Abstract
urokinase plasminogen aktivator reseptor (uPAR) spiller en rolle i tumorprogresjon og er blitt foreslått som et mål for behandling av kreft. Vi har nylig beskrevet utviklingen av en ny humanisert monoklonalt antistoff som er rettet mot uPAR og har anti-tumoraktivitet i flere xenograft dyretumormodeller. Dette antistoff, ATN-658, ikke hemmer ligand binding (dvs. uPA og vitronectin) til uPAR og virkningsmekanismen er fortsatt uklart. Som et første skritt i å forstå anti-tumor aktivitet av ATN-658, setter vi ut for å identifisere epitop på uPAR til hvilke ATN-658 binder. Guidet av sammenligninger mellom primat og menneskelig uPAR ble Epitopkartlegging studier utført ved hjelp av flere ortogonale teknikker. Systematisk nettstedet regissert og alaninskanning mutagenese identifisert regionen aa 268-275 av uPAR som epitop for ATN-658. Ingen kjent funksjon er tidligere blitt tilskrevet denne epitopen Strukturelle innsikt i epitop anerkjennelse ble oppnådd fra strukturstudier av Fab-fragmentet av ATN-658 bundet til uPAR. Strukturen viser at ATN-658 binder seg til DIII domenet av uPAR, nær C-terminalen av reseptoren, bekreftende epitopen kartleggingsresultatene. Intriguingly, når de er bundet til uPAR, de komplementaritetsbestemmende region (CDR) regioner av ATN-658 tett etterligne bindings regioner av integrin CD11b (αM), en tidligere identifisert uPAR ligand antas å være involvert i leukocytt rullende, migrasjon og komplementfiksering med ingen kjent rolle i tumorprogresjon av faste tumorer. Disse studiene viser en ny funksjonell epitop på uPAR involvert i tumorprogresjon og demonstrere en tidligere ikke-strategi for den terapeutiske målretting av uPAR
Citation. Xu X, Cai Y, Wei Y, donere F, Juarez J, Parry G, et al. (2014) Identifisering av en ny epitop i uPAR som et mål for Kreft Terapeutisk monoklonalt antistoff ATN-658, en strukturell homolog av uPAR Binding Inte CD11b (αM). PLoS ONE 9 (1): e85349. doi: 10,1371 /journal.pone.0085349
Redaktør: Francesco Bertolini, European Institute of Oncology, Italia
mottatt: 10 april 2013; Godkjent: 04.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra NIH (HL086584) til MH, NCI (CA125564), til Harold Chapman (YW) og (CA151461) til (TVO og APM) og og H Foundation og Lynn Sage Breast Cancer Foundation (APM). Dette arbeidet ble støttet av tjenestene til tumorbiologi Kjerne (TBC) fra Northwestern University som drar nytte av filantropiske støtte av Robert H. Lurie Cancer Center og Kjemi til livsprosesser Institute. X-ray data for denne studien ble målt ved beamline × 29 av National Synchrotron Light Source og APS SER-CAT beamline 22ID. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Fernando donere, Jose Juarez, Graham Parry og Andrew P. Mazar ble ansatt av Attenuon på tidspunktet for undersøkelsen. Andrew Mazar og Thomas O’Halloran har eierandel og Andrew Mazar mottar konsulenthonorarer fra Tactic Pharma, et nystartet selskap som nå eier rettighetene til ATN-658. Andrew Mazar er en oppfinner på utstedt patent for ATN-658. Flere amerikanske patenter er bevilget kjørt ATN-658, så vel som epitopen. Disse patentene er amerikanske # 8101726 «ligander bindende kompleks av urokinase plasminogen aktivator (uPA) og dens reseptor (uPAR) som hemmer nedstrøms uPAR interaksjoner: identifisering og bruk i diagnose eller terapi» (Parry og Mazar) og US # 8105602 «Urokinase plasminogenaktivator-reseptor-epitop, monoklonale antistoffer avledet derfra og fremgangsmåter for anvendelse derav »(Parry og Mazar). Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
metastase og angiogenese deler mange felles fenotypiske egenskaper som fører til den invasjon og migrering av tumor og endotelceller. Disse inkluderer oppregulering av protease og integrin uttrykk, tap av celle-celle og celle-matriks-kontakter, en økning i respons til vekst og differensieringsfaktorer, og ombygging av ekstracellulær matriks (ECM) og basalmembran (BM) [ ,,,0],1], [2]. Den urokinase-plasminogen-aktivator (uPA) system, som består av uPA, en spesifikk celleoverflatereseptor for uPA (uPAR), og Serpin inhibitorer av uPA slik som plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1) spiller en sentral rolle i mange av disse aktivitet [3] – [6]. Aktiviteten av dette systemet er ansvarlig for å initiere kaskader som resulterer i aktivering av plasminogen og flere pro-metallproteaser (proMMPs) [7], [8], frigjøring og behandling av latente vekstfaktorer deponert i ECM slik som FGF-2, VEGF, HGF, og TGF-β [9] – [12] og ombygging komponenter av ECM slik som vitronektin og fibronektin [13], [14]. Disse aktivitetene er generelt formidlet av den proteolytiske funksjon av uPA når de er bundet til uPAR, kan moduleres ved inhibering av uPA av PAI-1, og forekommer i det ekstracellulære miljø. I tillegg uPAR interagerer også med mange andre ligander i tillegg til uPA inkludert flere griner slik som α5β
1, α3β
1, og α5β
3 [15] – [17], så vel som andre celle overflate og ECM-ligander inkludert vitronektin og G-protein-koblede reseptorer [6]. Flere av disse interaksjonene er blitt demonstrert å være viktige for tumorcelleoverlevelse, invasjon, og angiogenese [6], og involvere uPAR-avhengig signalisering.
Av disse grunner uPAR har vært foreslått som et terapeutisk mål for behandling av kreft. Imidlertid, til tross for en overflod av litteratur demonstrere viktigheten av uPAR i utviklingen av de fleste faste kreftformer, inkludert bryst [18], tykktarm [19], prostata [20], bukspyttkjertel [21], eggstokk [22], lunge [23] og hjerne [24] så vel som flere hematologiske ondartede sykdommer slik som akutt leukemi og myelom [25], ingen uPAR målrettede terapeutiske midler har blitt utviklet eller evaluert hos kreft kliniske studier til dags dato. En rekke antistoffer som direkte inhiberer bindingen av uPA til uPAR har vært foreslått og testet i prekliniske forsøk, men de fleste av disse har bare vist moderat antitumor-aktivitet og er derfor aldri ført inn i klinikken.
Nylig vi identifiserte og utviklet en ny uPAR rettet monoklonalt antistoff som viser sterke antitumor-virkninger i en rekke forskjellige dyretumormodeller, men ikke blokkerer bindingen av uPA til uPAR [22], [26] – [28]. Dette antistoff, ATN-658, har flere unike egenskaper som skiller den fra forrige uPAR målrettet tilnærminger. Et viktig trekk er at ATN-658 er at den ikke blokkerer uPA binding til uPAR og er i stand til å binde seg til uPAR selv når det er okkupert av uPA, men likevel hemmer migrasjon og invasjon
in vitro product: [22] , [27]. ATN-658 har ingen virkning på uPA mediert plasminogenaktivering, men har en rekke effekter på signaliseringsreaksjonsveier og ekspresjon av forskjellige gener involvert i tumorprogresjon når de evalueres i modeller av prostata og eggstokkreft
in vitro
og
in vivo product: [22], [27]. Et av de mest slående observasjoner med ATN-658 er at den farmakologiske målretting av uPAR av dette antistoff fører til sterke antitumoreffekter i et bredt spekter av solide tumor xenograft-modeller [22], [26] – [28]. Antitumor-effekter har blitt observert uavhengig av tumorhistologi i disse modellene, og i tillegg til inhibering av metastase
in vivo
, som ville bli forutsett for et uPAR målrettet middel, ATN-658 er også i stand til å hemme tumor proliferasjon og indusere apoptose [22], [26], [28]. Men den strukturelle og mekanistisk grunnlag for disse antitumor effekter fortsatt uklare.
For å løse dette problemet, preget vi epitop på uPAR til hvilke ATN-658 binder. Epitopen for ATN-658 ble først kartlagt ved hjelp av seterettet mutagenese, og bekreftet ved en ny deuterium-utveksling massespektrometri teknikk (H /D-utveksling massespektrometri ExSAR). Denne epitopen ble bestemt til å være en epitop hvor ingen funksjon i uPAR har tidligere blitt beskrevet. I tillegg har vi fastslått at krystallstrukturer av ATN-658 Fab-fragment alene og i kompleks med uPAR, den amino-terminale (uPAR-bindende domene) av uPA (ATF), og somatomedin B domene (SMB) av vitronektin. ATN-658 Fab bindes til DIII av uPAR, i samsvar med den epitop kartleggingsresultatene. Den epitop på uPAR for ATN-658 er nær den C-terminale ende, og har ingen overlapping med urokinase og vitronektin bindingsseter. Denne studien viser også strukturell homologi mellom ATN-658 CDR looper og uPAR bindende regionen inte αM. Videre viste vi at ATN-658 bindende blokkerer sammenslutning av en annen inte, α5β1, til uPAR og dermed svekker inte α5β1-mediert adhesjon til ekstracellulære matrise. Disse resultatene tyder på en tidligere ikke mekanismen som uPAR kan fungere i tumorprogresjon og en roman epitop for den terapeutiske målretting av denne reseptoren.
Materialer og metoder
Cellelinjer
humane tumorlinjer PC-3 (prostata adenokarsinom), HeLa (cervikal karsinom), og humane lungekreft-cellelinje H1299 ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Begge cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles minimal medium supplert med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin. Musetumorcellelinje B-16 (melanom), hundeosteosarkom (D-17) og udødelig afrikansk grønn ape (AGM) nyreceller (COS-1) ble bekreftet å uttrykke uPAR ved RT-PCR og western blot ved anvendelse av et polyklonalt kanin uPAR antiserum (rD2D3) som er kjent for å kryssreagere med uPAR fra flere arter som tidligere beskrevet [29]. uPAR-uttrykkende celler ble deretter brukt til å evaluere evnen til ATN-658 for å kryss-reagere med forskjellige ikke-humane uPAR. Både rekombinant løselig uPAR (Supar, rester 1-277) og ATF (aminosyreresidier 1-143 av uPA) ble produsert i Drosophila S2 celler som utskilte proteiner
E.Coli product: [31].
Karakterisering av monoklonalt antistoff ATN-658
ATN-658 ble reist mot en chymotryptisk fragment av løselig uPAR (Supar) bestående DIIDIII (aa 88-283 av modne uPAR) uttrykt i
Drosophila
S2-celler, ved hjelp av standard teknikker. I korthet, ble Balb /c-mus immunisert med suPARDIIDIII fragmenter konjugert til KLH, og størrelsen av immunresponsen overvåket ved ELISA. Basert på disse dataene ble generert hybridomer ved å fusjonere miltceller med en myelomcellelinje P3x63Ag8.653. Frosne bestander av 10 foreldre hybridomer ble gjort og fem, og ble renset som beskrevet [30]. SMB-domene protein (aminosyreresidiene 1-50 av humant vitronektin) var en velvillig gave fra Dr. Aiwu Zhou, uttrykt i av hybridomene som utsettes for begrensende fortynning. Vevskultur-supernatanter fra disse monoklonale antistoffer ble deretter testet for aktivitet i ELISA-analyser og isotypen av hvert antistoff bestemt ved bruk av IsoStrips (Roche) .ATN-658, isotype IgG1κ, bundet Supar immobilisert på plast med en K
D i ~ 1 nM og joderte ATN-658 spesifikt bundet uPAR på overflaten av HeLa-celler med en K
D ~ 5 nM. Den Kd på ATN-658 for Supar ble også bekreftet ved hjelp av overflate-plasmonresonans (BIAcore). Western blot-analyse viste at ATN-658 var spesifikt for humant uPAR og ikke kryssreagerer med mus uPAR. ATN-658 ble renset fra vev kultursupernatant ved kolonnekromatografi under anvendelse av protein-A Sepharose, typiske utbytter varierte 60-120 mg /L av vev kultursupernatanten og renheten av sluttmaterialet var mer enn 95% som bestemt ved HPLC. Biotin-ATN-658 ble utarbeidet for hele cellebindingsanalyser og for flowcytometri som tidligere beskrevet [27].
Utarbeidelse av ATN-658 Fab-fragmenter
ATN-658 Fab-fragmenter ble utarbeidet av omfattende proteolytisk spaltning av det rensede antistoff (5 h, 37 ° C) med immobilisert Papain (Pierce). ATN-658 Fab-fragmenter ble separert fra de antistoff-Fc-domener av protein A-affinitetskromatografi, og de rensede Fab-fragmenter som kjennetegnes ved SDS-PAGE. For å bekrefte at de rensede ATN-658 Fab-fragmenter beholdt evnen til å binde uPAR med høy affinitet vi utført konkurranseanalyser ved bruk av biotinylert ATN-658 [27] og immobilisert Supar. Proteinet ble konsentrert til 5 mg /ml ved å bruke Millipore Ultrafree sentrifugal filtre for protein krystallisering.
Evaluering av binding av ATN-658 til celler in vitro
artsspesifisitet av ATN-658-binding var evaluert ved hel cellebindingsanalyser eller strømningscytometri, som tidligere beskrevet [27]. Hele cellebindingsanalyser ble utført på celler (300 000 /brønn) sådd ut på gelatin belagte 12-brønners plater (Costar # 3516) og tillatt å feste over natten. Etter grundig vasking med Hanks bufret saltoppløsning (HBSS; Invitrogen, Inc.) inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) adherente celler ble inkubert med varierende konsentrasjoner av biotin-merket ATN-658 i HBSS /0,1% BSA i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking 3 ganger med HBSS /0,1% BSA-celler ble inkubert med HRP-konjugert streptavidin i ytterligere 0,5 timer ved romtemperatur, brønnene vasket som beskrevet ovenfor og bundet antistoff detektert ved inkubasjon med OPD-substrat (Sigma). Etter fargeutvikling 0,1 ml av substratet ble overført fra hver brønn til en 96-brønners plate, ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 20 ul 1MH
2SO
4 og absorbansen ved OD-490 nm registreres. Før flowcytometri adherente celler ble høstet med trypsin og resuspendert i FACS-buffer (2% føtalt bovint serum i PBS). Celler (2 x 10
6-celler i 200 ul FACS-buffer) ble inkubert med ATN-658 (sluttkonsentrasjon 10 ug /ml), kontroll mus IgG, et kanin polyklonalt antistoff (1:100 fortynning) dannet mot et fragment av human uPAR (rDIIDIII) eller normalt kaninserum (NRS) i 1 time ved 4 ° C. Etter inkubering ble cellene vasket tre ganger med 1 ml FACS-buffer og resuspendert i 100 ul FACS-buffer inneholdende enten geite-anti-kanin eller geit anti-mus Alexa Fluor 488 konjugerte sekundære antistoffer (Invitrogen, Inc.) og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Cellene ble vasket som beskrevet ovenfor og resuspendert i 0,5 ml FACS buffer før oppkjøpet av flowcytometri data.
seterettet mutagenese studier av ATN-658 binding til Primate uPAR
afrikansk grønn ape ( AGM) Supar ble klonet fra COS-1-celler ved PCR, sekvensert og proteinet uttrykkes som tidligere beskrevet for human Supar [30], [32]. Seterettet mutagenese av generalforsamlingen Supar plasmid malen ble utført ved hjelp av en QuikChange seterettet mutagenese kit (Stratagene, Inc.), i henhold til produsentens instruksjoner, for å generere ni mutanter der hver aminosyre unik for generalforsamlingen Supar ble erstattet av den tilsvarende menneskelige Supar sekvens. Sekvensering og restriksjons fordøyelse av hver muterte plasmidet ble anvendt for å bekrefte sekvensen endring, og at resten av sekvensen forble intakt. AGM mutant Supar cDNA ble deretter subklonet inn i en Drosophila ekspresjonsvektor (pMT /BiP /V5-HISA) inneholdende V5 epitopen flagget og anvendt for å transfektere S2-celler. Liten skala (500 ml) ristekulturer ble etablert for å produsere protein for eksperimenter og protein ekspresjon ble bekreftet ved western blot ved anvendelse av en pAb [29] mot uPAR som kryssreagerte med primat Supar. Kultursupernatanter (CS) for hver klon ble klaret ved sentrifugering, og alikvoter immun-utfelles ved hjelp av ATN-658 og protein-G Sepharose. Bundede proteiner ble påvist ved western blot ved anvendelse av det kryssreagerende kanin anti-DIIDIII polyklonalt antistoff er beskrevet ovenfor. En annen uPAR MAb, ATN-615, som også er artsspesifikt for human uPAR og hvor epitopen var allerede kjent fra røntgenkrystallografi studier [33], [34], ble brukt som en kontroll for å validere denne IP-metoden.
Alternativt kultursupernatantene ble analysert ved capture ELISA ved anvendelse av et anti-V5-antistoff og biotinylert anti-uPAR antistoffer ATN-658 og ATN-617. ATN-617 [27] er et monoklonalt antistoff som bindes til en forskjellig epitop på uPAR og kryssreagerer med AGM Supar. Plater ble belagt med V5-antistoff (1 mg /ml) i PBS (100 ul brønn i en 96-brønners EIA /RIA høy bindingsplate). Etter 3 timers inkubering ved romtemperatur, ble brønnene vasket og deretter inkubert med 1 x kasein /vann (200 pl /brønn) i 2 timer ved RT for å blokkere ikke-spesifikk binding. Brønnene ble vasket, og 100 ul kultursupernatant ble tilsatt til hver brønn og inkubert O /N ved 4 ° C. Kultursupernatanter ble anslått å inneholde ~3 ug /ml Supar. Biotin ATN-658 eller biotin-ATN-617 (1 ug /mL) ble deretter tilsatt til brønnene og inkubert i ytterligere 0,5 timer ved romtemperatur, etterfulgt av omfattende vasking. Til slutt, ble streptavidin-HRP tilsatt, og etter ytterligere inkubasjon og vasking ble farge utviklet ved hjelp av OPD og bundet ATN-658 eller bundet ATN-617 ble påvist ved å målte absorbansen ved 490 nm, som tidligere beskrevet [27].
Epitopkartlegging av ATN-658 etter H /D-utveksling massespektrometri (H /D-Ex)
1,5 mg ATN-658-Fab-fragment ble immobilisert på 200 mg POROS AL-harpiks (Applied Biosystems) ifølge produsentens instruksjoner. Pull-down eksperimenter ble utført ved anvendelse av Supar-DIIDIII for å bekrefte spesifisiteten og bindingskapasiteten av affinitetskolonnen. ATN-658 Fab-konjugerte kuler (353 ul) ble resuspendert i 700 ul av deuterert fosfatbuffer (50 mM KH
2PO
4, 50 mM NaCl, pH 7,4) og fikk innstilles til likevekt ved 4 ° C.suPAR- DIIDIII ble resuspendert i 40 pl D2O pH 7,4 (Cambridge Isotopes) for enten 150, 500, 1500 eller 5000 sekunder for å tillate fullstendig deuterering av overflate amider. Merket Supar-DIIDIII og tilhørighet harpiks ble deretter blandet sammen i 10 min ved 4 ° C. Tilbake utveksling av løsemiddel eksponerte amider ble utført ved å erstatte
2H fosfatbuffer med H
2O og inkubering ved 4 ° C i en tid som er lik den markeringstrinn. Et kontrollforsøk ble utført ved å binde umerket Supar-DIIDIII til ATN-658 Fab-konjugerte perler og merke den bundne materiale ved inkubasjon med 700 ul av deuterert fosfatbuffer i de tidsrom som er oppført ovenfor. Tilbake utveksling ble deretter gjennomført som beskrevet. Reaksjonene ble stanset og Supar-DIIDIII eluert fra affinitetskolonnen ved anvendelse av 40 ul 0,8% maursyre. Etter tilsetning av 20 pl 8 M urea, 1 M TCEP, pH 3,0 det eluerte materialet ble injisert i Hydrogen /Deuterium bytte massespektrometri (H /D-Ex) plattform (ExSAR, Monmouth Junction, NJ) som består av tandem immobilisert pepsin og C18 separasjonskolonner. Det fordøyde fragmenter ble separert og analysert ved massespektrometri og identiteten til hver topp er identifisert ved sammenligning med data oppnådd i kontrollforsøk ved bruk av deuterium-merket og umerket Supar-DIIDIII spaltet med pepsin.
Protein krystallisering og røntgen datainnsamling
Supar-ATF-komplekset ble dannet ved inkubering av ATF med Supar ved romtemperatur i 50 mM HEPES og 100 mM NaCl pH 7,4 og ble renset på en Superdex 75 gelfiltreringskolonne. Den eluerte-kompleks ble deretter tilsatt overskudd av ATN-658 Fab, og den ternære komplekset ATN-658-uPAR-ATF ble renset på nytt på en Superdex 200 gelfiltreringskolonne. Før krystalliseringen, SMB ble tilsatt til det ternære kompleks ved en 02:01 molforhold, og deretter konsentrert til 10 mg /ml uten noen ytterligere rensing. Krystalliseringen ble utført ved anvendelse av den sittende rulle dampdiffusjon Fremgangsmåte ved 22 ° C. De diffraksjon kvalitet ATN-658 Fab krystaller ble generert ved hjelp av 20-22% PEG 3350, 0,1 M Tris pH 8,0-8,5. For krystallisering av ATN-658-uPAR-ATF-SMB kvaternære kompleks, protein ved 10 mg /ml ble blandet med et like stort volum av reservoaret oppløsning inneholdende 0,1 M HEPES pH 7,5, 55% (v /v) Tacsimate, og 2 % (v /v) 2-metyl-1,3-propandiol. Triangle krystaller ble vanligvis dukket opp etter et par måneder, og vokste til en endelig størrelse på 0,15 × 0,15 × 0,15 mm
3.
ATN-658 Fab krystaller ble cryo-beskyttet med tillegg av 20% glyserol til moderluten. Diffraksjon data ble samlet inn ved 100 ° K på Advanced Photon Kilder (beamline 22-ID, SER-CAT) .X-diffraksjon datainnsamling for komplekset ble utført ved 100 K på NSL Brookhaven National Laboratory (bjelke linje × 29 ). De fleste ATN-658-uPAR-ATF-SMB kvartære krystaller diffracted veldig svakt, vanligvis mindre enn 6 Å. Dette er antagelig på grunn av høye løsningsmiddelinnhold (76% løsningsmiddel) og tilstedeværelsen av en lengdeakse av krystallene (c = 391,58 a). Etter utallige forsøk med ulike krystaller, ulike datainnsamlingsstrategier og utforskning av ulike kryo-beskyttelsesløsninger. Diffraksjonsdata ble oppsamlet fra en flash-kjølt krystall som ble cryo-beskyttet av en sekvensiell bløtlegging i moderluten med økt konsentrasjon av etylenglykol til den endelige konsentrasjon på 10% (v /v) til 4,6 Å-oppløsning. De diffraksjon data ble indeksert og behandlet ved hjelp av HKL2000 programmet [35]. Datainnsamlingen og endelige struktur raffinement statistikk for begge strukturene er integrert i tabell 1.
Struktur besluttsomhet og raffinement
De strukturer av ATN-658 Fab ble løst ved molekylær erstatning metode (MOLREP [36] av CCP4 program suite [37]) ved hjelp av et antistoff struktur (PDB oppføring 2DDQ) som et søk modell. Modellen ble deretter utsatt for flere runder med manuell bygningen ved hjelp av Kvakk [38] vekslet med behersket raffinement hjelp Refmac5 [39]. I de siste sykluser av raffinement, TLS med tyve TLS-grupper for hver kjede (genereres av TLS bevegelse bestemmelse (TLSMD) server [40] ble inkludert i raffinement.
Dette ATN-658 Fab struktur ble så brukt som en molekylær erstatningsmodell for å løse strukturen av det kvaternære kompleks (ATN-658-uPAR-ATF-SMB) ved molekylær utskiftning metode under anvendelse av programmer MOLREP [36] og CNS [41]. en Supar-ATF-modellen (PDB entry 1fd6 [ ,,,0],33]) ble deretter plassert inn i krystallene av de kvaternære komplekser ved molekylær utskiftning (molrep [36]). til tross for den lave oppløsning av denne krystall (4,5 Å), ble det oppnådd meget sterke molekylære erstatnings løsninger for begge modeller. etter raffinering ved hjelp av CNS-programmet [41], den Fo-Fc forskjell elektrontettheten viste elektrontettheten for SMB domene vitronectin, noe bekrefter de riktige molekylære erstatningsløsninger. de resulterende modeller med alle fire proteinkomponenter ble videreutviklet ved hjelp av CNS v1.3 [41] og REFMAC [39], og justeres manuelt av programmet O [42] eller Kvakk [38].
Alle endelige strukturer ble analysert og validert av PROCHECK [43], PYMOL [44] og MOLSOFT ICM [45] . Koordinatene for den rapporterte strukturen har blitt deponert i Protein Data Bank (PDB). Den endelige statistikk, validering, og stereokjemiske kvalitet for strukturen er rapportert i tabell 1.
Co-immunutfelling
HT1099-celler ble lysert i Triton lyseringsbuffer (50 mMHepes, pH 7,5, 150 mM NaCl og 1% Triton X-100) supplementert med proteasehemmere og 1 mM PMSF. Avklart lysatene ble immunopresipitert med antistoffer ATN-615 og ATN-658. Immunopresipitatene ble blottet for uPAR (R2) eller integrin α5 (pAb).
Celleadhesjon assay
celleadhesjon Analysen ble utført som tidligere beskrevet [46]. I korte trekk, ble H1299-celler inkubert i DME /0,1% BSA med 500 uM RGD eller RAD peptider i 1 time ved 37 ° C og ble deretter sådd ut på fibronektin (5 ug /ml, Sigma) -belagte plater med eller uten ATN-615 . Etter vasking, ble festet cellene fiksert og farget med Giemsa. Dataene ble kvantifisert ved å måle absorbans ved 550 nm.
Resultater
ATN-658 binder seg ikke til ikke-menneskelige uPAR
Innledende studier evaluert bindingen av ATN-658 til celler fra forskjellige arter som uttrykte uPAR. uPAR-ekspresjon ble bekreftet i alle cellelinjene først ved RT-PCR etterfulgt av western blot ved anvendelse av et kanin anti-humant uPAR-Pab (rD2D3) som kryssreagerer med uPAR fra gnagere og hund. Denne undersøkelsen ble gjennomført for å identifisere mulige dyrearter som kan brukes for fremtidige toksikologiske studier av ATN-658. Biotin-ATN-658, som beholdt den fulle bindingsaktiviteten til umodifisert ATN-658 [27] ble anvendt for denne evalueringen. Biotin-ATN-658 ble ikke bundet til mus melanom (B16) celler (Fig. 1A) eller afrikansk grønn ape (AGM) (Fig. 1B) immortaliserte nyreceller (COS-1) i hele celler av metningsbindingsforsøk, mens metningsbindings ble observert til uPAR uttrykker human prostatacancercellelinje, PC-3 (figur 1 A B. Spesifisiteten til ATN-658 ble målt ved direkte bindingsanalyser ved bruk av uPAR-uttrykkende mus melanom (B16) human prostata carcinoma (PC-3) og afrikansk grønn ape (COS-1-celler) og biotin-merkede ATN-658. B. FACS-analyse ble utført ved anvendelse av HeLa-celler (som uttrykker human uPAR), D-17 lunge carcinoma celler (som uttrykker canine uPAR og COS-1 celler. Hver cellelinje ble inkubert med normalt kaninserum (NRS), et kanin-polyklonalt antistoff dannet mot et fragment av humant uPAR (rDIIDIII), muse IgG (mIgG) eller ATN-658 og det egnede FITC-merket sekundært antistoff.
Identifikasjon av epitopen for ATN-658 på human Supar ved seterettet mutagenese
Sekvens innretting av primat DIIDIII uPAR-sekvensene viste at human og AGM uPAR bare skilte seg ved ni aminosyreposisjoner (tabell 2). Disse ni aminosyrer forskjellene var tilstrekkelig til fullstendig å oppheve bindingen av ATN-658 til AGM uPAR. Således vi klonet og uttrykt AGM Supar i S2-celler og gjort ni forskjellige mutanter som sekvensielt erstattet av en aminosyre fra den AGM-sekvensen i hver mutant med det tilsvarende humane aminosyre (fig. 2A). den første vurdering av disse mutanter ble kvalitativ hvor evnen til ATN-658 for å immunoutfelle (IP) en spesiell mutant fra kultursupernatanten (CS) fra celler som uttrykker det mutant ble vurdert. ATN-615, som også er humant uPAR-spesifikk, men som hadde vi allerede identifisert epitopen [33], [34], ble anvendt for å bekrefte anvendeligheten av denne metode. ATN-615 var bare i stand til IP den H192R Supar mutant (klone 2. Fig. 2A). Dette er konsistent med det som er beskrevet epitop for ATN-615, som består av aa 187-192 (fig. 2A). Faktisk er den eneste aminosyre forskjell mellom AGM og menneskelig uPAR i denne epitop på aa 192. Tilsvarende ATN-658 var bare i stand til IP den E268K (klon 8) Supar mutant impliserer dette rest som en del av ATN-658 epitop . Alanin-scanning mutagenese rundt denne aminosyre kartlegger sekvensen fra aa 268-275 som epitopen for ATN-658 (S1). Siden IP er en kvalitativ vurdering av bindings, fange ELISA-analyser ble satt opp for å måle den faktiske affiniteten av ATN-658 for de forskjellige AGM Supar mutanter som det var mulig at kanskje mer enn aa 268 var nødvendig for å gjenopprette full bindingsaktivitet for ATN-658 når generalforsamlingen Supar sekvensen ble mutert til den menneskelige sekvens. Siden generalforsamlingen Supar mutantene ble uttrykt med en innarbeidet V5 flagg, ble en anti-V5 flagg antistoff brukes til å fange AGM Supar på fast fase. Bindingsaffiniteten kan så bestemmes for hver AGM mutant ved hjelp av metningsbindingsstudier som tidligere beskrevet for ATN-658 [27]. Ved hjelp av denne tilnærmingen, binding av ATN-658 ble kun observert å klone 8 med en K
d
~ 2 nM, ligner på K
d
av ATN- 658 for menneskelig Supar og for menneske uPAR uttrykker celler som indikerer at dette enkelt aminosyre forandring var ansvarlig for fullstendig oppheving av ATN-658 binding til AGM Supar (fig. 2B). Dette enkelt aminosyreendring ikke oppheve ATN-658-binding gjennom en global effekt på Supar konformasjon siden bindingen av ATN-617, som binder seg til DIIDIII og ikke kryssreagerer med AGM Supar, ble ikke forandret (fig. 2C).
A. Enkeltpunkt mutanter ble innført i AGM Supar slik at en enkelt aminosyre ble endret fra den AGM-sekvensen til den humane uPAR-sekvensen og proteinene uttrykt og renset som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Hver klone er identifisert ved nummer (1-9) med punktmutasjon identifisert under nummeret ved hjelp av enkelt bokstav aminosyre-kode. Med unntak av én punktmutasjon, er resten av Supar sekvens som av AGM. Supar mutantene ble uttrykt i S2-celler og supernatanter ble inkubert med enten ATN-615 eller ATN-658, etterfulgt av immunoutfelling som beskrevet i Materialer og Metoder. Supar ble så oppdaget av western blot hjelp av en kanin polyklonale antiserum mot human Supar. B. Capture ELISA-analyser ble anvendt for å måle bindingsaffiniteten av ATN-658 for de forskjellige Supar klonene beskrevet i (A). Capture på ELISA-platen var gjennom V5-koden og deteksjon brukt biotin-ATN-658. C. Biotin-ATN-617 ble anvendt i en lignende ELISA-format som beskrevet under (B) for å bekrefte at innføringen av enkeltpunktmutasjon ikke har en global effekt på Supar conformation.ATN-617 kryssreagerer med ape Supar og alle kloner syntes å beholde denne reaktivitet etter innføringen av mutasjonen.
justering av denne epitop på tvers av flere arter av uPAR bidrar til å forklare arts spesifisitet av ATN-658 binding (3). Den gamle verden primater (aper, sjimpanser) er evolusjonært nærmere mennesker og ha homolog uPAR til menneske i epitop for ATN-658. ATN-658 binding har blitt observert av immunhistokjemi til sjimpanse vev i samsvar med denne observasjonen. I motsetning til dette nye verden primater (aper, AGM) uPAR skiller seg i de fleste tilfeller ved en enkelt rest, aa 268, og dette er tilstrekkelig til fullstendig å oppheve bindingen av ATN-658. Den uPAR av lavere ordre pattedyr også forskjellig i denne posisjonen, så vel som andre i samsvar med mangel på binding av ATN-658 til uPAR eller celler som uttrykker uPAR fra disse artene også (tabell 3).
bekreftelse på ATN-658 epitop av Hydrogen /deuterium utveksling massespektrometri (H /D-Ex)
Hydrogen-deuterium (
1 H-D) utveksling er et nyttig verktøy for å identifisere proteinbindingsseter eller grensesnitt. Etter overføring fra vann til et deuterium-baserte løsningsmiddelsystem (tungtvann) et protein vil oppleve en økning i massen som de proteinhydrogenatomene blir gradvis erstattet med deuteroner. Sannsynligheten for en hydrogen-deuterium utveksling hendelse er i stor grad bestemt av proteinstruktur og væske tilgjengelighet. Forskjeller i frekvensen av amid hydrogen utveksling identifisere plasseringen av en epitop.
