Abstract
Bakgrunn
Genomisk rearrangements involverer ETS familie av transkripsjonsfaktorer forekommer hos 40-70% av prostatakrefttilfeller. ERG og ETV1 er de vanligste ETS medlemmer observert i disse genetiske endringer. Den høye forekomsten av disse rearrangements og deres biologiske betydningen representerer en ny terapeutisk mål for behandling av prostatakreft.
Metoder og funn
Vi har nylig rapportert utvikling av YK-4-279, en lite molekyl hemmer av EWS-FLI1 oncoprotein i Ewing sarkom. Siden ERG og ETV1 tilhører samme klasse av ETS faktorer som FLI1, testet vi evnen til YK-4-279 å hemme biologiske funksjoner av ERG og ETV1 proteiner i prostatakreft. YK-4-279 hemmet ERG og ETV1 formidlet transkripsjonen aktivitet i et luciferase assay. YK-4-279 også redusert ERG og ETV1 nedstrøms mål mRNA og protein uttrykk i
ETV1
-FUSION positiv LNCaP og
ERG
fusion positive Vcap celler. YK-4-279 redusert motilitet i LNCaP-celler i en ripe analysen og invasive fenotype av både LnCap og VCap-celler i en invasjons HUVEC-analyse. Fusion-negative PC3 celler var ikke svarer til YK-4-279. SiRNA mediert ERG knockdown i Vcap celler resulterte i et tap av narkotika respons. Samtidig forbigående ERG uttrykk i PC-3 celler resulterte i økt invasiv potensial, som ble redusert med YK-4-279.
Konklusjon
Disse dataene viser at YK-4-279 hemmer ERG og ETV1 biologisk aktivitet i fusion-positive prostatakreftceller fører til redusert bevegelighet og invasjon. Derfor YK-4-279 kan ha en innvirkning på metastase i prostata kreft, og det kan bli nærmere evaluert for dens kliniske applikasjoner i prostatakreft i tillegg til Ewings sarkom
Citation. Rahim S, Beauchamp EM, Kong Y, Brown ML, Toretsky JA, Uren A (2011) YK-4-279 hemmer ERG og ETV1 mediert Prostate Cancer Cell invasjon. PLoS ONE 6 (4): e19343. doi: 10,1371 /journal.pone.0019343
Redaktør: James McCubrey, East Carolina University, USA
mottatt: 20 desember 2010; Godkjent: 28 mars 2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Rahim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av Cancer Center Support tilskuddet P30-CA051008 for bruk av Biacore molekylær interaksjon delt ressurs. Støtte for arbeidet kom også fra Barnas Cancer Foundation (Baltimore MD), Go4theGoal, Dani stiftelse, Alex Lemonade Stand Foundation, Liddy Shriver Sarkom Initiative, Burroughs Wellcome Klinisk Scientist Award i translasjonell forskning (JT) og NIH R01CA133662 (JT) , R01CA138212 (JT), R01CA108641 (AU). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: En patentsøknad har blitt arkivert av forfatterne for sammensatte YK-4-279. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft er den vanligste formen for kreft og den nest mest ledende årsak til kreft dødelighet hos menn. Translokasjon som involverer ETS-familien av transkripsjonsfaktorer er til stede i 40-70% av prostatakreft, inkludert de mest klinisk aggressive former [1], [2], [3], [4], [5]. Disse trans produserer chimeriske gener, som smelter promotorområdet av en androgen responsiv-gen, slik som
TMPRSS2
, til den kodende region av ETS faktorer, oftest
ETV1
eller
ERG
[6], [7]. Disse rearrangements føre til androgen avhengige regulering av ETS transkripsjonsfaktorer og deres overuttrykk. ETS proteiner er proto-onkogener som er blitt implisert i patogenesen [8]. De kontrollerer uttrykket av målgener involvert i celleproliferasjon, apoptose, invasjon og angiogenese. Over-uttrykk for ETS faktorer i prostatakreftceller øker celle invasjon og induserer prostata intraepitelial neoplasi (PIN) i transgene musemodeller [9]. Nedbryting av ETS faktorer
in vitro
reduserer bevegeligheten og invasivitet. ERG og ETV1 utarming også føre til redusert tumorvekst
in vivo product: [7]. Nye resultater viser også at
TMPRSS2-ERG
uttrykk reaktiveres i kastrering resistent prostatakreft [10]. Således ETS proteiner representerer et nytt mål for forebyggelse eller behandling av metastatisk sykdom.
Vi har nylig rapportert et lite molekyl inhibitor av det chimeriske proteinet EWS-FLI1 i Ewings sarkom [11]. YK-4-279 hemmer EWS-FLI1 aktivitet, induserer apoptose i Ewings sarkom cellelinjer og bremser ned tumorvekst i mus xenograft modeller. FLI1, ERG og ETV1 er klasse I-ETS faktorer og del større enn 60% identitet og 80% homologi i deres aminosyresekvenser [12]. På grunn av den nære homologi av FLI1 med ERG og ETV1, testet vi muligheten av YK-4-279 å inhibere ETS genaktivitet i prostata cellelinjer som viser androgen avhengig ERG og ETV1 uttrykk. Våre resultater indikerer at YK-4-279 kan hemme ERG og ETV1 avhengig transkripsjonen aktivitet og dermed fører til redusert cellemotilitet og invasjon.
Diskusjon
Vcap og LNCaP celler er androgen-responsive Resultater og og havne ERG og ETV1 rearrangements
prostata krever androgener å fungere skikkelig og androgen respons kan brukes som grunnlag for å gruppere prostata kreft cellelinjer inn i en av to kategorier: androgen-sensitive og androgen-resistente. I de fleste ETS omorganisering tilfeller blir ETS-genet plassert under direkte regulering av en androgen responsiv-genpromotoren. I slike tilfeller medierer androgen over-ekspresjon av onkogen ETS faktor. For å studere effekten av ETS-inhibitorer i prostata cancer, valgte vi å arbeide med VCap og LNCaP-cellelinjer. Den VCap cellelinje havner en TMPRSS2-ERG omleiring, som forekommer via mellomliggende delesjon av 3 Mb regionen mellom TMPRSS2 og ERG på kromosom 21 (fig. 1a) [6]. Den LNCaP-cellelinje inneholder en genetisk trans hvor hele ETV1 locus er satt inn i den siste intron i prostata-spesifikke MIPOL1 region på kromosom 14 (fig. 1a) [7]. ERG og ETV1 rearrangements er gjensidig utelukkende til Vcap og LNCaP celler henholdsvis, og er ikke til stede i PC-3 cellelinje. Således ble det PC-3-celle-linje er valgt som en negativ kontroll for våre studier. Vi har bekreftet at både VCap og LNCaP-celler er androgen-følsomme, som demonstrert ved en økning i prostataspesifikt antigen (PSA) ekspresjon ved stimulering av den syntetiske androgen analoge R1881 (Fig. 1b). VCap og LNCaP-celler uttrykker ERG og ETV1-proteiner i henhold til basale betingelser på grunn av nærværet av
ETS
rearrangementer i disse cellene. Androgen behandling av disse cellelinjer, men ikke PC-3, resulterer i øket ERG og ETV1 mRNA og protein (Fig. 1c og d). Disse resultatene fastslår at både VCap og LNCaP-celler androgen responsiv mens PC-3-celler ikke er det. Androgen respons fra Vcap og LNCaP cellene oversettes til økt ETV1 og ERG uttrykk på grunn av prostatakreft spesifikke kromosomavvik rearrangements.
a) Prostata celler ble analysert for ETS omorganisering status ved å utføre PCR hjelp omorganisering spesifikk primer. Vcap celler havn den TMPRSS-ERG omorganisering mens LNCaP cellene inneholder omorganisert ETV1. Vcap og LNCaP celler uttrykker ERG og ETV1 protein henholdsvis under basale forhold. PC-3 celler ikke inneholde enten omorganisering og uttrykker ikke ERG eller ETV1. b) Vcap og LNCaP celler uttrykker Ptil i respons til R1881 behandling. PC-3 celler er ikke androgen responsive. Celler ble behandlet med 10 nM R1881 i 48 timer og PSA-ekspresjon ble analysert ved hjelp av sanntids qPCR. Resultatene ble normalisert til aktin. *; p 0,0001, n.s .; ikke-signifikant. c) R1881 stimulering resulterer i øket ERG og ETV1 mRNA i VCap og LNCaP-celler henholdsvis, men ikke i PC3-celler. RNA ble isolert fra stimulerte celler androgen og brukt til å utføre sanntids qPCR. Data ble normalisert til nivået av genekspresjon i fravær av androgen. d) ERG og ETV1 proteiner blir uttrykt i VCap og LNCaP-celler henholdsvis, men ikke i PC-3-celler. Androgen stimulering resulterte i økt ERG og ETV1 protein i Vcap og LNCaP celler. Prostata celler uttrykte ikke FLI1 proteinet under basal eller androgen stimulert forhold. MOLT4 ble brukt som en positiv kontroll cellelinje for FLI1 uttrykk.
YK-4-279 hemmer ERG og ETV1 transkripsjonen aktivitet
YK-4-279 rettet mot EWS-FLI1 oncoprotein i Ewings sarkom [11]. Imidlertid er stedet for interaksjon med EWS-FLI1 ukjent. Tatt i betraktning den nære homologi mellom FLI1, ERG og ETV1 undersøkte vi effekten av YK-4-279 på ERG og ETV1 funksjon. Vi først evaluert uttrykk for FLI1 i prostata celler. Den humane akutt lymfatisk leukemi cellelinje MOLT4 ble anvendt som en kontroll for FLI1 ekspresjon under basale betingelser. Ingen av prostataceller brukt i denne studien uttrykker FLI1 (Fig. 1d). Derfor ville effekten av YK-4-279 for prostataceller ikke forekomme som et resultat av målretting FLI1. Deretter validert vi den direkte interaksjonen mellom YK-4-279 og rekombinant ERG og ETV1 proteiner ved hjelp av overflaten plasmon resonans (SPR). YK-4-279 bundet til ERG med en affinitet (K
D) av 11,7 uM og bundet til ETV1 med en affinitet på 17,4 uM (fig. 2a, S1). Vi evaluerte YK-4-279 for effekter på ERG transkripsjonen aktivitet ved hjelp av en transient transfektert 207 bp fragment av ID2 genet promoter som styrer uttrykket av luciferase protein. Dette minimal ID2 promoter regionen inneholder to ETS områder og har tidligere vist seg å binde ERG [13]. Co-transfeksjon av ERG og ID2 reporter resulterte i en økning i luciferaseaktivitet. Promoter-aktivitet ble redusert ved samtidig behandling av cellene med YK-4-279, uten noen nevneverdig reduksjon i ERG proteinnivåer (Fig. 2b).
a) bindingskinetikken for YK-4-279 til ERG og ETV1 ble bestemt ved overflate-plasmonresonans. YK-4-279 bundet til ERG og ETV1 med en K
D 11,7 mikrometer og 17,9 mikrometer henholdsvis. SPR sensorgrams er gitt i utfyllende tall (fig. S1). b) En luciferase-assay ble utført i COS-7-celler ko-transfektert med ERG og en Id-2-reporter-konstruksjonen luciferase. Id-2 promoter aktiviteten ble redusert på YK-4-279 behandling uten at det påvirker ERG protein nivåer. *; p 0,001. c) VCap-celler ble behandlet med 50 nM siERG eller 10 pM YK-4-279 i 48 timer og mRNA og protein ekspresjonsnivåer av ERG mål ble evaluert. YK-4-279 behandling resulterte i redusert uttrykk av Plau, ADAM19 og PLAT mRNA. Plau og Plat proteinnivåer ble redusert også. Resultatene var sammenlignbare med de som oppnås ved siRNA mediert ERG knockdown. d) LNCaP-celler ble behandlet med 1 uM YK-4-279 og ETV1 målgenet nivåer ble evaluert. YK-4-279 behandling resulterte i redusert genekspresjon av MMP13 uten betydelig reduksjon i ETV1 nivåer. *; p. 0,01
Deretter vurderte vi effekten av YK-4-279 på uttrykk for endogene ERG og ETV1 målgener i Vcap og LNCaP cellelinjer. Vi fokuserte på flere medlemmer av plasminogen aktivator sti som Plau, plattformer, MMP13 og ADAM19. Disse genene mediere en invasiv fenotype i en rekke kreftformer, og er rapportert som direkte mål for ETS transkripsjonsfaktorer [9], [14], [15]. Eksponering av Vcap celler til 10 mm YK-4-279 i 48 timer førte til en signifikant redusert mRNA og protein nivåer av flere ERG målgener som Plau, plattformer og ADAM29. Nivået av nedregulering var sammenlignbar med den som oppnås ved siRNA mediert ERG knock-down i VCap-celler (fig. 2c). På samme måte, YK-4-279 resulterte i nedregulering av ETV1 målgen MMP-13 i LNCaP-celler (fig. 2d). Det bør bemerkes at denne hemming av ERG og ETV1 proteinaktivitet ble oppnådd uten noen betydelig reduksjon i ERG eller ETV1 proteinnivåer. Disse resultater antyder at YK-4-279 er i stand til å inhibere ERG og ETV1 transkripsjonen aktivitet i prostatakreftceller, noe som fører til redusert ekspresjon av gener som er involvert i nedbrytning av ekstracellulær matriks og metastase.
YK-4- 279 hemmer ETS mediert prostata kreft celle invasjon
Tidligere studier har antydet at
ETS
genet rearrangements megle invasjon i prostatakreft [7], [9]. For å ta opp spørsmålet om YK-4-279 er i stand til å hemme ERG og ETV1 mediert invasjon, benyttet vi en impedans basert endotelceller invasjon analyse [16]. Denne teknikk innebærer å utfordre et konfluent monolag av humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) med et andre lag av metastatiske celler som fester seg til, og invadere HUVEC monolaget. Tilbaketrekningen av endotelcelle kryss og invasjon av prostata kreftceller kan overvåkes i sanntid ved å måle reduksjonen i elektrisk motstand på gullelektroder [17].
A cytotoksisitet Analysen ble utført for å bestemme den maksimale tolerable dose av YK-4-279 i ulike prostatakreftcellelinjer. YK-4-279 viste ingen signifikant reduksjon i cellevekst ved en uM for LNCaP-celler og 10 uM for VCap og PC3-celler etter 2 dagers behandling (data ikke vist). Disse dosene ble valgt ut for ytterligere funksjonelle analyser for å sikre at inhiberende virkninger av YK-4-279 på invasjon og motilitet, er ikke som et resultat av celledød. Når HUVEC celler ble utfordret med LNCaP og Vcap celler, førte det til en bratt nedgang i elektrisk motstand indikasjon på celle invasjon. Behandling av disse cellene med YK-4-279 resulterte i betydelig redusert invasjon av HUVEC celler ved LNCaP og Vcap celler. Forbindelsen alene hadde ingen effekt på HUVEC celle monolag. YK-4-279 hemmet ikke invasjonen av
ETS
-FUSION negative PC-3 celler. (Fig. 3a og b). For å sikre at effektene observert var på grunn av hemming av ETS proteiner, reduserte vi ERG protein uttrykk i Vcap celler ved hjelp av siRNA. Dette resulterte i oppheving av YK-4-279 mediert hemming av invasjon (Fig. 3c). Deretter vi transient uttrykt ERG i PC-3-celler og analysert med hensyn på disse cellene i det endoteliale celle invasjon assay. ERG uttrykk alene PC-3 celler formidles på disse cellene en mer invasiv fenotype. Behandling med YK-4-279 inhiberte signifikant ERG mediert økning i invasjon (fig. 3d). Sammen tyder disse resultater på at YK-4-279 er i stand til å inhibere ETS-mediert invasjon av prostatakreftceller, både i celler med endogen og eksogen høy ekspresjon av proteiner ETS.
a) HUVEC-celler som danner en konfluent enkeltlag ble utfordret med LNCaP, Vcap og PC-3 celler med eller uten YK-4-279. YK-4-279 hemmet Vcap (10 mm) og LNCaP (1 mm) celle invasjon av HUVECs, mens PC-3 celler ikke ble påvirket. Prostata celler ble forbehandlet med YK-4-279. Forsøk ble utført i duplikater og motstand ble normalisert til tidspunktet for tilsetning av invaderende celler. b) Invasion ble kvantifisert 10 timer etter tilsetting av prostatakreftceller. Resultatene er uttrykt i forhold til ikke-behandlede betingelser. *; p 0,01. c) ERG-ekspresjon ble redusert i VCap-celler ved anvendelse av en C-terminal siRNA probe. ERG knockdown i Vcap celler resulterte i et tap av YK-4-279 mediert hemming av invasjonen. Vcap celler ble forbehandlet med 10 mm YK-4-279 2 dager før utfordre HUVEC monolaget. *; p 0,01, d) Transient ERG uttrykk i PC-3 celler formidles på cellene en mer invasiv fenotype. Deretter YK-4-279 behandling resulterte i redusert invasjon. PC-3 celler ble behandlet med YK-4-279 i 24 timer før utfordre HUVEC monolaget.
YK-4-279 hemmer ETV1 mediert bevegelighet i LNCaP celler
Neste , testet vi effektene av YK-4-279 på inhibering av motilitet av LNCaP-celler i en ripe assay. Alle forsøk i tidligere figurer ble utført med lave passasje LNCaP-celler (p 30). Imidlertid lav-passasje LNCaP-celler var ikke mottagelig for denne teknikken som de løst feste til cellekulturskål overflate. Tilsvarende Vcap celler vokser i klynger og danner ikke et konfluent monolag. Derfor utførte vi skrape analyser ved hjelp av høy passasje LNCaP celler (p 60). Høy passasje LNCaP celler vokse på en mye raskere og er i stand til å danne en konfluent monolag [18]. De har også uttrykker høye basalnivåer av ETV1 (fig. 4a) [19]. Før gjennomføring av den grunnen analysen, YK-4-279 ble testet for sin cytostatisk natur og ble funnet å ha noen effekt på celleformering ved konsentrasjoner som anvendes for bunnen av analysen (fig. S2). YK-4-279 behandling av LNCaP-celler resulterte i en signifikant reduksjon i celle motilitet i bunnen av analysen, mens ingen effekter ble observert på motiliteten av det negative kontrollcellelinje, PC-3 (fig. 4b). Skrape Analysen ble også utført med forbehandling av LNCaP-celler med 10 ug /ml mitomycin C i 2 timer før skrape overflaten. YK-4-279 var i stand til å hemme LNCaP cellemotilitet i mitomycin behandlet forhold også (fig. S3) Disse funnene tyder på at effekten av YK-4-279 på LNCaP celler i bunnen av analysen er ikke på grunn av cytotoksisitet, men utelukkende på grunn til inhibering av celle motilitet.
a) Høy passasje LNCaP-celler ble analysert for ETV1 ekspresjonsnivåer. HP-LNCaP-celler konstitutivt uttrykker høyere mengder av ETV1, i forhold til PC-3-celler. b) YK-4-279 hemmet bevegelighet i en ripe analyse i høy passasje LNCaP celler, mens PC-3 celler var ikke svarer. Cellemotilitet ble kvantifisert ved å måle avstanden mellom de trekkende cellegrensene. Motilitet ble uttrykt i forhold til kjøretøy behandlet forhold. *; p. 0,0001
EWS-FLI1 oncoprotein er avhengig av binding til RNA helicase A (RHF) for sin onkogene funksjon [20]. YK-4-279 induserer apoptose i Ewings sarkom celler ved å blokkere interaksjonen mellom EWS-FLI1 og RHA. Som en mulig mekanisme for aktiviteten av YK-4-279 i prostata cancer, testet vi om interaksjonen mellom en ETS familiemedlem og RHA er til stede i prostataceller i tillegg. Mens ERG interagerer med RHA i prostatakreftceller, YK-4-279 er ikke i stand til å blokkere dette samspillet (Fig. S4). Vi har også testet om YK-4-279 er i stand til å blokkere ERG eller ETV1 binding til ETS områder på DNA ved hjelp av overflaten plasmon resonans. YK-4-279 hemmet ikke ERG eller ETV1 DNA-bindende (Fig. S5a). Videre ble kromatin immunopresipitering utført for å evaluere ERG binding til plau promoter i nærvær av YK-4-279. Resultatene bekreftet BIAcore funn som YK-4-279 ikke forstyrrer ERG DNA binding (Fig S5b). Det bør bemerkes at Ewing celler uttrykker et avkortet FLI1 proteininneholdende bare eksoner 6-9 av FLI1. ETS translokasjoner i prostata cancer, på den annen side, resulterer i ekspresjon av en nesten full-lengde ETS familiemedlem. Derfor hypoteser vi at YK-4-279 kan hemme ETV1 og ERG funksjon i prostatakreftceller ved å hindre protein-protein interaksjoner som er annerledes enn EWS-FLI1 partnere i Ewing sarkom. Derfor er ytterligere undersøkelser er nødvendig for å fastslå den eksakte molekylære mekanismen for YK-4-279 mediert hemming av ERG og ETV1 funksjon i prostatakreftceller.
Resultatet av ETV1 hemming synes å være mer potent enn ERG hemming, i form av celle-motilitet og invasjon. Men dette fenomenet kan ikke bli entydig tilskrives bedre ETV1 hemming, som en rettferdig sammenligning av dataene er komplisert ved det faktum at ERG og ETV1 uttrykkes i forskjellige cellelinjer. Således kan kvaliteten av responsen også være en faktor av forskjeller mellom LnCap og VCap-celler. Ytterligere eksperimenter, slik som måling av størrelsen av ERG og ETV1 respons i samme celle-linje, ville være nødvendig for å entydig løse dette punktet.
Nye rapporter har antydet at ETS knock-down i prostatakreftceller kan resultere i redusert spredning i celler som uttrykker disse oncoproteiner [21], [22]. Selv om forsøkene i dette manuskriptet ble utført ved doser og tidsintervaller som ikke er toksiske for cellene, ser det ut til å være en direkte sammenheng mellom ekspresjonen av ETS proteiner og YK-4-279 cytotoksisitet. ETS-omorganisering negative PC-3 og DU-145 cellene vise minimal respons på YK-4-279 behandling (IC50 100 mm). Tvert imot, YK-4-279 er mer toksisk for både VCap (IC50 = 9,55 uM etter 72 timer) og LNCaP-celler (2,75 uM etter 72 timer). Derfor kan YK-4-279 også bli vurdert for sine cytotoksiske potensialer i ETS-omorganisering positive prostatakreftceller i fremtidige studier.
androgen avhengige over-uttrykk for ERG og ETV1 protein i prostatakreftceller har vært direkte innblandet økt invasjon og metastasering. Videre har flere undersøkelser korrelert den økte ekspresjon av disse proteinene med dårlig prognose, høyere Gleason score og en lavere forekomst av tilbakefall overlevelse. Foreløpig er androgen avhengige signalveier i prostatakreft målrettet via kastrering og androgen-reseptorantagonister. Effektene av disse behandlinger kan være delvis tilbakeføres til nedregulering av rearrangerte ETS faktorer. Dermed blir vellykket utvikling av små molekyl hemmere av ERG og ETV1 som YK-4-279, vil representere en ny linje av legemiddelselskap som tar sikte på å forebygge eller behandle metastatisk sykdom, samtidig som de sparer pasientene de langsiktige effektene av behandling rettet mot androgen sti.
Materialer og metoder
Cell Culture
Vcap, LNCaP, PC-3 og DU-145 celler ble oppnådd fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA ). HUVECs ble oppnådd fra Lonza Biosciences (Allendale, NJ). VCap-celler ble opprettholdt i DMEM media supplert med 10% føtalt bovint serum. LNCaP, PC-3 og DU-145-celler ble holdt i RPMI-medium supplert med 10% FBS og 1% HEPES. HUVEC-celler ble dyrket i EBM-2 (Lonza media) supplert med EGM-2 kule kit (Lonza) inneholdende vekstfaktorer, antibiotika og 5% FBS.
Western-Blot
Protein lysater ble fremstilt og western-blots utført som tidligere beskrevet [23]. ERG (sc-354), ETV1 (sc-1953) FLI1 (sc-356), plattformer (sc-5241) og aktin (sc-1615) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). Anti-Plau antistoff ble kjøpt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ).
mRNA isolert og qPCR
mRNA ble isolert ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California) og cDNA ble fremstilt ved bruk transcriptor første- cDNA syntese kit (Roche, San Francisco, CA) i henhold til produsentens protokoll. QRT-PCR ble utført ved hjelp av SYBR grønn (Roche) på en Mastercycler realplex
4 instrument (Eppendorf, New York, New York). Genekspresjon var normalisert til aktin. Primerpar er oppført i Tilleggs Tabell S1.
Omorganisering status
Genomisk DNA ble isolert fra PC-3, LNCaP og Vcap celler ved hjelp av veiviseren for genomisk DNA ekstraksjon kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens protokoller. PCR ble utført ved anvendelse av primere som flankerte omleirings-områder. Primer sekvenser kan bli funnet i Tilleggs Tabell S1.
Binding Kinetics
Steady state bindingsaffiniteter ble målt på en Biacore T100 instrument. Rekombinant ERG og ETV1 (Origene, Rockville, MD) proteiner ble immobilisert på CM5 chips ved aminkobling og 6 forskjellige konsentrasjoner av YK-4-279 ble injisert over overflaten i duplikater. SPR sensorgrams og K
D-verdier ble oppnådd ved bruk av Biacore T100 programvare.
Luciferase Assay
i Cos-7-celler ble ko-transfektert med et plasmid som uttrykker lentiviral den mest vanlig å finne avkortet ERG mRNA, og en vektor inneholdende ID2 gen-promotoren som driver ekspresjon av et luciferase-gen. Transfeksjon ble utført ved anvendelse Fugene 6 (Roche) i henhold til produsentens protokoller. En lentiviral vektor som uttrykker LacZ ble anvendt som en negativ kontroll. Celler ble tillatt å uttrykke ERG i 48 timer og deretter de ble behandlet med 10 uM YK-4-279. Luciferase-aktivitet ble målt etter 24 timer ved å bruke en dobbel luciferase-assay kit ifølge produsentens protokoll (Promega, Madison, WI). Resultater ble normalisert til total proteinkonsentrasjon. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 4.0.
Androgen og YK-4-279 behandling
For androgen behandling, celler ble sådd i fenol-rød frie medier som inneholder 10% trekull-strippet FBS og lov til å feste til cellekultur fatet over natten. Deretter ble cellene serum sultet i 48 timer i fenol-rødt frie media og deretter stimulert med 10 nM R1881 (Sigma, St-Louis, MO) i 2 dager.
YK-4-279 ble oppløst i DMSO å forberede 10 mM lager. Logaritmisk voksende celler ble behandlet med 1 mikrometer eller 10 um YK-4-279 for 48 timer før vurdering for genekspresjon.
siRNA ERG knockdown
Transient ERG knockdown ble utført ved hjelp av en egendefinert siRNA (5′-CGACATCCTTCTCTCACAT-3 «) som er rettet mot den C-terminale ende av ERG (Dharmacon, Lafayette, CO) [21]. 50 nM siRNA ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoller. Celler ble analysert for ERG knockdown 5 dager etter transfeksjon med siRNA.
Transient ERG Expression
PC-3 celler ble transfektert med et pLenti6 /V5-MÅL plasmid (Invitrogen) uttrykker den mest vanlige funnet avkortet ERG isoform. Transfeksjon ble utført med Fugene 6 reagensen (Roche) i henhold til produsentens protokoller i 48 timer.
HUVEC Invasion
Den anti-invasiv potensialet i YK-4-279 ble målt ved hjelp av teknikken med elektrisk celle impedans sensing (ECIS) på ECIS Z instrument (Applied biofysikk, Troy, NY) og xCELLigence system (Roche). Kort sagt ble 250000 HUVEC-celler sådd ut i 8W10E + rekker med elektrodekrets på bunnen av brønnen for å måle elektrisk motstand. Etter dannelsen av et sammenflytende monolag HUVEC (app. 21-24 timer), ble de invaderende prostatakreftceller tilsatt med en tetthet på 100.000 celler per brønn i DMEM eller RPMI-medium inneholdende de angitte medikamentkonsentrasjoner. Tumorceller ble forbehandlet i 24-48 timer med YK-4-279 før tilsetning. Dette tidspunkt av tumorcelle tilsetning ble akseptert som 0 time av behandlingen og invasjon ble overvåket i løpet av de følgende 12 timer ved å måle forandringer i motstanden ved celle-elektrode interfase. Forsøkene ble utført i duplikater. Resistance ble normalisert til tidspunktet for tilsetting av invadere celler.
Scratch analysen
Celler ble belagt og lov til å danne en konfluent mono-lag. Den celleoverflaten ble skrapet ved anvendelse av en pipettespiss P-200. Celler ble tillatt å fylle riper området og overvåket i løpet av 72 timer. Bilder ble tatt med et Nikon Eclipse Ti mikroskop (Nikon, Melville, New York). Cellemotilitet ble kvantifisert ved å måle avstanden mellom de trekkende cellegrensene.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
PC-3 celler ble transfektert med et pLenti6 /V5-MÅL plasmid (Invitrogen) uttrykker oftest forkortet ERG isoform. Transfeksjon ble utført under anvendelse av Fugene 6-reagens (Roche) i henhold til produsentens protokoller for 24 timer. Cellene ble deretter behandlet i 6 timer med 10 uM kjøretøy eller YK-4-279. Brikken ble utført ved hjelp av EZMagna Protein en chip Kit fra Millipore i henhold til produsentens instruksjoner. Immunoutfelling ble utført ved anvendelse av 2 ug av ERG antistoff (SC-354x, Santa Cruz Biotechnology), 2 ug Normal kanin IgG (Sigma Aldrich) og 1 ug Pol II (Millipore). PCR ble utført ved anvendelse av primere tidligere publiserte for positiv ERG binding ved plau promoteren i prostataceller [9]. En PCR-profil av 94 ° C-5 min: en syklus, 94 ° C-30 sek, 55 ° C-30 sek, 72 ° C-1 min: 35 sykluser, 72 ° C-5 min: en syklus ble benyttet videre en Eppendorf Realplex4 termo
Statistical Analysis
grupper ble sammenliknet med en tosidig t-test (Prism 4, GraphPad Software, La Jolla, CA) og p. 0,05 ble betraktet som signifikant .
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
SPR sensorgrams for YK-4-279 binding til ERG og ETV1. Steady state bindingsaffiniteter ble målt ved å injisere 6 forskjellige konsentrasjoner av YK-4-279 i løpet av rekombinante ERG og ETV1 proteiner immobilisert på overflaten av CM5 brikker i en Biacore T100 instrument. SPR sensorgrams ble oppnådd ved hjelp Biacore T100 programvare
doi:. 10,1371 /journal.pone.0019343.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
YK-4-279 er ikke en cellegift. VCap (10.000 celler /brønn), LNCaP-høy passasje (10.000 celler /brønn), LNCaP-lav passasje (10.000 celler /brønn) og PC-3 (5.000 celler /brønn) celler ble sådd ut over natten i xCELLigence E-16 plater og lov til å følge den godt bunnen. Den xCELLigence E-16 platene godt bunnen er dekket med miniatyr gull-elektroder som måler endringer i elektrisk motstand på overflaten av elektrodene. Endringer i elektrisk motstand er representert som en dimensjonsløs parameter betegnet celle-indeks, og er direkte proporsjonal med arealet av godt bunn dekket av elektroder. Omtrent 20 timer etter såing prostatakreftceller, ble kultur media erstattet med ferske medier som inneholder 1 um (LNCaP, PC-3) eller 10 mm (Vcap) YK-4-279. Celleproliferasjon ble overvåket i løpet av 72 timer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0019343.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
YK-4-279 hemmer LNCaP cellemotilitet. Celler ble sådd ut og tillatt å danne et konfluent monolag. Celler ble behandlet med 10 ug /ml mitomycin-C i 2 timer før bunnen assay, som beskrevet tidligere [24], [25]. Etter mitomycin-C-behandling, ble friskt medium tilsatt og den celleoverflaten ble skrapet ved anvendelse av en pipettespiss P-200. Celler ble tillatt å fylle riper området og overvåket i løpet av 60 timer. Cellemotilitet ble kvantifisert ved å måle arealet av bunnen som ikke er dekket med migrerende celler .. motilitet ble uttrykt relativt til bærerbehandlede betingelser. *; p 0,0001
doi: 10,1371 /journal.pone.0019343.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
ERG samhandler med RHA i Vcap celler. Yk-4-279 blokkerer ikke samspillet mellom ERG og RHA. 9 x 10
7 VCap-celler ble sådd i 15 cm skåler og fikk feste seg og spre seg i 48 timer. Celler ble behandlet med 10 uM YK-4-279 i 24 timer. Immunpresipitasjon ble utført som tidligere beskrevet [11]
doi:. 10,1371 /journal.pone.0019343.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
YK-4-279 hemmer ikke ERG eller ETV1 binding til DNA. a) Rekombinant ERG eller ETV1 proteiner ble immobilisert på overflaten av en Biacore CM5 chip ved aminkobling. Vill-type dobbelt-trådede oligonukleotider (ATGTAGACCGGAAGTAACTA) inneholdende konsensus Ets bindingssete «GGAA» ble injisert i 5 uM triplikater over overflaten av brikken i nærvær eller fravær av 50 pM YK-4-279. Binding av DNA rekombinante ERG eller ETV1 ble målt ved anvendelse av Biacore T100 programvare.
