Abstract
høy sykelighet og dødelighet hos pasienter med spiserørs (E) og gastro- esophageal krysset (GEJ) kreft, garanterer nye prekliniske modeller for narkotika testing. Nytten av primær tumorxenotransplantater (PTXGs) som pre-kliniske modeller ble vurdert. Clinicopathological, immunhistokjemiske markører (p53, p16, Ki-67, HER-2 /
neu Hotell og EGFR), og globale mRNA overflod profiler ble evaluert for å bestemme utvalgsskjevheter av prøver implantert eller innpodet, sammenlignet med den underliggende befolkningen . Ni primære E /GEJ adenokarsinom xenograft linjer ble videre karakterisert for spekteret og stabiliteten av gen /protein-ekspresjon i løpet av passasjer. Syv primære esophageal adenokarsinom xenograft linjer ble behandlet med individuell eller kombinasjonskjemoterapi. Svulster som ble implantert (n = 55) i NOD /SCID mus hadde egenskaper som kan tyde på mer aggressiv biologi enn svulster som aldri ble implantert (n = 32). Av de implantert, 21/55 innpodet; engraftment var assosiert med dårlig differensierte svulster (p = 0,04) og eldre pasienter (p = 0,01). Uttrykk av immunhistokjemiske markører var lik mellom pasientprøve og tilhørende xenograft. mRNA forskjeller observert mellom pasient svulster og første passasje xenografter var i stor grad på grunn av tap av menneskeliv stroma i xenografter. mRNA mønstre av tidlige vs sene passasje xenotransplantater og med liten vs store tumorer av samme passasje var like. Komplett motstand var til stede i 2/7 xenografter mens de resterende svulster viste varierende grad av følsomhet, som forble konstant over passasjer. På grunn av deres evne til å rekapitulere primære tumor egenskaper under engraftment og over serieaging, kan PTXGs være nyttige kliniske systemer for vurdering av narkotika følsomhet for menneskelig E /GEJ kreft
Citation. Dodbiba L, Teichman J, Fleet A , Thai H, Starmans MHW, Navab R, et al. (2015) hensiktsmessigheten av å bruke pasient-Avledet xenograft modeller, for Farmakologisk Evaluering av nye behandlingsformer for Esophageal /Gastro-Esophageal Junction Kreft. PLoS ONE 10 (3): e0121872. doi: 10,1371 /journal.pone.0121872
Academic Redaktør: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, AUSTRALIA
mottatt: 13 juli 2014; Godkjent: 17 februar 2015; Publisert: 31 mars 2015
Copyright: © 2015 Dodbiba et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All mRNA uttrykk filer er tilgjengelig fra GEO databasen (tiltredelse nummer~~POS=HEADCOMP: GSE58870).
Finansiering: GL ble støttet av Alan B. Brown Chair in Molecular Genomics, Posluns Family Fund og CCO Chair i Eksperimentelle Therapeutics og befolkningsundersøkelser. Denne studien ble gjennomført med støtte fra Ontario Institute for Cancer Research til PCB gjennom midler gitt av regjeringen i Ontario. LEA ble støttet av en Ontario Institute for Cancer Research New Investigator Award. PCB ble støttet av en Terry Fox Research Institute New Investigator Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de siste tiårene har esophageal (E) og gastro-esophageal krysset (GEJ) kreft sett en dramatisk økning i forekomsten i utviklede land, mens de fem-års overlevelse er fortsatt lav på 19% [1]. Identifisere metoder for å velge hensiktsmessige medisinske behandlinger er derfor berettiget. Tradisjonelt har cellelinje paneler blitt brukt til hurtig å teste anti-kreftmidler [2,3]. I tillegg injeksjoner av cellelinjer i immunkompromitterte mus er vanlig
in vivo
modeller av legemidlets effekt [4,5]. Selv om cellelinje tilnærminger har i stor grad bidratt til utvikling av legemidler og kreft biologi, de er ufullkomne modeller for narkotika testing [6]. Videre tre mest brukte E /GEJ kreftcellelinjer ble nylig funnet å ha blitt forurenset av andre cellelinjer tidlig i kultur [7]. Dermed idetifying passende pre-kliniske legemiddel testing modeller av denne kreft er en utfordring.
Primær tumorxenotransplantater (PTXGs) lovende som alternative prekliniske modeller for narkotika følsomhet testing. PTXGs er skapt ved å implantere et stykke svulst direkte fra en pasient til svekket immunforsvar mus og bruke den resulterende xenograft for eksperimentering. Primære tumor xenograft-modeller av lunge [8], bryst [9], tykktarm [10], hode og hals [11] og E /GEJ-kreft [12] har vist seg å rekapitulere pasienten tumorhistologi og cellemorfologi i varierende grad. Fysiologiske forhold som temperatur, oksygennivå, næringsinnhold
etc
. ligne dem som er tilstede på cancerpasienter [6]. I tillegg har PTXGs ikke gjennomgått de seleksjonstrykk og vesentlige molekylære endringer som er involvert i cellelinje etablering og langsiktig vekst [6], [13,14]. Dermed kan PTXGs være mer sannsynlig å forutsi legemiddel svar enn cellelinjer dyrket enten
in vitro
eller
in vivo
. Men mens PTXGs har vist seg å etterligne den opprinnelige tumor responsen på behandlingen ganske nøyaktig [15-17], de er fortsatt utsatt for seleksjonskrefter som er relatert til forskjellene mellom mus og menneske microenvironments [18]. Derfor er det viktig å vurdere i hvilken grad PTXGs avviker fra de primære pasientsvulster på genomisk og protein nivå før du tar fatt på en omfattende legemiddelstudier.
Vi har tidligere beskrevet PTXG modellutvikling [12]. Det neste logiske skritt er det overordnede målet med denne studien: å vurdere nytten og begrensninger ved bruk av PTXG modeller for narkotika testing. Nærmere bestemt, i hvilken grad er E /GEJ svulster representant for pasient svulster, i sammenheng med farmakologisk evaluering? Våre egne eksperimenter på tvers av flere krefttyper har identifisert felles PTXG spørsmål som: (i) mangel på innpoding av mange svulster; (Ii) uventede muse dødsfall, som fører til behov for å endre og kjøre eksperimenter på tvers av ulike passasjer; (Iii) tekniske årsaker, som for eksempel behovet for å utvide xenografter i store kohorter og fryse ned tidligere passasjer å sikre tilgjengelighet for fremtidige studier, noe som resulterer i å måtte bruke senere passasjer for narkotika eksperimenter; og (iv) en og annen manglende evne til å identifisere spesifikke PTXG modeller med de samme molekylære egenskaper observert hos en pasient
Disse tekniske problemer heve fire viktigste modellrelaterte spørsmål, som kan angis som testbare hypoteser. (a) PTXG modeller er representative for den underliggende populasjonen av gastro-esophageal kreft (dvs. vurdere engrafting bias), og hvis ikke er helt representative, er vi i stand til å beskrive hva fordommer er til stede og hvordan de kan påvirke konklusjoner; (B) PTXG modeller er nyttige generelt, selv ved senere passeringer, da gen /protein ekspresjonsmønstre holde seg stabil; denne hypotesen måler graden av konfunderende av seleksjonstrykk under aging; (C) PTXGs kan rekapitulere det brede spekteret av molekylære karakteristika er representative for de underliggende primære cancere; Dette løser bekymringene til ikke å finne den inter-tumor heterogenitet nødvendig å utvikle personlig medisin tilnærminger til terapi; og (d) PTXGs svare på farmakologisk terapi stabilt over flere passasjer. Derfor vurderte vi potensialet i E /GEJ PTXGs å gjenskape det som er funnet klinisk i menneskelig E /GEJ svulster, og forholdene der disse PTXGs er hensiktsmessig å bruke som pre-kliniske narkotika testing modeller.
Materialer og metoder
klinisk og Patologisk Pasientinformasjon
Alle pasientene ble rekruttert gjennom skriftlige samtykke. Pasientinformasjon, inkludert behandling og utfall (
i
.
e
. Total overlevelse) ble innhentet gjennom elektronisk pasientjournal system ved University Health Network (uhn), Toronto, Canada, av gastro -intestinal onkologer. Den uhn forskningsetiske Board (REB #: 06-0982-CE). Godkjent studiet
Dyr og Tissue Processing
Ikke-Obese Diabetic-Severe Combined Immune Mangel (NOD /SCID) mus ble avlet internt i Ontario Cancer Institute (OCI) Animal Care anlegget. Alle dyr ble holdt i et patogen fritt miljø på en standard 12 timers dag /12 timers natt syklus og ble matet en standard sterilisert pellet kosthold og vann
ad libitum
. Dyrene ble avlivet ved hjelp av karbondioksyd, etterfulgt av cervikal dislokasjon. Alle prosedyrer ble godkjent av de etiske retningslinjene for OCI Animal Care Committee (dyr protokollen #: 1293,16).
Menneske E /GEJ kreft vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon ved uhn, Toronto, Ontario og ble behandlet som tidligere beskrevet [12]. For å oppsummere, ble friskt vev lagret i RPMI 1640 medium (uten FBS tilsatt) før det ble skåret i stykker på ca. 5mm dimensjoner og implantert subkutant i flanken av NOD /SCID-mus (i løpet av 24 timer etter reseksjon, men ble cancervev plassert i vevskultur materiale innenfor en median på 45 minutter etter reseksjon, og holdt i media før implantasjon). To representative stykker ble frelst i Optimal Cutting Temperatur (OCT) forbindelse (fryses ved -80 ° C for molekylær arbeid) og formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) steiner for molekylær og patologisk analyse, henholdsvis.
Behandling
årskull av 10 implantert mus per behandlingsgruppen ble overvåket for tumorvekst. Når synlig, ble tumorer målt ved hjelp av metriske calipers (Scienceware, katt: 134160001) to ganger ukentlig. Mus ble ofret når svulster nådde 15-20 mm på den lengste dimensjon, regnes en human endepunkt av Animal Care komiteen. Når tumorer nådde ca 300-750 mm
3, mus ble randomisert til kontroll- og kjemoterapiarmene. For enkelt behandlings forsøk ble mus kullene injisert en gang intraperitonealt med 6 mg /kg cisplatin (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02126613), 9 mg /kg paclitaxel (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02296624) eller 100 mg /kg av 5-fluoruracil (15 mg /ml, Hospira, DIN: 021 827 420), mens kontrollgruppen ble injisert med saltvann. For kombinerte behandlings forsøk ble kjemoterapi gruppen behandlet en gang med 5.4mg /kg cisplatin (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02126613) og 9 mg /kg paclitaxel (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02296624), på grunnlag av musetoksisitetsforsøk. Mus ble avlivet 24 timer etter den innledende behandling (merket som små svulster) og ved slutten av eksperimentet (store tumorer). En median av to mus (1-3) per arm ble ofret for sammenligninger. Svulster ble høstet og lagret i oktober og FFPE- blokker for molekylær /patologisk karakterisering.
Immunohistochemistry av molekylære markører
Vi har evaluert et panel av molekylære markører ved immunhistokjemi (IHC) for å studere deres stabilitet innenfor hver xenograft. Markører ble valgt basert på deres betydning for E /GEJ kreft. FFPE- vevssnitt ble farget med antistoffer mot p53 (klone DO-7, Vector Laboratories, Burlington, Canada, fortynning: 1: 250), p16
INK4a (MTM laboratorier AG, Heidelberg, Tyskland, ikke- utvannet), ki- 67 (Clone SP6, NEOmarkers, Rockford, USA, fortynning: 1: 500), EGFR (Clone 31G7, Zymed, San Fransisco, USA, fortynning: 1: 100), Her-2 /
neu plakater (klone A0485, Dako, Burlington, Canada, fortynning: 1: 25), HIF-1α (klon 54, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA, fortynning: 1: 50) og CD31 (klon PECAM1, Santa Cruz, USA, fortynning: 1 : 1000). En farge indeksen ble brukt til å evaluere CD31 og HIF-1α uttrykk ved hjelp av Aperio ImageScope viewer. Alle andre molekylære markører ble vurdert av en blindet team av patologer. En kombinasjon av en andel poengsum og en intensitet ble benyttet. Andelen score (andel positive tumorceller) var: 0: ingen, 1: 1-24%, 2: 25-49%, 3: 50-74, 4: ≥75%. Stillingen intensiteten (intensitet av farging av tumorceller) var: 0: ingen, 1: svak, 2: moderat, 3: sterk. En total poengsum ble oppnådd ved å kombinere begge score. I korthet ble p53 og p16 positiv hvis flekker dukket opp mens Ki-67 ble evaluert basert på prosentandelen av positive tumorceller. EGFR membran uttrykk bestemmes EGFR-positivitet. Her-2 /
neu
standard scoring ble brukt; prøvene ble ansett for å ha lignende uttrykk hvis de varierte med mindre enn en flekkintensitet (f.eks. 2+ 3+ vs). Tosidige t-tester ble brukt for å vurdere forskjeller i uttrykket for disse parametrene.
RNA Utvinning
RNA ble ekstrahert fra oktober innebygd xenograft og menneskelig vev (ti x 10 nm tykke Kryostat stykker) ved hjelp RNeasy mini-kits (Qiagen, 74104). RNA integritet ble vurdert ved hjelp av Agilent-2100-Bioanalyzer og RNA Nano-6000-kit (Agilent Technologies, 5067-1511) og kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop-ND-1000 spektrofotometer (Thermo-Scientific). RNA integritet nummer (RIN) av 7+ eller 8+ var som kvalitet konsentrasjon av pasienten og PTXG prøver, henholdsvis.
Merking og Hybridisering
Prøvene ble merket i henhold til Genechip WT Terminal Merking og Hybridisering manual, hybridisert human Gene-1,1-ST arrays (Affymetrix) og skannet med Genechip Scanner 3000-7G (Affymetrix). Alle matriser passert kvalitetskontroll kriterier (Expression Console programvare, Affymetrix).
Statistical Analysis
For kjemosensitivitet analyse ble forsinkelsen i tid for en svulst å doble i volum sammenlignet mellom behandlet linjer og deres tilsvarende ubehandlede kontroller. Forsinkelser ble bestemt ved å plotte tumorvolum på en logaritmisk y-skala og tegne en horisontal linje på dobling volum som snappet opp kontroll- og behandlingsvekstkurver. Tidsforsinkelsen ble bestemt som forskjellen i tid mellom de to skjæringspunkter og ble referert til som doblingstidsforsinkelse. Den gjennomsnittlige dobling tidsforsinkelse for bestandig vs. sensitive linjer ble beregnet ved å samle alle kontrollmusene og sammenligne dem med de samlede verdiene av behandlede mus.
Andre statistiske analysene ble utført på clinicopathological faktorer for å finne skjevhet i studien prøven og for å bestemme faktorer assosiert med engraftment. Tosidige t-tester ble brukt i alle tilfeller. Resultatene ble betraktet som signifikant når
p
-verdi 0,05. Statistiske analyser ble utført ved hjelp SAS.v.9.2 (Cary, NC).
Gene Profilering analyse
Både primær pasient kreft og matchet xenograft prøver ble brukt for transkriptom analyser (totalt, 51 prøver ble analysert for mRNA-overflod). Tjueen adenokarsinom svulster ble profilert (12 innpodet /9 ikke-innpodet). For åtte innpodet primær adenokarsinomer, ble en passasje en (P1) xenograft prøve profilert. I tillegg ble det utført analyser på 21 senere passasje xenografter (P3 gjennom P12), hvorav ni var fra små (tidlig i vekstkurve) svulster og 12 var fra store svulster.
Vi vurderte forskjeller i mRNA-profiler mellom (a) pasient svulster som innpodet
vs
de som ikke gjorde det, (b) P1 xenografter
vs
P0 (primær) svulster, (c) senere passasje xenografter
vs
P1, og (d) store
vs
små xenografttumorer innenfor samme passasje. For hver sammenligning, et gen-messig lineær modell var skikket til å sammenligne de to forholdene, justert for matrise batch og eventuelt for passering. En falsk-funnrate korreksjon ble utført for å ta høyde for flere testing [19].
Alle analysene ble utført ved hjelp av R (v2.15.3). Den pakker gitter (v0.20-15) og latticeExtra (v0.6-24) ble brukt for grafisk representasjon. Data pre-prosessering ble utført ved hjelp av RMA algoritme [20] (Affymetrix pakke, v1.36.0) kombinert med oppdaterte ProbeSet kommentarer (hugene11stv1hsentrezgcdf pakken, v15.0.0) [21]. Et uttrykk filter ble brukt for å fjerne eksperimentell støy. En lav-intensitet terskel er satt basert på kromosom-Y genet intensiteter av de fem kvinnelige pasientprøver som tidligere beskrevet [22]. Prober med en gjennomsnittlig log
2-transformert uttrykk verdi under fem ble fjernet. Totalt ble ~ 15.500 prober beholdt.
En maktanalyse ble utført med power.t.test funksjon (statistikk pakke v.2.15.3) for å anslå sannsynligheten for at forskjeller i uttrykk nivåer kunne identifiseres mellom grupper. Siden uttrykket data var i log
2-bue, en forskjell i gjennomsnittlig ekspresjon var ekvivalent med loggen
2-transform fold-endring. Antallet observasjoner per gruppe ble satt til 10 og signifikansnivå ble satt til 0.05 /15.500 = 3×10
-6 (
i
.
e
., Bonferroni korrigert). Strøm ble beregnet for et område av brette-endringer (| log2 brette endringer | fra 1,1 til 6) og av standardavvik. Vi beregnet fordelingen av standardavvik for genekspresjon og beregnet effekt for alle desiler. For 50% av genene, var det en 80% sjanse til å oppdage en | log
2 fold-endringer | 1,7 (~ FC 3) og høyere.
Resultater
klinisk-molekylær egenskaper knyttet til Implantasjon /engraftment
Nøkkel molekylære markører som gjenspeiler viktige veier som er relevante for E /GEJ ble evaluert i løpet av 90 primær resekterte tumorer, 55 av disse hadde tilstrekkelig vev ved reseksjon som skal implanteres (fig 1). Av implanterte prøver, 21 (38%) innpodet med hell (4 plateepitelkarsinom (SCC), 17 adenokarsinomer).
Siden ikke alle resected vev var tilgjengelig for implantasjon, var det viktig å finne ut om noen skjevheter eksisterer mellom implantert og ikke-implantert prøver. En multivariat analyse av begge undergrupper (SCC, adenokarsinom) og av adenokarsinom bare, avslørte en høyere sannsynlighet for implantasjon med svulster som ligger i GEJ (sammenlignet med enten Lower Third /Distal eller Mid /Øvre svulster, p = 0,01; Tabell 1).
av implantert prøver, vellykket engraftment var høyere i svulster som kommer fra eldre pasienter (OR = 1,10 /ti år øker, p = 0,01) og i dårlig differensierte tumorer (OR = 4,41, p = 0,04) . Her-2 /
neu
uttrykk var betydelig høyere i engrafting adenokarsinom prøver (OR = 2,51, p = 0,05). En sammenligning mellom innpodet og alle andre prøver (ikke podet og ikke-implantert) viste at svulster fra eldre pasienter (OR: 1,09, p = 0,01), Her-2 /
neu
positivitet (OR = 2,38, p = 0,03), og dårlig differensiering (OR = 6,48, p = 0,01) ble hver assosiert med en høyere sjanse for engraftment. Den samme sammenligning viste at i adenokarsinom undergruppe, de samme variablene, i tillegg til GEJ adenokarsinomer, var assosiert med høyere innpoding (p = 0,02; Tabell 1). En Cox proporsjonal risikomodell viste at total overlevelse var ikke signifikant forskjellig fra engraftment eller implantasjon status (p 0,05). Univariate analysene er vist i S1 og S2 bord.
En global mRNA overflod analyse av innpodet (n = 12) og ikke-innpodet (n = 9) adenokarsinom prøvene viste ingen forskjeller mellom de to gruppene. Selv uten å justere for multippel testing, bare 76 gener på tvers av en rekke forskjellige baner viste en forskjell i uttrykk med p 0.01.
Sammenligning av First Passage (P1) xenografter vs primære svulster
For å bestemme molekylære markører endringer med engraftment, protein uttrykk ble evaluert i sju par pasient svulster og tilsvarende xenografter (tabell 2A) . P53, P16 og EGFR ble scoret som «matching» eller ikke, da disse var vanligvis på /av fenomener, uten store variasjoner i graden av positivitet. P53 (5 av 7 tilfeller hadde primær-xenograft kamp), p16 (6/7), Her-2 /
neu product: (6/7), og EGFR membran uttrykk (5/7) viste høy samsvar mellom pasient tumorer (P0) og tidlig passasje (P1) xenografter. Ki-67 indeksene var også lik mellom pasient svulster og transplantater (p 0,05). Expression heterogenitet var til stede i de resterende tilfellene. Eksempler på uttrykket av disse markørene mellom pasient svulster og tidlig xenografter er vist i figur 2.
P53 i linje A og Ki-67 i linje H er eksempler på lignende uttrykk mellom pasient, tidlig passasje ( P1) og nyeste passasje (P
nyeste
) xenografter. P16 i linje H ble valgt for å demonstrere den heterogenitet detekteres i samme vev (P
tidlig
viser både positive og negative uttrykk). EGFR uttrykk i Linje E viser en økning i intensitet fra pasient til xenografter mens Her-2 /
neu
uttrykk i Linje A viste en nedgang i intensitet. Disse eksemplene ble tatt med for å vise at forskjellene utstilt mellom pasient vev, tidlig passasje og nyeste passasje xenografter skyldtes iboende heterogenitet og ikke til noen spesifikke mønstre av uttrykk.
I mRNA overflod analyse av primær pasientvev
vs
første passasje xenografter, fant vi god samstemmighet (figur 3, første kolonne) med R
2 verdier som spenner 0,52 til 0,88. Unsupervised hierarkisk clustering viste at xenografter gruppert sammen mens pasient svulster gruppert med andre pasient tumorer (S1 Fig). 2164 genene ble uttrykt forskjellig mellom P0 og P1 svulster (falske funnraten 5%).
Sammenligninger ble gjort mellom P1 xenograft
vs
pasient tumor (venstre kolonne), P
siste
vs
P
tidlig xenograft (midten kolonne) og stor
vs
Liten xenografttumorer (høyre kolonne). Normaliserte uttrykk nivåer for individuelle gener ble brukt til å plotte sammenligning. R «sup> 2 verdier er tatt med for hver sammenligning. mRNA for linjer F og jeg kunne ikke hentes ut for alle sammenligninger siden mRNA degradering i den frosne vevet hadde skjedd. Begge prøvene hadde intakt mRNA for pasienten svulst men Linje jeg ikke har en matchende senere passasje xenograft mens Linje F ikke har en matchende første passasje xenograft. Begge linjene ble inkludert i statistiske sammenligninger hvor dataene var til stede.
En liste over GO (genet ontologi) termer ble brukt til å verifisere at de mest betydningsfulle mRNA overflod forskjeller mellom P0 og P1 er på grunn av tap av menneskelig stroma i xenograft. Vilkår knyttet til stikkord som immunsystemprosess, endotelial celledifferensiering, fibroblast spredning, erytrocytt differensiering
etc
. ble brukt som selektive markører for stromale gener. Vi brukte en strengere definisjon for inkludering som en stromal genet, med forventning om at mange flere potensielle stromal gener kan være savnet. Ved hjelp av denne definisjonen av 15,630 gener på microarray, ble 1410 (9,02%) knyttet til stroma. Av de 2,164 genene som viste betydelig differensial uttrykk mellom primærsvulster og passage jeg xenografter 338 (15,6%) var knyttet til stroma, viser berikelse (p = 0,0001).
omveltningene Etter serieaging
for å vurdere om betydelige molekylære endringer skjer i xenografter etter flere passasjer, vi evaluert de samme molekylære markører som ovenfor i tidlig passasje (P1, store svulster) og sent passasje (siste passasje tilgjengelig for sammenligning, store svulster) i syv linjer. I likhet med forrige analyse, p53 (5 av 7 var lik), p16 (6/7), Her-2 /
neu product: (6/7), EGFR membranous uttrykk (5/7) og ki- 67-indeksen viste god korrelasjon mellom tidlige og siste passasje xenografter (Tabell 2B). Eksempler på uttrykket av disse markørene mellom tidlig og siste passerings xenografter er vist i figur 2.
Tidlig og sent passasje xenograft mRNA overflod profiler viste at ingen signifikante forskjeller igjen etter falske funnrate justering. I en prospektiv subgruppeanalyse bruker en mindre streng terskel for signifikans (p 0,01), bare 64 gener viste en forskjell i uttrykk. I tillegg scatterplots av genuttrykk i tidlig passasje (P
tidlig) og nyeste passasje (P
nyeste) for hver xenograft linjen viste at det var svært få endringer skjer som xenotransplantater ble passert serielt (fig 3, andre kolonne). En hierarkisk clustering analyse funnet at transplantater gruppert innenfor deres tilsvarende tumorlinjer og ikke etter passering (S1 figur).
Små og store xenografter innenfor samme Passage
Liten (tidlig i vekstkurven ) og store (sent i vekstkurve) tumorer innenfor den samme passasje ble også sammenlignet for å bestemme om det var noen forskjeller i underliggende xenografter i en og samme passasje (men av forskjellige størrelser). P53, P16, Her-2 /
neu Hotell og EGFR uttrykk var lik (tabell 2C). mRNA overflod analyse viste at det ikke ulikt uttrykte gener kunne identifiseres etter falske funnrate justering. Kun 23 gener ble uttrykt forskjellig når du bruker en mindre streng terskel for signifikans (p 0,01).
tumorvekst Kinetics og kjemosensitivitet
For å finne ut om E /GEJ xenografter kan brukes til å vurdere stoffet responser (sensitivitet og resistens), vi behandlet og analysert responsen av flere linjer til kjemoterapi. Cisplatin, paclitaxel og 5-FU ble valgt på grunn av sin omfattende bruk i kliniske settinger for E /GEJ krefttilfeller. Innledende resultater med to linjer (linje B og F i figur 4) ble tidligere rapportert i Dodbiba et al, 2013 [12]. Her strekker vi våre studier til et større antall xenograft linjer.
gjennomsnitt ± SEM (n = 10 mus pr gruppe) ble plottet. Pilene viser tiden på behandlingen. Linjer er anordnet i stigende rekkefølge av deres tidsforsinkelse ved å doble volumet (TD), målt i dager (d). (A) Sju adenokarsinom linjer varierer i graden av følsomhet for disse midlene. Lines A og B viser klare tegn på motstand mens de resterende linjene viser ulike grader av sensitivitet. Linje H ble testet for cellegift, men på grunn av mus toksisitet kunne ikke fullføres. På grunn av den langsomt voksende arten av tumoren, ble Linje jeg ikke testet på grunn ikke nok vevet kunne formeres. (B) Den squamous cell carcinoma linjen er meget følsom for behandling og er presentert her for sammenligningsformål. Merk: Dataene for Linje B (P5) og Line F (P11) har tidligere blitt publisert og tilsvarer linje 8 (P5) og Line 1 (P11) i Dodbiba et al. Lab. Investere. 93, 397-407 (2013).
tumorlinjer oppviste et bredt spekter av kjemosensitivitet til en samlet dose av paclitaxel og cisplatin (figur 4). Ved plassering av linjene i stigende rekkefølge for å doble tidsforsinkelse, de adenokarsinom linjer dannet tydelige mønstre (S2 Fig). Resistente adenokarsinom linjer viste liten eller ingen forsinkelse (gjennomsnitt 2,3 dager, linjer A og B), mens de følsomme linjene kan deles inn i to kategorier: (1) Sensitive-Bunn linjer viser initiale krymping etter behandling, etterfulgt av gjenvekst på et tilsvar sats til kontrollgruppen (gjennomsnittlig dobling tidsforsinkelse på 4,4 dager, Linjer C og D); og (2) Sensitive-ΔSlope linjene viser ingen eller svært lite svinn, men veksten fortsatte med en redusert skråning (som representerer lavere vekst) sammenlignet med kontrollene (gjennomsnittlig forsinkelse på dobling tid på 6,7 dager, Linjer E, F og G). Den største forsinkelsen (
i
.
e
., Største kjemosensitivitet) ble utstilt ved plateepitelkarsinom linje (gjennomsnittlig forsinkelse på 19,6 dager).
For å evaluere hvis kjemosensitivitet egenskaper linjene endret med passering, vi behandlet tre linjer (B, F og D) med ulike kjemoterapikombinasjoner på tvers av ulike passasjer. Oppførselen til hver linje var lik mellom passasjer og på tvers av behandlingsmetoder. Linje B utstilt motstand mot individuelle behandlinger av cisplatin, paclitaxel og 5-FU ved passering 3, og var tilsvarende motstandsdyktig mot en samlet dose av cisplatin og paclitaxel ved passering 5 (S3 fig). Linje F viste følsomhet for den initielle individuelle behandlinger av cisplatin, paclitaxel og 5-FU ved passering 8 og fikk motstand mot disse behandlingene ved å bli gitt en ny dose. Ved passasje 11, linjen igjen oppviste følsomhet til et første kombinerte dose av cisplatin og paclitaxel, og på lignende måte viste ingen ytterligere vekst-forsinkelse ved den andre behandling (S3 Fig). Kjemosensitivitet til samme behandling (kombinert dose av cisplatin og paclitaxel) endret ikke på tvers av ulike passasjer av Linje D (S3 fig). Når du analyserer doblingstidsforsinkelse for disse linjene på ulike passasjer, gjorde kjemosensitivitet ikke endres fra passering til passering. Totalt sett iboende motstand, gevinst på motstand og kjemosensitivitet holdt seg konstant over passasjer.
molekylære markører, kjemosensitivitet og Response i Human Motparts
Uttrykk av p53, p16, Ki-67, EGFR og her- 2 /
neu
var lik på tvers av svulster i forskjellige kjemosensitivitet mønstre. For å avgjøre om hypoksi var relatert til chemoresistance, evaluert vi også HIF-1α atom uttrykk og CD31 uttrykk i paret kontroll og behandlede tumorer. Verken CD31 eller HIF-1α viste endringer i uttrykk etter behandling på tidlige vekstfasen eller endepunkt (p 0,05). I tillegg, ingen endringer i proteinuttrykk kunne påvises mellom de tre hoved kjemosensitivitet kategorier (p 0,05), selv om denne studien ikke var planlagt for å oppdage små forskjeller. Således ingen av de markører som ble testet var prediktivt for terapi reaksjonsevne, men forble konstant før og etter kjemoterapi (data ikke vist).
Av syv linjer som var chemo-behandlet som xenotransplantater, bare tre ble også behandlet ved bruk av kjemoterapi i deres menneskelige motstykker (linje A, D og E). Av disse var det bare to pasienter sammenlignes for behandlingsrespons med de tilhørende xenografter (Lines D og E). Respons på behandling hos pasientene ble evaluert
via
en CT scan utført innen to måneder etter behandlingsstart. Både Pasient D (behandles med Epirubicin, Cisplatin og 5-FU) og Pasient E (5FU, Cisplatin og Radiation) hadde stabil sykdom etter behandling. Selv om pasienter behandles på en annen måte, er denne observasjonen likt med det som ble sett i xenotransplantater hvor følsomheten av linjen D og E ble funnet i midten av responsen diagrammet (S2 figur).
diskusjon
for å vurdere den potensielle nytten og begrensninger av E /GEJ PTXGs, demonstrerte vi følgende:
innpodet svulster hadde dårligere differensiering og høyere flekken intensitet Her-2 /
neu
, sammenlignet til ikke-implantert og /eller ikke-podet tumorer. Denne tendensen til å ha mer biologisk aggressive svulster [23-25] innpodet er nyttig for våre mål, siden målet med pre-klinisk narkotika testing er å utvikle nye behandlingsformer som er rettet mot behandlingsresistente pasienter. Av notatet er at ikke alle resected vev var tilgjengelig for implantasjon på grunn av behovet for å prioritere klinisk bruk. Mindre svulster eller svulster som margin engasjement var tvilsom eller vanskelig å skille fra arrdannelse på grunn av tidligere kjemoterapi-strålebehandling eller mangel på tilgjengelighet av en patolog innenfor tidsrammen for å godkjenne forskningsbruk av prøven, påvirket som vev vil være tilgjengelig for implantasjon.
