tidligere rapporter at mutasjoner i β-tubulin og endringer i uttrykket av klasse III beta-tubulin isotypes indusere resistens mot mikrotubulidynamikk stabiliserende midler og overfølsomhet overfor mikrotubulidynamikk-destabiliserende midler gjennom en endring i microtubule montering og dynamikk i kreftceller [42]. Sammen våre resultater tyder på at paclitaxel og BPR0L075 bind på ulike steder av tubulin; har de ikke-overlappende resistensmekanismen, og dermed potensielt tillate bruk av BPR0L075 for de ovarian kreftpasienter tilbakefall etter kjemoterapi paclitaxel.
BPR0L075 indusert cellesyklus-stans i G2 /M-fase i den parentale og paclitaxel-resistente ovarie kreftceller når paklitaksel behandling var praktisk talt ineffektiv (Figur 3, Figur S1). Flowcytometri data viser at BPR0L075 ikke forårsaker fullstendig mitotisk stopp i paclitaxel-resistente celler, noe som indikerer at de resistente cellene kan likevel gjennomgå DNA-syntese til tross for svikt i celledeling. BPR0L075 behandlede resistente celler ga opphav til en betydelig andel av polyploide celler (figur 3, figur S1), hvilket antyder at BPR0L075 indusert celledød i paclitaxel-resistente celler fortsetter gjennom mitotisk katastrofe. Mitotisk katastrofe er en annen form for celledød reaksjonsvei som er forårsaket av unormal mitose og /eller repareres kromosomskade [32], [43], [44], [45]. Mitotisk katastrofe oppstår under eller kort tid etter en deregulert eller mislykket mitose, og kan være ledsaget av morfologiske endringer som micronucleation (utseendet av kromosomer eller kromosomal materiale utenfor de to datter kjerner) og multinucleation (utseende av to eller flere kjerner lignende eller heterogen i størrelse, som følge av mangelfull separasjon i løpet av cytokinese) [43], [44], [45]. Dannelsen av store flerkjernede celler er en fenotype mitotisk katastrofe i celler indusert ved ioniserende stråling [46], [47] eller anticancer legemidler som påvirker mikrotubulus stabilitet [43], [48], [49], [50]. Immunfluorescens farging viser utseendet av gigant, multinucleated-celler (figur 4) etter BPR0L075 behandling av resistente celler, noe som antyder at kromosom segregering forekommer i det minste i en viss grad i paclitaxel-resistente celler, men cytokinese mislyktes.
Vårt studium viser at mitotiske reaksjonsveier er sterkt deregulert i OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR kreftceller, vist ved nedregulering av cyclin B1, uttømming av mitotisk spindel kontrollpunkt-protein BubR1, og manglende evne til å aktivere mitotisk epitop MPM-2- i resistente celler sammenlignet med foreldreceller (figur 5A, B). Observasjonene er forenlig med rapporter om at redusert uttrykk for cyclin B1 og BubR1 er assosiert med svekket spindel sjekkpunkt og paclitaxel motstand i eggstokkene carcinoma celler [51]; uttømming av BubR1 med siRNA resulterte i tap av spindelenheten sjekkpunkt funksjon og motstand mot paclitaxel [52].
Survivin uttømming i paclitaxel-resistente eggstokkreft celler kan spille en rolle i den BPR0L075-indusert mitotisk katastrofe. Survivin er et bifunksjonelt protein som virker som en suppressor av apoptose og et mitotisk regulator [53], [54], [55]. Survivin hemmer apoptose ved å samhandle med caspase og Smac /DIABLO proteiner, undertrykke aktivering av nedstrøms caspases, som bevarer en overlevelse vei [56]. Survivin modulerer også flere mitotiske hendelser, inkludert spindel og inter microtubuli organisasjon, spindel montere sjekkpunkt og cytokinese [44]. Vi observerte tap av basal uttrykk for survivin i paclitaxel-resistente celler sammenlignet med foreldre celler (figur 5A, B), noe som tyder på svekkelse av spindel sjekkpunkt i resistente celler. Paclitaxel er kjent for å være ineffektiv i å behandle Survivin-utarmet cancerceller [57], [58].
