Abstract
Kjemoterapi og /eller strålebehandling er mye brukt som kreft behandlinger, men antitumor effekter de produserer kan bli styrket når den kombineres med immunterapi. Kjemoterapi dreper tumorceller, men det frigjør også tumorantigenet og tillater kryss presentasjon av tumorantigenet for å utløse antigen-spesifikk celle-medierte immunresponser. Fremme CD4 + T-hjelpercelleimmunresponser kan anvendes for å øke den tverr presentasjon av tumorantigenet etter kjemoterapi. Pan HLA-DR bindende epitop (PADRE peptid) er i stand til å generere antigen-spesifikke CD4 + T-celler som bindes forskjellige MHC klasse II molekyler med høy affinitet og har vært mye brukt i forbindelse med vaksiner for å forbedre deres styrke ved å øke CD4 + T-celleresponser . Her undersøkte vi hvorvidt intratumoral injeksjon for Padre og adjuvant CpG inn i HPV16-E7-uttrykkende TC-1 tumorer etter cisplatin kjemoterapi kan føre til potente antitumoreffekter og antigen-spesifikk celle-medierte immunresponser. Vi har observert at behandling med alle de tre midler produserte de mest potente antitumoreffekter sammenlignet med parvise kombinasjoner. Videre behandling med cisplatin, CpG og PADRE var i stand til å kontrollere tumorer på et fjernt sted, noe som indikerer at vår tilnærming er i stand til å indusere kryss presentasjon av tumorantigenet. Behandling med cisplatin, CpG og PADRE også forbedret generering av Padre-spesifikke CD4 + T-celler og E7-spesifikke CD8 + T-celler og redusert antall MDSCs i tumor loci. Den behandlingsregime som presenteres her representerer en universell tilnærming til kontroll av kreft
Citation. Song L, Yang MC, Knoff J, Wu TC, Hung CF (2014) Kreft Immunterapi Ansette en innovativ strategi for å styrke CD4 + T-cellehjelp i svulstens mikromiljø. PLoS ONE 9 (12): e115711. doi: 10,1371 /journal.pone.0115711
Redaktør: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Nederland
mottatt: 19 mars 2014; Godkjent: 27 november 2014; Publisert: 22.12.2014
Copyright: © 2014 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health /National Cancer Institute Livmorhalskreft SPORE P50CA098252 og 2R01CA114425-06 tilskudd. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kjemoterapi og /eller strålebehandling er mye brukt som kreft behandlinger. Både kjemoterapi og strålebehandling har vist seg å omdanne den tumor mikromiljøet i en egnet ramme for etterfølgende immunterapeutisk vaksinering [1], [2]. Vi har tidligere brukt cisplatin kjemoterapi for å prime svulsten mikromiljøet for vaksinering med et rekombinant protein, og fant at dette behandlingsregimet induserte antitumor-effekter, og antigen-spesifikk celle-medierte immunresponser [1]. Ikke bare cisplatin drepe tumorceller, men også det frigjør tumorantigenet og tillater kryss-presentasjon av tumorantigenet for å utløse antigen-spesifikk celle-medierte immunresponser. Imidlertid kan antitumor effekter produsert ved kjemoterapi forsterkes ved kombinasjon med immunterapier.
En strategi for å forbedre den tverr presentasjon av tumorantigenet etter kjemoterapi er å fremme CD4 + T-hjelper-celleimmunresponser. Et middel som er i stand til å generere antigen-spesifikke CD4 + T-celler som bindes forskjellige MHC klasse II-molekyler med høy affinitet er det pan HLA-DR bindende epitop (PADRE peptid) [3]. The Padre peptid har blitt mye brukt i forbindelse med vaksiner for å forbedre deres styrke ved å øke CD4 + T-celleresponser [4] – [7]. Derfor, intratumoral administrering for Padre potensielt kan skape PADRE-spesifikke CD4 + T-hjelperceller for ytterligere å forbedre tverr presentasjon for å generere tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celler. Anvendelse av et immunstimulerende hjelpemiddel med PADRE peptidet kan ytterligere øke tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celler.
toll-lignende reseptor-9 (TLR9) agonist CpG er et vanlig hjelpestoff som er blitt vist å stimulere CD8 + T celle cross-priming ved å fremme type I interferon produksjon [8], [9]. CpG er også blitt vist å ha antitumoreffekter når injisert direkte inn i svulsten [10] – [12]. Videre CpG har vist seg å blokkere den immunosuppressive aktiviteten av MDSCs i tumorbærende mus [13]. Disse studiene tyder på at den immunstimulerende CpG funksjon kan anvendes for å øke den tverr presentasjon av tumor antigen for å generere tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celle-medierte immunresponser.
I denne studien, hypotese vi at cisplatin behandling etterfulgt av CpG adjuvant og PADRE peptid administrasjon ville øke den tverr presentasjon av tumorantigenet, noe som fører til potente antitumoreffekter. For å teste dette, brukte vi mus med HPV16 E7-uttrykker TC-1 svulster og behandlet dem med ulike kombinasjoner av cisplatin etterfulgt av intratumoral injeksjon med CpG og PADRE peptid. Vi har funnet at behandling med alle de tre midler produserte de mest potente antitumoreffekter. Videre behandling med cisplatin, CpG og PADRE var i stand til å kontrollere tumorer på et fjernt sted, noe som indikerer at vår tilnærming var i stand til å indusere kryss presentasjon av tumorantigenet. Vi fant at behandling med cisplatin, CpG og PADRE forbedret generasjon av Padre-spesifikke CD4 + T-celler samt E7-spesifikke CD8 + T-celler. Behandling med cisplatin, CpG og PADRE også redusert antall MDSCs i tumor loci, en prosess funnet å være formidlet av Fas-Fasl apoptose pathway. Behandlingsregimet som presenteres her er en ny anvendelse av en kombinasjon av immunterapier som induserer potent antitumorimmunresponser uten å kreve kjennskap til immunodominante tumorantigener, slik at tilnærmingen potensielt vidt anvendelig.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Alle dyr prosedyrer som brukes i denne studien ble utført i henhold til protokoller som er godkjent for denne spesifikke studien og i samsvar med anbefalinger for riktig bruk og stell av forsøksdyr ved Johns Hopkins University Animal Care og bruk komité. Alle cellelinjer ble etablert og opprettholdt med godkjente protokoller. Mus ble ofret for formålet med denne studie ved hjelp av CO
2 i samsvar med dyret protokollen. Når det gjelder menneskelige endepunkt standarder, mus viser alvorlig nød eller som har svulster som overskred 20 mm i diameter ble avlivet med CO
2 i samsvar med dyret protokollen.
Forsøksdyr
seks- til åtte -week gammel kvinnelig C57BL /6 mus ble oppnådd fra National Cancer Institute-Fredrik Animal Production Area (Frederick, MD). Mus ble plassert i onkologi Dyreavdelingen ved Johns Hopkins Hospital (Baltimore, MD).
Cells
TC-en svulst modellen ble produsert i vårt laboratorium ved transformasjon av primær lunge epitelceller fra C57BL /6-mus med aktive Ras sammen med HPV16 E6 og E7-onkogener og produksjon og vedlikehold i henhold til vedtatte protokoller for denne cellelinje er blitt tidligere beskrevet [14]. Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 10% natriumpyruvat, 10% ikke-essensiell aminosyre, og 100 pg /ml streptomycin i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 /95% luft ved 37 ° C. E7-spesifikke CD8 + T-celler ble samlet fra splenocyttene til E7 vaksinerte mus og ble stimulert med bestrålte TC-1-celler og 10 IU interleukin-2 (IL-2) hver uke. PADRE-spesifikke CD4 + T-celler ble samlet inn C57BL /6 mus immunisert med pcDNA3-Ii-PADRE av genet pistol. Cellene ble stimulert med bestrålte Padre peptid-pulset DC og IL-2 (10 IU) ukentlig [15].
Peptide, antistoffer og reagenser
The Padre peptid (Pan HLA-DR reaktiv epitop , AKFVAAWTLKAAA), og H2-D
b-begrenset HPV16 E7aa49-57 peptid (RAHYNIVTF) ble syntetisert ved Beckman Coulter ved en renhet på 90%.
FITC, PE og APC-konjugert anti-mus CD8a (klon 53.6.7), FITC-konjugert anti -mouse IFN-γ (klon XMG1.2), FITC og PE-konjugert anti-mus CD4 (klon RM4-5), APC-konjugert anti-mus CD11b (klon M1 /70), PE-konjugert anti-mus Ly6G (klon 1A8), PE-konjugert anti-mus CD154 (CD40L, klon MR1), Funksjonell anti-mus CD95 (Fas, klon Jo2) agonistiske antistoffer og FITC Annexin V Apoptose Detection Kit ble kjøpt fra BD Pharmingen (San Diego, California). PE-konjugert CD178 (Fas-L, klone MFL3), PE-konjugert anti-mus CD95 (Fas, klon 15A7), FITC-konjugert anti-mus CD40 (cloneHM40-3), funksjonell anti-mus CD40 agonist (klon 1C10) og anti-mus CD154 (CD40L, klone MR1) antistoffer ble kjøpt fra eBioscience (San Diego, California). PE-konjugert, HPV16 E7aa49-57 peptid og RAHYNIVTF lastet H2-D
b tetramers ble hentet fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer tetramer Facility (Atlanta, GA). Fas /Fas L antagonist Kp7-6 ble kjøpt fra EMD Chemicals (San Diego, CA).
In vivo
svulst behandling eksperimenter og antistoff utarming
tumor behandlingsforsøk Det ble utført to ganger uavhengig av hverandre. På dag 0, 1 x 10
5 TC-1 tumorceller ble inokulert subkutant i C57BL /6 mus (5 pr gruppe). Fire dager senere, tumor-bærende mus ble behandlet med cisplatin (5 mg /kg kroppsvekt) eller PBS kontroll intraperitonealt. På dag 5, ble mus immunisert intratumorally enten med PBS-kontroll, 20 ug PADRE peptid, 10 ug CpG, eller en kombinasjon av de to sistnevnte. Alle behandlinger ble gjentatt 3 ganger til med 7 dagers mellomrom. Tumorvekst ble overvåket ved visuell inspeksjon, palpasjon, og digitale calipers (Scienceware) to ganger i uken. Mus ble avlivet da diameteren av tumoren nådde 20 mm.
For systemisk antitumorvurdering mus (5 pr gruppe) ble utfordret subkutant med 1 x 10
5 TC-1 tumorceller på den høyre flanke . Fem dager senere, 3 × 10
4 TC-en tumorceller ble inokulert subkutant på venstresiden. Tumor-bærende mus som enten ble behandlet med PBS-kontroll eller gikk trippelterapi (cisplatin 5 mg /kg IP, kombinert med 20 ug PADRE peptid og 10 ug CpG ved intratumoral injeksjon) tre ganger med 5 dagers mellomrom. I CD8 + T-celle-uttømming gruppe, ble 100 ug anti-mus CD8-antistoff (klon 2.43) levert til musene via intraperitoneal injeksjon på dagene 3, 4, 5 etter tumor-utfordring. Deretter ble 150 ug /mus anti-muse-CD8 antistoff avlevert pr uke for å opprettholde mer enn 90% CD8 + T-celle-uttømming.
Fremstilling av enkeltcellesuspensjoner fra TC-1 subkutan tumor
de tumorvev ble forsiktig dissekert fra musene. De faste tumorer ble så hakket i 1 til 2 mm stykker og inkubert med serumfritt RPMI 1640 medium inneholdende 0,05 mg /ml kollagenase I, 0,05 mg /ml kollagenase IV, 0,025 mg /ml hyaluronidase IV, 0,25 mg /ml DNase I- (begge fra Roche, Indianapolis, IN), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og inkubert ved 37 ° C i 60 min som tidligere beskrevet [16].
Celleoverflate overflate~~POS=HEADCOMP-farging, intracellulær cytokin flekker og flowcytometri analyse
For tetramer flekker, encellede suspendert splenocytes eller tumor infiltrerer lymfocytter ble farget med renset anti-mus CD16 /32 (Fc blokk, BD Pharmingen, San Diego, California) først, og deretter med anti-mus CD8-FITC, PE-konjugert HPV16 E7 aa49-57 (RAHYNIVTF) peptid-lastet H2-D
b tetramer ved 4 ° C. Cellene ble farget med 7-AAD før flowcytometri analyse for å utelukke døde celler.
For å oppdage HPV16 E7-spesifikke CD8 + T-celle responser og PADRE-spesifikke CD4 + T-celler ved IFN-γ intracellulær farging, PBMC, encellede suspenderte miltceller eller tumor infiltrerende lymfocytter ble stimulert med enten HPV16 E7aa49-57 eller PADRE peptid (1 pg /ml) i nærvær av Golgiplug (BD Pharmingen, San Diego, CA) ved 37 ° C over natten. De stimulerte celler ble deretter vasket en gang med FACScan-buffer og farget med PE-konjugert monoklonalt rotte anti-mus eller anti-CD8a mus CD4. Celler ble utsatt for intracellulær cytokin farging bruker Cytofix /Cytoperm kit i henhold til produsentens instruksjoner (BD Pharmingen, San Diego, California). Intracellulær IFN-γ ble farget med FITC-konjugert rotte-anti-muse-IFN-γ. Flowcytometri analyse ble utført ved hjelp av FACSalibur med Cellquest programvare. Alle analyser ble utført med FlowJo programvare (Tre stjerners).
Isolering av myeloide-avledet suppressor celler i tumorbærende mus og undertrykkelse av T-celledeling
CD11b + Ly6G
Hi MDSCs var isolert fra enkeltcelle splenocytt suspensjoner av TC-1 tumorbærende C57BL /6 mus bruker CD11b + Ly6G isolasjon kits og LS kolonner for magnetisk separasjon i henhold til produsentens instruksjoner (Miltenyi Biotec). Renheten var ikke mindre enn 95%.
In vitro
MDSC apoptose evaluering
Purified MDSCs ble inkubert ved 37 ° C eller co-kultivert med PADRE spesifikk CD4 + T celler i en 01:01 forhold i opptil 24 timer i 96-brønners plater. Cellene ble deretter farget med APC anti-mus CD11b, PE-anti-mus Ly6G, FITC-anti-mus Annexin V-antistoffer og 7-AAD (FITC Annexin V Apoptose Detection Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA) og undersøkt ved hjelp av strømningscytometri. MDSCs ble først inngjerdet på CD11b + og Ly6G
Hei, og deretter frekvensen av apoptose ble målt ved Annexin V + og 7-AAD.
For å evaluere antistoff indusert MDSC apoptose, isolert MDSC ble dyrket i 12 timer med anti-Fas-agonistisk antistoff (2 ug /ml, BD Pharmingen, klone Jo2, San Diego, CA), eller isotype mAb. For in vitro blokkeringsanalyse, isolerte MDSCs ko-dyrket med PADRE- spesifikke CD4 + T-celle på 01:01 rasjon, deretter inkubert med isotype mAb, eller Fas-Fas-L-antagonist (Kp7-6, Calbiochem) i 24 timer.
Statistisk analyse
Alle data presenteres i denne studien er uttrykt som gjennomsnitt ± SE er angitt. Sammenligninger mellom individuelle datapunkter for intracellulær cytokin farging med flowcytometri analyse og svulst behandling ble gjort ved hjelp av tosidige t-test av Graph Prism 6.0. I tumorbehandlingsforsøk, det viktigste resultat av interesse var varighet inntil Musene ble avlivet. Arrangementet tidsfordelinger for forskjellige mus ble sammenlignet med Kaplan-Meier metoden og log-rank test av Graph Prism 6.0. Alle p-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Behandling av TC-en tumor-bærende mus med cisplatin, CpG og PADRE peptid genererer potent antitumor effekter
TC-1 tumor-bærende mus ble anvendt for å undersøke antitumor effekten av forskjellige behandlinger som kombinerer intraperitoneal cisplatin kjemoterapi, intratumoral injeksjon av PADRE peptid og /eller intratumoral injeksjon av CpG. C57BL /6 mus ble utfordret med 1 x 10
5 TC-1 tumorceller på dag 0, og delt inn i fem behandlingsgruppene. Mus i gruppe 1 var ubehandlet, de i gruppe 2 ble behandlet med cisplatin etterfulgt av intratumoral CpG, de i gruppe 3 ble behandlet med cisplatin etterfulgt av intratumoral PADRE peptid, de i gruppe 4 ble behandlet med intratumoral CpG og PADRE, og de i gruppe 5 ble behandlet med cisplatin fulgt av intratumoral CpG og PADRE (fig. 1A). Som vist på fig. 1B, behandling med cisplatin etterfulgt av intratumoral CpG og PADRE betydelig redusert tumorvolumet i forhold til kontroll og behandling med CpG og PADRE bare. Videre behandling med cisplatin etterfulgt av intratumoral CpG og PADRE betydelig forbedret overlevelse sammenlignet med alle andre behandlingsgruppene (Fig. 1C). Disse data tyder på at kombinasjonen av cisplatin, CpG og PADRE har betydelige antitumor effekt mot TC-1 tumorer.
C57BL /6 mus (5 mus /gruppe) ble utfordret subkutant med TC-1 tumorceller og behandles med ulike kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE peptid. A. Skjematisk fremstilling av behandlingsregimer. B. Plot av tumorvekst kinetikk. C. Kaplan-Meier overlevelse plott. (*
p
0,05, ***
p
0,001, ***
p
0,0001).
behandling med cisplatin, CpG og PADRE peptid utløser sterke systemisk antitumor effekter
Siden behandling med cisplatin, CpG og PADRE generert de mest potente antitumor effekter (Fig. 1), vi neste undersøkt om behandling med alle tre agentene kunne generere antitumoreffekter i en sekundær tumor. C57BL /6 mus ble subkutant utfordret med TC-1 tumorceller i den høyre flanke på dag 0, og deretter igjen på venstre flanke på dag 5. En gruppe av mus ble deretter behandlet med anti-CD8-antistoff på dagene 3-5 og deretter ukentlig for å utarme CD8 + T-celler. Mus ble behandlet som vist i fig. 2A, med cisplatin injisert intraperitonealt og med CpG og PADRE injisert intratumorally i den primære svulst på høyre flanke. Som vist på fig. 2B, volumet av den primære tumor ble betydelig redusert hos mus behandlet med cisplatin, CpG og PADRE sammenlignet med ubehandlede mus. Videre er volumet av den sekundære tumor på venstre flanke var også betydelig redusert hos mus behandlet med alle tre midlene i forhold til ubehandlede mus (Fig. 2C). Uttømming av CD8 + -T-celler ble redusert i betydelig grad den terapeutiske effekt av cisplatin, CpG og PADRE behandling i både primære og sekundære tumorer, noe som indikerer at CD8 + T-celler er viktig for behandling effekt (Fig. 2B og C). Fig. 2D viser at behandling med cisplatin, CpG og PADRE forlenger overlevelsen av TC-1 tumor-bærende mus i forhold til CD8 + T-celle utarmet mus og ubehandlede mus betraktelig. Tilsvarende utarming av CD4 + T-celler svekkes signifikant antitumorvirkningene av trippelbehandlingsregime (S1A fig.). Videre infusjon av Padre-spesifikke CD4 + T-celler til tumorbærende mus betydelig forbedret antitumoreffekt (S1B fig.). Disse resultater viser at CD4 + T-celler er også viktig for den observerte terapeutisk effekt. Til sammen dataene indikerer at behandling med cisplatin etterfulgt av CpG og PADRE genererer potente systemiske antitumor immunresponser i stand til å handle mot svulster i fjerne områder.
C57BL /6 mus (5 mus /gruppe) ble utfordret hverandre med TC-1 tumorceller på dag 0 (høyre flanke) og dag 5 (venstre flanke), og deretter enten var ubehandlet eller behandlet med cisplatin i kombinasjon med intratumoral injeksjon med CpG og PADRE peptid i den primære tumor. I CD8 + T-celle-uttømming gruppe, ble musene behandlet som ovenfor, med den adition av 100 ug anti-muse-CD8 antistoff (klon 2.43) injisert intraperitonealt på dag 3, 4 og 5 etter tumor-utfordringen, og deretter 150 ug per uke senere. A. Skjematisk diagram av behandlingsregimet. B. Scatter tomt på primær tumorvekst kinetikk. C. Scatter tomt på videregående tumorvekst kinetikk. D. Kaplan-Meier overlevelse plott. (***
p
0,001, ****
p
0,0001)
Behandling med cisplatin, CpG og PADRE forbedrer systemisk PADRE. -spesifikke CD4 + T-celleresponser i TC-1 tumor-bærende mus
Deretter undersøkte vi effekten av behandling med forskjellige kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE på systemiske CD4 + T-celleimmunresponser. TC-1 tumor-bærende mus ble behandlet med forskjellige kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE peptid som vist i fig. 1A og PBMCer ble analysert ved hjelp av strømningscytometri en uke etter den siste antigenavlevering for tilstedeværelse av IFN-γ sekresjon Padre-spesifikke CD4 + T-celler. Som vist på fig. 3A og B, tumorbærende mus behandlet med cisplatin fulgt av CpG og PADRE genereres det høyeste antall PADRE spesielle IFN-γ + CD4 + -T-celler systemisk sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Dette indikerer at behandling med cisplatin, CpG og PADRE er i stand til å generere kraftige Padre-spesifikke CD4 + T-celleresponser i TC-1 tumor-bærende mus.
C57BL /6 mus (5 mus /gruppe) ble utfordret subkutant med TC-1 tumorceller og deretter behandlet med forskjellige kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE peptid som angitt. PBMC ble analysert 1 uke etter siste antigen levering. Tilstedeværelsen av Padre-spesifikke CD4 + T-celler i PBMC ble analysert ved hjelp av intracellulær farging for cytokin IFN-γ og CD4 + farging, etterfulgt av strømningscytometri-analyse. A. Representative flowcytometri konturplott som viser hyppigheten av IFN-y-sekresjon CD4 + T-celler i omløp etter å ha blitt pulset med PADRE peptid. B. Bar grafen kvantifisering av dataene (gjennomsnitt ± SE).
Behandling med cisplatin, CpG og PADRE induserer lokale tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celle responser i TC-1 tumorbærende mus
TC-1 tumor-bærende mus ble behandlet med forskjellige kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE peptid som vist i fig. 1A. Tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) ble høstet for analyse 12 dager etter den siste antigen levering. Tilstedeværelsen av Padre-spesifikke CD4 + T-celler og E7-spesifikke CD8 + T-celler blant Tīlss ble karakterisert ved hjelp av intracellulær farging for cytokin IFN-γ så vel som CD4 og CD8 farging og analysert ved strømningscytometri. Som vist på fig. 4A og C, mus behandlet med cisplatin etterfulgt av CpG og PADRE genererte den høyeste andelen av Padre-spesifikke CD4 + T-celler blant tumor-infiltrerende CD4 + T-celler i forhold til alle andre behandlingsgruppene. Videre mus behandlet med cisplatin, CpG og PADRE genereres det høyeste antall E7-spesifikke CD8 + T-celler blant tumorceller sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper (fig. 4B og D). Det er viktig å merke seg at Tīlss oppsamlet fra inne i svulsten mikromiljø er i en aktivert tilstand hvor T-celle-reseptorene som blir internalisert. Dermed ser det flekker som en gradient basert på de ulike nivåene av TCR intern. Dette utseende skiller seg fra de fargemønsteret som vanligvis observeres i vurderingen av antigen-spesifikke T-celler i den systemiske sirkulasjonen, hvor en distinkt populasjon ville bli observert. Tatt sammen tyder disse data på at behandling med cisplatin, CpG og PADRE kan føre til kryss-presentasjon av tumorantigenet, E7, noe som resulterer i forbedrede tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celle-medierte immunresponser i tumoren loci.
C57BL /6 mus (5 pr gruppe) ble utfordret subkutant med TC-1 tumorceller og behandlet med forskjellige kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE peptid som angitt. 12 dager etter den siste antigenavlevering, ble tumor-infiltrerende lymfocytter innhøstet for å analysere immuncelleundergrupper. A. Representative strømningscytometri-analyse som viser hyppigheten av Padre-spesifikke IFN-y-sekresjon CD4 + T-celler blant den totale tumor infiltrerende CD4 + T-celler. B. Søylediagram kvantifisering av data fra A. (gjennomsnitt ± S.E.). C. Representative strømningscytometri-analyse som viser det absolutte antall E7-tetramer-bindende CD8 + -T-celler i 5 x 10
5 enkeltcellesuspensjon fremstilt fra tumorer. D. Bar grafen kvantifisering av data fra C. (gjennomsnitt ± SE).
Behandling med cisplatin, CpG og PADRE reduserer myeloide avledet suppressor celler i svulsten loci
For ytterligere å undersøke effekter av cisplatin, CpG og PADRE behandling, analyserte vi immunsuppressive myeloide avledet suppressor celler (MDSCs) blant kreft infiltrere-lymfocytter av behandlede TC-1 tumorbærende mus. Mellom 30 og 35 dager etter tumor-utfordring, ble tumorer høstet og analysert ved flowcytometri, som vist i fig. 5A. Fig. 5B viser at svulster i mus behandlet med cisplatin, CpG og PADRE hadde en betydelig lavere andel av CD11b + Ly6G
Hei MDSCs i svulsten loci i forhold til alle andre behandlingsgruppene. Disse data viser at behandling med cisplatin, CpG og PADRE utløser antitumoreffekter i det minste delvis ved å redusere bestanden av MDSCs i svulsten mikromiljøet.
C57BL /6 mus (5 pr gruppe) ble utfordret subkutant med TC- 1 tumorceller og behandlet med forskjellige kombinasjoner av cisplatin, CpG og PADRE peptid. Ved 30-35 dager etter tumor-utfordring, når tumordiameter oversteg 10 mm, ble tumor-infiltrerende celler innhøstet for å analysere med hensyn på tilstedeværelsen av CD11b + Ly6G
hi MDSCs. A. Representative kontur plott som viser hyppigheten av CD11b + Ly6G
hi MDSCs i enkeltcellesuspensjon fremstilt av svulsten. B. Bar grafen kvantifisering av data fra A (gjennomsnitt ± SE) (*
p
0,05, ***
p
0,0001).
Padre-spesifikke CD4 + T-celler induserer MDSC apoptose gjennom Fas og Fas ligand sti
Vi har observert at behandling med cisplatin etterfulgt av CpG og PADRE redusert antall MDSCs i tumor loci. Tidligere har det vist seg at MDSCs uttrykker Fas og vil gjennomgå Fas-mediert apoptose Fasl-hvis det støter på en T-celle som uttrykker Fasl [17]. Derfor, karakterisert vi effekten av aktiverte Padre-spesifikke CD4 + T-celler på MDSCs i form av apoptotisk aktivitet og funnet at MDSCs inkubert med Padre-spesifikke CD4 + T-celler hadde signifikant høyere ekspresjon av annexin V sammenlignet med de inkubert med medium kontroll, noe som indikerer at aktiverte CD4 + T-celler er i stand til å indusere apoptose av MDSCs (fig. 6). I tillegg observerte vi at MDSCs ko-dyrket med Padre-spesifikke CD4 + T-celler i kombinasjon med Fas-Fasl antagonist Kp7-6 signifikant redusert hyppighet av apoptose i forhold til kontrollen (fig. 7). Tatt sammen tyder disse data på at PADRE-spesifikke CD4 + T-celler induserer apoptose i MDSCs gjennom en Fas-Fasl-avhengige reaksjonsveien, noe som indikerer at MDSC drepingen kan skje via en ikke-antigen-spesifikke reaksjonsveien.
Renset milt CD11b + Ly6G
Hei MDSCs ble inkubert med Padre-spesifikke CD4 + T-celler eller medium kontroll i 24 timer. A. Representant flowcytometri plott som viser hyppigheten av CD11b + Ly6G
Hei Annexin V + MDSCs. B. Bar graf kvantifisering av data A (gjennomsnitt ± S.E.) (****
p
0,0001)
A.. Ekspresjon av Fas i MDSCs i nærvær og fravær av Padre-spesifikke CD4 + T-celler. B. Søylediagram kvantifiseringen av data i A (gjennomsnitt ± S.E.). C. Renset milt Ly6G
Hi MDSCs ble inkubert i 12 timer med Fas-agonist-antistoff (Jo2) eller irrelevant kontroll IgG, og den CD11b + Ly6G
Hi-celler ble analysert for frekvensen av apoptose (Annexin V + og 7-AAD -). D. MDSCs samtidig var dyrket med Padre-spesifikke CD4 + T-celler i 24 timer kombinert med irrelevant kontroll IgG eller Fas-Fasl antagonist Kp7-6. De CD11b + Ly6G
Hi-celler ble analysert for frekvensen av apoptose, karakterisert ved Annexin V + og 7-AAD-. Representant flowcytometri dot tomter viser hyppigheten av CD11b + Ly6G
Hei Annexin V + MDSCs. E. Bar grafen kvantifisering av dataene i D (gjennomsnitt ± SE) (***
p
0,001, ***
p
0,0001).
Diskusjoner
i denne studien har vi vist at behandling med cisplatin etterfulgt av intratumoral injeksjon av en potent adjuvant, CpG og Pan HLA-DR reaktiv epitop, PADRE peptid, genererer potent antigen spesifikk celle-medierte immunresponser og antitumorvirkninger. Av notatet, behandling med cisplatin, CpG og PADRE generert systemiske antitumor effekter og var i stand til å kontrollere svulster i fjerne områder. Videre vår behandling redusert populasjonen av MDSCs i tumor loci, og dermed redusere immunsuppresjon i svulsten mikromiljøet. Tatt sammen tyder disse data på at cisplatin, CpG og PADRE forbedre kryss presentasjon av tumor antigen for å generere tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celle-medierte immunresponser. Kombinasjonen av kjemoterapi, adjuvant og immunogen peptid presenteres her representerer en universell tilnærming til tumorkontroll.
Av notatet, ikke den nåværende trippelkombinasjonen behandling tilnærming inkluderer ikke innføringen av E7 antigen gjennom vaksinasjon. Likevel er generering av E7-spesifikke CD8 + T-celler observert (Fig. 4B). Vi grunn at den observerte E7-spesifikke CD8 + T-cellerespons fremkalles ved tverr presentasjon av de E7-antigenene som frigjøres fra tumor følgende cisplatin-indusert apoptose av antigenpresenterende celler. Type 1 Interferon produksjon etter CpG behandling også tjener til å fremme kryss-presentasjon.
Her ser vi at PADRE-spesifikke CD4 + T-celler er i stand til å drepe MDSCs gjennom Fas-Fasl interaksjon. I tillegg til Padre-spesifikke CD4 + T-celler blir i stand til å drepe MDSCs i svulsten mikromiljøet, kan eventuelle andre aktiverte T-celler også teoretisk drepe MDSCs. Faktisk har vi nylig vist at E7-spesifikke CD8 + T-celler og OT-1 T-celler er i stand til å indusere apoptose i MDSCs etter behandling med cisplatin, CpG og GP33 peptid (Wu et al, personlig kommunikasjon). Når aktivert, CD4 + og CD8 + T-celler frigjør relevante cytokiner slik som IL-2, som fører til oppregulering av Fas-ekspresjon på MDSCs. Fasl blir uttrykt av aktiverte T-celler selv. Som et resultat, når en aktivert T-celle møter en MDSC, vil MDSC gjennomgå Fas-mediert apoptose Fasl-[17]. Fjerning av immunsuppressive MDSCs fra svulsten mikromiljøet bidrar til tumorkontroll.
Den aktuelle studien fungerer som en plattform som kan være aktuelt for mange pasienter med ulike kreftformer. En unik egenskap ved PADRE peptidet er at epitopen den består av er spesifikk for mange MHC klasse II-molekyler, og er derfor anvendelig for mange personer. Videre forutsettes det at denne fremgangsmåten ikke krever identifikasjon av tumorantigenet. Den første runden av behandlingen kan indusere tumorcelledreping og frigjøring av tumor antigen inn i tumoren mikromiljøet, så vel som dannelse av Padre-spesifikke CD4 + T-celler (Fig. 3). Etter den etterfølgende runder med behandling, frigjøring av tumor antigen fører til kryss-priming og generering av tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celler, som er likeledes i stand til å drepe tumorceller (Fig. 4). På grunn av denne mekanismen, er det ikke nødvendig å vite immunodominante tumorantigener, slik at tilnærmingen potensielt vidt anvendelig.
Siden den aktuelle tilnærmingen innebærer intratumoral injeksjon av terapeutiske midler, er det mest aktuelt å tilgjengelige tumorer, for eksempel hode og hals, hud og cervical svulster. Imidlertid kan tilnærmingen være begrenset når det gjelder utilgjengelige tumorer, et problem som må tas opp for ytterligere å utvide dette konseptet for klinisk oversettelse. Dette kan løses ved å endre PADRE peptid å inkludere tumor homing eller svulst miljø målgruppe aptamerer. For eksempel, har CD13 ligand blitt vist å være i stand til å levere det antigene peptidet til tumor loci [18], [19] og fremkalle en antigen-spesifikk antitumorrespons [1]. I tillegg har vi vist at mesothelin og NKG2D kan anvendes som tumormålsøkende moduler i chimeriske proteiner, å levere terapeutiske proteiner for å tumor loci [20], [21]. Fremtidige studier er garantert å utvide anvendelsen av dagens tilnærming til utilgjengelige svulster.
Den tilnærmingen presenteres her kan være en ideell kandidat for klinisk oversettelse. Faktisk PADRE og CpG har blitt testet i ulike kliniske studier og funnet å være trygg.
