Abstract
YAP er en viktig del av Hippo signalveien og spiller en avgjørende rolle i utvikling og progresjon av flere krefttyper, inkludert kreft i eggstokkene. Men effekten av YAP på eggstokkreft utvikling
in vivo
og nedstrøms effektorer fortsatt usikre. I denne studien fant vi at sterke YAP uttrykk var assosiert med dårlig eggstokkreft pasient overlevelse. Spesielt viste vi for første gang at høy YAP uttrykk nivåer var positivt korrelert med TEAD4 genuttrykk, og deres co-uttrykk var en prognostisk markør for dårlig eggstokkreft overlevelse. Hyperaktive av YAP av mutere sine fem hemmende fosforyleringsseter (YAP-5SA) økte eggstokkreft celleproliferasjon, motstand mot kjemoterapeutiske legemidler, cellemigrasjon og forankringsuavhengig vekst. I kontrast, uttrykk for en dominant negativ YAP mutant reversert disse fenotyper i eggstokkreft celler både
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre resultater antydet at YAP forårsaket disse effektene ved å fremme en epitelial til mesenchymale overgang. Dermed fremmer YAP eggstokkreft cellevekst og tumordannelse både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre høy YAP og TEAD4 uttrykk er en prognostisk markør for eggstokkreft progresjon og et potensielt mål for eggstokkreft behandling
Citation. Xia Y, Chang T, Wang Y, Liu Y, Li W, Li M, et al. (2014) YAP Fremmer Ovarian Cancer Cell tumorigenesis og er et tegn på en dårlig prognose for eggstokkreft pasienter. PLoS ONE 9 (3): e91770. doi: 10,1371 /journal.pone.0091770
Redaktør: Hongmei Wang, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kina
mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 14 februar 2014; Publisert: 12 mars 2014
Copyright: © 2014 Xia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81172473), National Basic Research Program of China (2011CB944504, 2012CB944403), og grunnforskning Finansiering av Zhejiang University (2011QN81001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epitelovarialcancer kreft (EOCs) utgjør majoriteten av ondartede ovarietumorer hos voksne kvinner og har den verste prognosen blant kvinnelige kreftformer basert på deres 5-års overlevelse. Disse pasientene ofte har uspesifikke bekken eller magesymptomer. Konvensjonelle behandlinger inkluderer vanligvis kirurgi, platina og Taxol-baserte kjemoterapi og strålebehandling. På grunn av mangel på spesifikke symptomer og effektive screening metoder, blir pasientene ofte diagnostisert når på et avansert stadium og deres prognose er enda verre enn med andre kreftformer.
Hippo veien er en nylig oppdaget signaltransduksjonsbane. De viktigste komponentene i den Hippo pathway, inkludert MST1 /2, LATS, SAV1, og YAP, er høyt konservert fra bananflue (
Drosophila
) til pattedyr [1] – [6]. MST1 /2 aktivering resulterer i fosforylering og aktivering av deres direkte substrater LATS1 /2. Aktivert LATS1 /2, i sin tur, å fosforylere og hemme YAP og TAZ transkripsjon ko-aktivator [7], [8]. YAP fremmer celleformering, hemmer cellulær apoptose, og også fremmer en epidermal-mesenchymale overgang (EMT) [9] – [12]. YAP er nært forbundet med tumorigenesis som en kritisk transkripsjon co-aktivator i Hippo veien.
Flere transkripsjonsfaktorer, inkludert ErbB4, RUNX2, TEAD familiemedlemmer, og p73, har vist seg å være YAP nedstrøms målgener [ ,,,0],13] – [16]. Fordi den mangler en DNA-bindende domene, YAP binder seg til den C-terminale region av TEAD for å regulere nedstrømsgener «transkripsjon og translasjon. Zhao
m.fl.
identifisert TEAD familietranskripsjonsfaktorer som de mest potente YAP mål og TEAD familiemedlemmer var viktige for den vekstfremmende funksjon av YAP [14], [17] -. [21]
Tidligere studier viste at YAP ble sterkt uttrykt i menneskelig eggstokkreft vev og at høy YAP aktivitet fremmet spredning og overlevelse av dyrkede eggstokkreft celler [9], [22]. Men rollen som YAP i eggstokkreft utvikling
in vivo Hotell og foreningen av YAP /TEAD med eggstokkreft pasient overlevelse ikke blitt grundig undersøkt.
I denne studien viser vi at kontinuerlig YAP aktivering induserer økt eggstokkreft celleproliferasjon, motstand mot cisplatin-indusert cellulær apoptose, tap av kontakt hemming, økt cellemigrasjon, og forankringsuavhengig vekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. I samsvar med disse resultatene, fant vi også at høy YAP uttrykk var assosiert med dårlig eggstokkreft pasient overlevelse. Videre TEAD familiemedlemmer ble også uttrykt i eggstokkreft vev. Interessant, YAP uttrykk var positivt korrelert med TEAD4 uttrykk og deres co-uttrykk ble nært knyttet til dårlig eggstokkreft pasient overlevelse. Samlet utgjør disse funnene tyder på at YAP er en viktig eggstokkreft onkogen og at YAP /TEAD4 co-uttrykk kan være en prediktor for en dårlig prognose for menneskelig eggstokkreft.
Materialer og metoder
Nude mus xenograft og
in vivo
behandlinger
nakne mus ble hentet fra sentrum av forsøksdyr, Zhejiang University.
mus ble behandlet i henhold til NIH guide for Stell og bruk av forsøksdyr, godkjent av etisk komité av Zhejiang University. Mus ble plassert i et temperaturkontrollert rom med riktig mørke-lys sykluser, matet med et vanlig kosthold, og vedlikeholdes under omsorg av Forsøksdyravdelingen, Zhejiang University, Kina. Eggstokkreft celletransplanterte mus ble examinined daglig, og ble avlivet med CO2 innånding metoden før de blir ofret. For å undersøke effekten av YAP aktivitet på svulster
in vivo
, stabile cellelinjer som uttrykte YAP-5SA eller dominant negativ YAP ble dyrket og brukt til å indusere tumorer ved implantering av 2 × 10
6 celler i 100 mL PBS subkutant inn i høyre abdominale flankene av 4-6 uker gamle hunn nakne mus. For å avgjøre om YAP har effekt på cellegift-motstand, A2780CP YAP-5SA-A C celler og kontrollceller (2 × 10
6 celler per mus i hver gruppe) ble separat inokulert (subkutant) i nakne mus. Etter at tumorene vokste til omtrent 5 mm i diameter, 3,5 mg /kroppsvekt (kg) /dag av CDDP ble administrert (i.p.) til nakne mus en gang i uken i 4 uker. Tumorstørrelser (både langsgående og tverrgående bredder) ble målt med et skyvelære.
Tissue matrise og IHC analyse
formalin-fikserte og parafin-innleiret ovarian cancer vev matrisen ble oppnådd fra US Biomax, Inc . (Rockville, MD). Vevet microarray ble immunhistokjemisk farget for YAP (# 4912, Cell Signaling), S127 fosforylert-YAP (# 4911S, Cell Signaling), TEAD1 (5178-1, Epitomics), TEAD2 (LS-C119063, Levetid biovitenskap), TEAD3 (LS -C30406, levetid biovitenskap), og TEAD4 (ab97460, Abcam). I tillegg 45 mennesker eggstokkreft prøver for oppfølging av pasientene er fra Institutt for patologi, Xijing Hospital of fjerde Military Medical University. Den eggstokkreft prøven bruk og studieprotokollen ble godkjent av etikkomiteen av Xijing sykehus og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Alle sluttresultatet av hver prøve (negativ eller positiv) ble scoret uavhengig av to patologer og vurderes ved å legge resultatet for intensiteten og omfanget av farging. Intensiteten av farging ble scoret som 0 (negativ), en (svak), eller to (sterk). Graden av farging ble scoret basert på prosentandelen av positive tumorceller: 0 (negativ), 1 (1% -30%), 2 (30% -60%), og 3 (61% -100%). Hvert tilfelle ble endelig regnet negativ hvis den endelige stillingen 0 (negativ) eller en (svak positiv) og positiv hvis sluttresultatet ble 2-3 (+) eller 4-5 (sterk positiv).
Cell linjer
Alle cellelinjer brukt i denne studien ble opprinnelig kjøpt fra ATCC. Alle cellekulturmedier var fra Invitrogen. SKOV-3-celler ble dyrket i McCoys 5A medium med 10% FBS. A2780-celler ble dyrket i DMEM høy glukose-medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin-løsning. OVCAR3-celler ble dyrket i DMEM-medium med 0,01 mg /ml insulin og 15% FBS. OVCAR8 celler ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS. Alle cellelinjer ble dyrket med 10 enheter /ml penicillin og 10 ng /ml streptomycin. Stabile cellelinjer ble dyrket i kulturmedium og velges ved å bruke forskjellige konsentrasjoner av puromycin.
celleproliferasjonsanalyse
For hver tilstand som er beskrevet ovenfor, ble cellene dyrket i triplikate brønner i 96-brønners plater ved 2000 celler /godt. Cellevekst ble bestemt ved å måle absorbansen med en plateleser (Bio-Rad) etter dyrkning i 24 timer. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver behandling.
Western Blot analyse
Celleekstrakter som inneholder 30 ug protein ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore Corp., Bedford, MA ). Etter sondering med primære antistoffer, ble membranene inkubert med pepperrotperoksidase-bundne anti-kanin-antistoffer (cellesignalisering Technologies, Danvers, MA), og deretter vasket. Bundet antistoff ble visualisert ved hjelp av en utvidet Chemiluminescence Detection Kit (Amersham). De primære antistoffer var: YAP (# 4912), S127 fosforylert-YAP (# 4911S), PARP (# 9542), kløyvde caspase-3 (# 9664), β-aktin (# AC40), E-cadherin (# 3195) , Slug (# 3195), og Snail (# 3895) fra Cell Signaling. En TEAD1 (5178-1) antistoff var fra Epitomics. TEAD2 (LS-C119063) og TEAD3 (LS-C30406) antistoffer var fra levetid biovitenskap. En TEAD4 (ab97460) antistoff var fra Abcam.
Flat koloni og myke agar kolonidannende analyser
Celler ble sådd ut i tre eksemplarer brønner i seks-brønns plater i 14 dager for en flat kolonidannelse analysen . For en myk-agar assay, ble 2000-celler sådd ut på fullstendig medium pluss 0,6% agar i triplikate brønner i seks-brønns plater. Medium ble byttet hver 48. time og synlige kolonier ble tellet ved lysmikroskopi etter 21 dager.
Scratch assay
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i serumfritt medium for å blokkere proliferasjon . Etter 12 timer ble cellene skrapet ved anvendelse av en 200 ul pipettespiss. Deretter ble bilder av 10 riper per cellelinje ervervet ved 0 timer, 12 timer og 24 timer.
Apoptose assay
Cellene ble dyrket i medium med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin i 48 timer. Deretter ble cellene høstet med en apoptose deteksjon kit (BD Biosciences, 559 763) av flowcytometri og for Western blot analyse.
In vitro Hotell og
in vivo
metastatisk modell og selvlysende avbildning
En 24-brønners transwell plate (8-um porestørrelse, Corning, USA) ble anvendt for å bestemme migrasjons og invasive mulig for hver cellelinje. For Transwell migrerings assays, 5 x 10
4 celler ble sådd i øvre kammer som ble foret med en ikke-belagt membran. De nedre kammer ble alle tilsatt i 500 ul kulturmedium med 20% FBS. De gjennomsnittlige verdier for tredoble analyser for hver eksperimentell tilstand ble bestemt.
For
in vivo
metastase analyser, HO8910 PM-YAP △ C stabile celler ble infisert med en lusiferase reporter plasmid og injisert i caudal årer av fire ukers kvinnelige null mus. Etter to uker ble dyrene avbildet ukentlig av dyret avbildning maskinen ved hjelp av en forsterket ladningskoblet anordning (CCD) kamerasystem. For
in vivo
bioluminescens avbildning, mus ble bedøvet ved anvendelse av en 1-2% isofluorane /luftblanding og injisert med en enkelt (ip) dose på 100 mg /kg av Luciferin (Promega, WI) og bioluminescens ble detektert med en IVIS 100 Imaging System (Xenogen).
i tillegg bioluminescence imaging, mus ble henrettet i 60 dager etter eggstokkreft celle-injeksjon for å undersøke organmetastaser etter inokulasjon.
Statistisk analyse
For de 45 forsøkspersoner med komplette immunhistokjemiske og resultatdata, ble sykdomsspesifikke 5-års overlevelse beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet mellom grupper som bruker log-rank tester. Korrelasjonsanalyse ble fullført av Chi-kvadrat test. Student t test ble brukt for å sammenligne resultatene fra hver målt variabel med kontrollresultater. P-verdier for 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle analyser ble gjort ved hjelp av SPSS (versjon 11.0).
Resultater
YAP er betydelig oppregulert i menneskelige eggstokkreft vev og høy YAP uttrykk spår dårlig pasient prognose
For å undersøke hvis YAP ble oppregulert i menneskelig eggstokkreft, ble samlet og fosforylert YAP (pyap) påvises ved immunhistokjemi (IHC) og lysbilder ble evaluert basert på cytoplasmatiske og atom YAP flekker nivåer. Disse IHC snitt ble kategorisert som å ha enten negativ, lav eller høy farging. Som en kontroll, ble 10 normale eggstokk-vevssnitt immunhistokjemisk farget med YAP. Men YAP uttrykk ble ikke påvist i disse delene (figur 1A)
A:. Immunhistokjemi resultater for YAP og pyap uttrykk i normale menneskelige eggstokk vev og fire undertyper av eggstokkreft vev. Seksjoner ble kontra med hematoksylin. Forstørrelser 40 × og 100 × vises. Scale bar = 100 mikrometer for alle panelene. B: Kaplan-Meier analyse for sammenhenger mellom YAP uttrykk, lokalisering, og fosforylering og eggstokkreft pasient overlevelse. P-verdier er fra log-rank tester.
YAP uttrykk og subcellulære lokalisering varierte for ulike krefttyper (Figur 1a). Høye atom YAP nivåer ble observert for 22,64% av de 106 ovarian tumor analyserte prøvene, som inkluderte 9 metastatisk eggstokkreft prøver, mens pyap ble observert i 11,88% av tumorprøver. Av 24 prøver med sterke YAP IHC signaler, 13 var også sterkt positivt for pyap. Blant de fire store typer eggstokkreft, ble YAP sterkt uttrykt i serøse og endometrioid cancinoma prøver (86,67%, N = 15).
For å finne ut om YAP og pyap distribusjoner var assosiert med eggstokkreft pasient overlevelse, YAP og pyap lokalisering og uttrykk nivåer ble evaluert i 45 eggstokkreft patologiske seksjoner. Disse resultatene ble brukt til Kaplan-Meier-analysen for å estimere sykdomsspesifikk overlevelse. Både cytoplasma YAP (cYAP) og pyap alene ikke var assosiert med en dårlig prognose for menneskelig eggstokkreft. Imidlertid, når det totale antall YAP ekspresjonsnivåer ble tatt i betraktning, disse var signifikant assosiert med en dårlig prognose (figur 1B). Disse resultatene antydet at høy YAP uttrykk nivåer snarere enn sine subcellulære distribusjoner var assosiert med eggstokkreft pasient overlevelse.
YAP fremmer eggstokkreft celleproliferasjon og tumorigenesis
I tillegg til menneskelige eggstokkreft prøver, vi også bestemt endogent YAP uttrykk i 11 dyrkede eggstokkreft cellelinjer. Western blotting resultater viste at YAP ble sterkt uttrykt i de fleste av disse cellelinjene, med den svakeste ekspresjon i A2780-celler og den høyeste ekspresjon i OVCAR8-celler (figur 2A). Dermed ble disse to cellelinjer brukes til følgende eksperimenter
A:. Western blotting resultater for endogen YAP uttrykk i 11 eggstokkreft cellelinjer. B: Diagram av de viktigste funksjonelle strukturelle domener og fosforyleringsseter i human YAP (full lengde og C-terminale slettes, YAP-A C, former). C: Western blotting resultater for uttrykket av FLAG-merket YAP-5SA og YAP-5SA-A C i etablerte stabile cellelinjer. D: Vekstkurver for celler som stabilt uttrykte YAP-5SA (øvre panel) og YAP-5SA-A C (nedre panel) og deres kontrollceller i løpet av en 7-dagers dyrkningsperioden. E: Bilder og kvantitative resultater for flat plate kolonidannelse analyser. Celler som uttrykte YAP-5SA eller YAP-5SA-A C og deres kontrollceller ble dyrket i 6-brønns plater i 2 uker. F: Bilder og kvantitative resultater for kolonier dyrket i myk agar. Celler som uttrykte YAP-5SA eller YAP-5SA-A C og deres kontrollceller ble sådd i myk agar i 3 uker. G: Bilder og kvantitative resultater for xenografter dyrket i nakne mus. Mus ble injisert subkutant med YAP-5SA uttrykk og kontrollcellene. Hvert punkt er gjennomsnittet av 3 eksperimenter. Feilfelt representerer S.D. «S; n = 5. Statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med en kontrollgruppe som bestemmes av t-test er merket med * (P 0,05) eller ** (P 0,01)
For å undersøke en rolle. for YAP i eggstokkreft celleproliferasjon og metastase, genererte vi A2780 og OVCAR8 stabile cellelinjer som overuttrykt konstitutivt aktiv YAP (YAP med fem LATS1 /2 fosforylering sete-mutasjoner, YAP-5SA) og dominant negativ YAP (YAP-5SA med en C- terminal transdomene sletting, YAP-5SA-A C, figur 2B-C). Cell vekstkurver viste at YAP-5SA uttrykker cellene hadde større proliferativ aktivitet enn kontrollene (figur 2D, øvre panel). I kontrast, YAP-5SA-A C uttrykker OVCAR8 cellene hadde en redusert spredning hastighet i forhold til kontrollceller (figur 2D, lavere panel).
Deretter undersøkte vi om YAP aktivitet påvirket celle transformasjon og migrasjon i eggstokkreft celler ved hjelp av en plate kolonidannelse analysen. Resultatene viste at konstitutivt aktiv YAP-5SA forfremmet klone formasjon, men det dominerende negative YAP-5SA-A C trykkes klone dannelse (figur 2E). I tillegg er det benyttet en myk agar assay for å bestemme forankrings-uavhengig vekst, en annen indikator på tumourigenicity. Som vist i figur 2F, ble YAP aktivitet positivt korrelert med eggstokkreft celler «kolonidannelse evne i myk agar.
YAP fremmer eggstokkreft kreftceller spredning og tumorigenesis
in vivo
Tidligere studier ikke undersøke om YAP kunne forbedre tumorigenesis
in vivo
. Således vi injisert subkutant YAP-5SA og YAP-5SA-A C uttrykkende celler, så vel som deres respektive kontrollceller, til 4 ukers gamle nakne mus. Etter 3 uker, svulster avledet fra YAP-5SA stabile celler var betydelig større enn de av kontroller (figur 2G). Disse resultatene var i samsvar med våre
in vitro
analyser.
YAP forbedrer eggstokkreft cellelinjer motstand mot Cisplatin og Taxol
Cisplatin og Taxol er de viktigste anti-kreft narkotika anvendes for ovarian cancer terapi. Derfor søkte vi å finne ut om YAP aktivitet påvirket eggstokkreft cellenes følsomhet for Cisplatin og Taxol. Som vist i figur 3A, YAP-5SA uttrykkende celler var mer resistente mot begge disse stoffene enn det som var kontrollceller ved forskjellige doser. I motsetning til dette, YAP-5SA-A C uttrykkende celler var mer mottagelige for begge medikamenter var enn kontrollceller. Den apoptotiske cellemarkører spaltet PARP og spaltet caspase 3 ble påvist i kontroll-A2780 celler etter Cisplatin behandling på en doseavhengig måte (0-100 uM). Men de økte uttrykk for disse apoptose markører var mindre viktig i tilsvar behandlet YAP-5SA uttrykker celler (figur 3B)
A:. Levedyktighet YAP-5SA og YAP-5SA-A C uttrykker celler etter behandling med Taxol eller CDDP, som bestemt ved MTT-analyse. B: Western blotting resultater for apoptose markører spaltede kaspase 3 og PARP i YAP-5SA uttrykk og kontrollcellene etter behandling med de angitte doser av CDDP i 48 timer. C: Strømningscytometri resultater for apoptose av A2780CP celler med eller uten YAP-5SA-A C transfeksjon og etter behandling med forskjellige doser av CDDP i 48 timer. D: Western blotting resultater for spaltet kaspase 3 og PARP i YAP-5SA-A C uttrykk og kontrollcellene etter behandling med de angitte doser av CDDP i 48 timer. F-G: Bilder og kvantitative resultater for
in vivo
tumorigent kapasitet på A2780CP celler med eller uten YAP-5SA-A C uttrykk. Nakne mus ble injisert med CDDP gjennom en halevenen en gang hver uke i fire uker etter tumorxenografter nådd 5 mm i diameter. H: IHC resultater for spredning Ki67 på de angitte tumor vev seksjoner. Scale bar = 100 mikrometer.
Flowcytometri Resultatene viste at en tidligere rapportert cisplatin-resistent eggstokkreft cellelinje (A2780CP) var faktisk motstandsdyktig mot cisplatin behandling ved lave doser (10-40 mm). Imidlertid, YAP-5SA-A C-ekspresjon i disse cellene forårsaket en økning i cellulær apoptose etter behandling med cisplatin på alle de testede doser (figur 3C-D). Videre YAP-5SA-A C uttrykker A2780CP celler viste bemerkelsesverdig økt uttrykk av spaltet PARP og caspase 3 enn gjorde kontrollceller etter cisplatin behandling (Figur 3E).
For å avgjøre om YAP dratt narkotika motstand mot eggstokkreft celler
in vivo
, vi subkutant injisert hårløse mus med A2780CP celler som stabilt uttrykte YAP-5SA-A C og med kontrollceller. På en uke etter celle injeksjoner, ble musene behandlet med cisplatin ved kaudal forgjeves injeksjon hver tredje dag. Tumor størrelser ble målt til 5 uker etter eggstokkreft celle injeksjoner. Sammenlignet med kontrollene, svulster som ble avledet fra YAP-5SA-A C uttrykkende celler var mindre i størrelse sammenlignet med de som er avledet fra kontrollceller (figur 3F-G). markør celleproliferasjon Ki67 ekspresjon var svakere i YAP-5SA-A C uttrykke celler enn i kontrollceller (Figur 3H).
YAP forbedrer migrasjon og forankringsuavhengig vekst av eggstokkreft celler
neste undersøkte effekten av YAP aktivitet på eggstokkreft celle migrasjon. I begge skrape analyser (figur 4A) og Transwell analyser (figur 4B), YAP-5SA uttrykker celler migrert raskere, mens YAP-5SA-A C uttrykker celler migrert tregere enn kontrollcellene.
A. Sårhelende analyse for migrering av YAP-5SA og YAP-5SA-A C uttrykker celler etter kultur for 12 og 24 timer. Scale bar = 100 mikrometer for alle panelene. B. Transwell-analyser for migrasjon av YAP-5SA og YAP-5SA-A C uttrykke celler. **, P 0,01. C. Bioluminesens avbildningsanalyser viser lungemetastase av kontroll og YAP-5SA-A C uttrykk HO8910PM celler etter at de ble injisert i hale venene i nakne mus. D. HE og IHC farging av lungemetastase områder vist i C. E-F: Bilder og statistiske analyseresultater av levermetastaser ved halevenen injisert HO8910 PM celler. G: HE og YAP IHC resultater av levermetastaser områder vist i EH Western blot resultater for EMT markør uttrykk i kultivert YAP-5SA og YAP-5SA-A C uttrykke celler og
in vivo
xenografter avledet fra disse cellene
i tillegg gjorde vi
in vivo
eksperimenter for å teste om YAP aktivitet var nødvendig for eggstokkreft metastaser. Vi etablerte YAP-5SA-ΔC- og luciferase-uttrykkende stabile cellelinjer under anvendelse av HO8910-PM-celler, en human ovarian cancer-cellelinje med et høyt metastatisk kapasitet, og injisert i disse celler i nakne mus gjennom sine caudal venene (5 x 10
6 celler /mus). Etter to uker etter injeksjon ble musene avbildes for metastase ved hjelp av et dyr avbildningssystem. Som vist på figur 4C-D, disse xenotransplantater avledet fra YAP-5SA-A C-uttrykkende celler var mindre enn de som er avledet fra kontrollceller. IHC Resultatene viste at xenografter var positive for CA125 og YAP, som bekreftet sin opprinnelse fra de injiserte eggstokkreft celler. Betydelig, ble post-inokulering metastaser påvist i leveren hos alle 10 mus som ble injisert med kontroll HO8910 celler, men bare i 2 av 10 mus injisert med YAP-5SA-A C-uttrykkende celler (figur 4E). I tillegg, YAP-5SA-A C-uttrykkende celler som dannes langt færre metastatiske noduler (YAP-positiv) enn kontrollceller i leveren hos injiserte mus (figur 4F-G). Disse resultatene antydet at redusert YAP aktivitet utviklingshemmede eggstokkreft kreftceller metastaser
in vivo
.
En epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er antatt å være en viktig prosess i løpet av oppkjøpet av disse egenskapene kreves for tumormetastasering. I begge dyrkede eggstokkreft celler og hos dem isolert fra
in vivo
, YAP-5SA fremmet uttrykk for EMT markør sneglen og hemmet uttrykk for epitel markør E-cadherin. Men YAP-5SA-A C hadde motsatt effekt (figur 4H).
Høy atom YAP og TAED4 nivåer er assosiert med et dårlig menneske eggstokkreft prognose
YAP har ikke et DNA-bindende domene. Det fungerer som en transkripsjon co-aktivator ved å binde med TEAD familie transkripsjonsfaktorer (TEAD1-4). Men det har ikke undersøkt om TEADs spille noen rolle i eggstokkreft prognose. Derfor undersøkte vi TEAD1-4 uttrykk i menneskelig eggstokkreft prøver. Uttrykk for de 4 undergrupper av TEAD familie proteiner ble undersøkt individuelt i en eggstokkreft vev microarray av IHC (figur 5A). Korrelasjonsanalyse Resultatene viste at YAP og pyap var positivt korrelert med TEAD1-4 uttrykk, og ble mest nært korrelert med TEAD4 uttrykk (figur 5B) .En forening analyse ved hjelp av 45 eggstokkreft pasientprøvene ble gjort der rangeres vi Kaplan-Meier overlevelsesestimater . Resultatene viste at YAP uttrykk var positivt korrelert med TEAD4 uttrykk (figur 5C, P = 0,0284).
A. IHC resultater for TEADs uttrykk i menneskelig eggstokkreft vev. Scale bar = 100 mikrometer. B. Sammenhenger mellom YAP /pyap uttrykk og TEAD uttrykk i en eggstokkreft vev matrise. C. Sammenhenger mellom YAP og TEAD4 uttrykk i 45 eggstokkreft prøver rangert etter Kaplan-Meier overlevelses estimater. D. YAP og TEAD4 ko-ekspresjon er assosiert med en dårlig prognose med human ovarian cancer. Høy TEAD uttrykk versus lav TEAD4 uttrykk (til venstre), høy YAP uttrykk kombinert med høy TEAD4 uttrykk versus andre kategoriene (i midten), høy YAP uttrykk og høy TEAD4 uttrykk kombinert med høy β-catanin versus andre kategoriene (til høyre).
Vi videre undersøkt om TEAD4 alene kan være assosiert med eggstokkreft pasient overlevelse. Kaplan-Meier estimater og sammenligninger av sykdomsspesifikk overlevelse viste at høy TEAD4 fargeintensitet var assosiert med dårlig pasient overlevelse (figur 5D, venstre panel). Overlevelsen av pasienter med både høy YAP og høy TEAD4 uttrykk var betydelig dårligere enn for de andre kategoriene (figur 5D, midt panel; P = 0,002). I tillegg, Kaplan-Meier-estimatet for kombinert høy YAP /TEAD4 og EMT markør β-catanin ekspresjon var også statistisk signifikant (figur 5D, høyre panel). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at YAP og TEAD4 var to betydelige uavhengige markører for dårlig pasient overlevelse og deres samlede evaluering kan være en sterk selvstendig prediktor for sykdomsspesifikk overlevelse for eggstokkreft pasienter.
Diskusjoner
YAP har vært innblandet som en mulig onkogen med ulike subcellulære lokalisasjoner regulert av oppstrøms gener i Hippo veien. Økt YAP uttrykk og en kjernefysisk lokalisering har blitt observert i flere humane kreftformer, inkludert lever, tykktarm, eggstokkreft og lungekreft [23] – [30]. I denne studien, viste vi at YAP proteinnivået var høyt i flere eggstokkreft cellelinjer. Enda viktigere, YAP ble sterkt uttrykt i eggstokkreft prøver, men ikke i normal eggstokkvev, som antydet at YAP uttrykk var direkte knyttet til eggstokkreft utvikling eller progresjon.
Tidligere studier har også antydet at YAP kan fungere som et onkogen i eggstokkreft [31]. Men ingen av disse studiene undersøkte mulige sammenhenger mellom YAP /TEAD uttrykk nivåer og eggstokkreft pasient overlevelse. I denne studien viste vi at høy YAP uttrykk i ovarietumorer var assosiert med kortere sykdomsspesifikk overlevelse for eggstokkreft kreftpasienter, og at lav YAP uttrykk i ovarietumorer var assosiert med en lengre sykdomsspesifikk overlevelse for disse pasientene. Videre har vi funnet for første gang at TEAD4, en direkte bindingspartner av YAP, ble også tett forbundet med pasientens overlevelse. Samtidig uttrykk for YAP og TEAD4 i eggstokkreft vev var enda mer dramatisk assosiert med dårlig pasient overlevelse. Dermed høy YAP /TEAD4 nivåer kan være en prediktor for fastsettelse av eggstokkreft malignitet nivåer og for å estimere prognose for disse pasientene.
Primær epitelial eggstokkreft er vanligvis behandles med platinabaserte legemidler, slik som cisplatin kombinert med taxol. Disse stoffene administreres enten intravenøst eller intraperitonealt. Apoptotiske og anti-apoptotiske signalene er de to aspektene av cellekrysstale mellom celle overlevelse og celledødsveier som avgjør skjebnen til cellene i sine reaksjoner på eksogene forhold. For tumorer, blir medikament-indusert apoptose styres ikke bare av oppregulering av apoptotiske faktorer eller tumor-suppressorer, men også ved modulering av celleoverlevelsesfaktorer. I denne studien, viste vi at opp- og nedregulering av YAP aktivitet kan modulere spredning, kolonidannelse og migrasjon evner, og motstanden mot kjemoterapeutiske midler ved eggstokkreft cellelinjer. En konstitutivt aktiv YAP mutant økt motstand mot narkotika-indusert apoptose av eggstokkreft celler, mens dominant negativ YAP restaurert medikament følsomhet i Cisplatin-resistente eggstokkreft celler.
De nøyaktige mekanismene som YAP forbedrer legemiddelresistens fortsatt uklare . Flere studier fokusert på PI3K /Akt vei for cellegift-motstand i eggstokkreft og viste at Cisplatin kan oppregulere p53 og indusere apoptose i disse kreftcellene etter uttrykk for dominant negativ AKT, som antydet at cisplatin-mediert p53 oppregulering ble motarbeidet av AKT. Den PI3K /AKT sti kan også delta i YAP-mediert legemiddelresistens, som det har blitt klart vist at YAP var involvert i cross-talk med PI3K stier og tilrettelagt AKT aktivering i andre celletyper [32], [33]. Tidligere studier viste også at hyperaktive av PI3K veien initiert eggstokkreft utvikling i musemodeller. Samspillet mellom disse to banene må undersøkes nærmere i eggstokkreft celler.
Det har vært en teori om at kreftceller mister sine epiteliale egenskaper og tilegne seg visse mesenchymale egenskaper som fremmer ekstracellulære miljø invasjon og fjernmetastaser i en EMT- som prosess. Epiteliale markører som er nedregulert i løpet av denne overgangen inkluderer E-cadherin, cytokeratins, ZO-en og andre. Hippo signalveien komponenter er nødvendig for E-cadherin-avhengige kontakt hemming av proliferasjon. Knockdown av Hippo signale komponenter eller YAP overekspresjon hemmer redusert celleproliferasjon forårsaket av E-cadherin homofilist binding på celleoverflaten [34].
I vår studie fant vi at YAP kunne forbedre migrasjon av eggstokkreft celle linjer. Vi fant også at uttrykket av EMT markører ble modulert av YAP aktivitet i tumorvev av nakne mus og bekreftet at YAP forbedret eggstokkreft celle metastaser
in vivo
. Selv YAP uttrykk kombinert med EMT markør uttrykk ble assosiert med pasientens prognose, E-cadherin og andre EMT genene alene var ikke assosiert med pasientens overlevelse (data ikke vist). Dermed E-cadherin og andre EMT gener ikke var uavhengige prediktorer for eggstokkreft risiko prediksjon. Hvis YAP er tatt i betraktning, så EMT markører kan være en prediktor for kreftrisiko eggstokkreft.
Tidligere studier antydet at YAP var en uavhengig prognostisk markør for dårlig overlevelse med eggstokkreft og andre carcinoma [9], [30 ]. Vår studie også bekreftet dette ved hjelp av overlevelsesanalyse. I vårt datasett, ble YAP positivt assosiert med pasientens prognose, mens dens cytoplasma distribusjon og pyap ikke var indikatorer for å overleve. Pasienter med høyt atom YAP (nYAP) uttrykk og lav cytoplasma YAP (cYAP) uttrykk hadde nesten åtte ganger større risiko for å dø av denne sykdommen enn andre pasienter. Den nYAP /cYAP mønster kan reflektere YAP aktivitet i en tumor: YAP har transkripsjonsfremmende aktivitet bare når den er lokalisert i kjernen og er antagelig transkripsjonelt inaktiv når den fastholdes i cytoplasma, og er fosforylert ved S127 ved LATS1 /2 <.
