Abstract
Bakgrunn
En stor utfordring i behandling av bukspyttkjertel ductal Effektivt adenokarsinom er svikt i kjemoterapi, noe som sannsynligvis skyldes tilstedeværelse av kreft stamceller (cscs).
Mål
for å identifisere side befolkningen (SP) celler og karakter s-lignende egenskaper i menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (h-PCCLs) og for å utnytte effekten av samtidig målretting av flere viktige transkripsjonsfaktorer som styrer stemness av pankreas cscs undertrykke CSC-lignende fenotyper.
Metoder
flowcytometri og Hoechst 33342 DNA-bindende fargestoff efflux-analyse ble brukt for å sortere SP og ikke-SP (NSP) celler fra tre h-PCCLs: Panc-1, SW1990, og BxPc-3. Den selvfornyelse evne, invasivitet, migrasjon og narkotika motstand av SP celler ble evaluert. Uttrykk av CSC markørgener ble analysert. Tumorgenisitet ble vurdert ved hjelp av en xenograft modell i nakne mus. Virkninger av en kompleks lokkedue oligonukleotid (cdODN-SCO) designet for å samtidig målrette Sox2, Oct4 og c-myc ble vurdert.
Resultater
cscs ble beriket i siden andelen (SP) celler inne i h-PCCLs og besatt de aggressive vekst, invasjon, migrasjon og narkotika-motstand egenskaper, sammenlignet med NSP celler. SP celler overuttrykt stamcellemarkører CD133 og ALDH1, pluripotency opprettholde faktorer Nanog, Sox2 og Oct4, onkogene transkripsjonsfaktor c-myc, signaliserer molekyl Notch1 og resistente genet ABCG2. Videre SP-celler konsekvent vist vesentlig større enn tumorgenisitet NSP celler i xenograft modell av nakne mus. CdODN-SOC undertrykte effektivt alle CSC egenskaper og fenotyper, og minimalisert den tumorgene evne til SP-celler og resistens mot kjemoterapi. Til sammenligning var negativ kontroll ikke klarte å gjøre det.
Konklusjon
Funnene tyder på at målretting viktige gener som gir den stemness av cscs effektivt kan eliminere CSC-lignende fenotyper, og dermed kan vurderes en ny metode for behandling av kreft. Spesielt etablerer denne studien kombinasjonen av Sox2 /Oct4 /c-myc målretting som en potensiell anti-kreft i bukspyttkjertelen middel verdig videre studier i prekliniske innstillinger
Citation. Wang X, Liu Q, Hou B, Zhang W, Yan M, Jia H, et al. (2013) Samtidig målretting av flere nøkkeltranskripsjonsfaktorer forstyrrer Effektivt kreftstamceller Beriket i Side Befolknings av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 8 (9): e73942. doi: 10,1371 /journal.pone.0073942
Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Storbritannia
mottatt: 19 april 2013; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 11.09.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC), kjent under sitt aggressivitet i naturen, er en svært dødelig malignitet som vanligvis diagnostisert på et sent stadium hvor optimale terapeutiske alternativer har blitt hoppet over [1]. Den dårlig prognose kan forklares ved slutten av påvisning av neoplastiske prosessen, mangelen på effektiv behandling, og begrenset kjennskap til sine biologiske egenskaper. Derfor er bedre forståelse av de cellulære /molekylære egenskaper assosiert med denne tilstanden sterkt behov for å utforske nye arenaer for diagnostikk og behandling av denne dystre sykdommen.
Emerging bevis tyder på at ondartede svulster består av en liten del av distinkte kreftceller, kalt «kreft stamceller» (cscs), typisk mindre enn 5% av de totale kreftceller basert på markeringen celleoverflate-ekspresjon [2-6]. Cscs finnes i en sub-populasjon av celler som er forskjellig fra den største populasjonen i løpet av tumorer eller hematologiske kreftformer, som kalles «sidepopulasjons» celler (SP-celler) som oppviser stamcelle-lignende egenskaper. Cscs har evnen til å fornye seg selv og for å generere de heterogene linjer av kreftceller som omfatter tumoren; de er derfor tumorigene, i motsetning til andre ikke-tumorigene cancerceller, og er viktige drivere for tumorprogresjon og metastase. Klinisk enda viktigere er imidlertid det faktum at cscs også gi virulens via immunsystem unnvikelse og multimedikament resistens mot kjemoterapi og radioterapi som resulterer i deres relative anrikning under behandling og raskt tilbakefall av sykdommen [2-6]. Effekten av kreftbehandling blir ofte målt ved ablasjon fraksjon av tumormasse, og konvensjonelle kjemoterapier drepe differensierte eller differensierende celler, som utgjør hoveddelen av tumoren, men er ute av stand til å generere nye celler. Som cscs danner en relativt liten andel av tumoren, kan de forbli ikke-angrepet, forårsaker et tilbakefall av sykdommen. Derfor, utvikling av spesifikke terapier rettet mot cscs har enorm håp for forbedring av overlevelse og livskvalitet for kreftpasienter, spesielt for lider av metastatisk sykdom.
cscs har blitt identifisert i PDAC og bukspyttkjertelkreft cellelinjer av flere laboratorier [7-14]. Menneske bukspyttkjertelen cscs uttrykker høye nivåer av CD133, CD24, CD44, ESA, og aldehyd dehydrogenase (ALDH1) har også mer rikelig Nanog, Oct4, Notch1, MDR1 og ABCG2 enn normalt bukspyttkjertelen vev og primære kreft i bukspyttkjertelen celler [10-12,14, 15]. Det ser ut til at PDAC ikke bare inneholder en homogen populasjon av cscs i stedet for forskjellige subpopulasjoner som kan ha utviklet seg i løpet av tumorprogresjon, basert på bruken av kombinasjoner av overflatemarkører som tillater deres isolasjon, forplantning, og videre karakterisering. En av disse populasjonene kalles trekkende cscs og disse cellene er i stand til å gå utenom primærtumor og reiser til fjerne steder som lever som den foretrukne stedet for metastatisk spredning.
Derfor vellykkede behandlinger av kreft ikke bare stole om å identifisere kilden til kreftceller og anticancerterapi for de differensierte kreftcellene, men også på å finne potensiell CSC populasjon og å nå tilstrekkelig ødeleggelse av cscs i tumoren. Faktisk har CSC-målrettede tilnærminger vist store løftet i prekliniske modeller [2-6]. Disse metodene inkluderer direkte strategier, for eksempel ablasjon ved å målrette molekylære markører for cscs eller CSC-spesifikke veier, reversering av resistensmekanismer og differensiering terapi og indirekte strategier, som antiangiogen terapi, immunterapeutiske tilnærminger, og forstyrrelse av protumorigenic interaksjoner mellom cscs og deres mikromiljøet.
Denne studien ble gjennomført for å oppnå følgende to hovedmål. Først, for å ha en omfattende karakterisering av CSC populasjonene i humane bukspyttkjertel cancer-cellelinjer, sammenlignet vi SP-celler i BxPc-3, PANC-1 og SW1990 cellelinjer. For det andre, å utnytte muligheten for samtidig sikte på flere transkripsjonsfaktorer som styrer stemness av bukspyttkjertelen cscs å forstyrre cscs dermed tumorigenesis og metastasering, har vi designet en lokkedue oligonukleotider fragment av «en agent, flere mål» -konseptet og testet effekten av dette molekylet til stillhet på stemness av bukspyttkjertelen cscs.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
den brukes av alle dyr i denne studien ble godkjent av, og alle operative prosedyrer og dyr omsorg strengt dannet retningslinjer fastsatt av, dyreetikk komité i Xinjiang Medical University og Sun Yat-sen-universitetet.
Cell kultur
den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer BxPc-3, Panc-1 og SW1990 opprinnelig etablert fra menneske primære bukspyttkjertelen adenokarsinom av ATCC ble kjøpt fra Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kina) og dyrket i vårt laboratorium. Alle cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Medium ble supplert med 1% penicillin /streptomycin, 3 mM L-glutamin og 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco). Celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C inneholdende 5% CO
2.
Strømningscytometri-analyse og cellesortering
SP-celler er en liten gruppe av celler som flekke eller svakt ikke i det hele tatt når de behandles med Hoechst 33342 fargestoff. Disse cellene kan bli isolert ved hjelp av flowcytometri protokoller opprinnelig etablert ved Goodell et al. i en studie av murine benmarg [16,17]. H-PCCLs ble løsnet fra dyrkningsskål med 0,25% trypsin, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), og suspendert i 1 x 10
6 celler /ml i dyrkningsmedium inneholdende 2% FBS. Tumorceller og cellelinjer ble inkubert med Hoechst 33342 fargestoff (Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml, med eller uten verapamil (100 uM, Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i 90 minutter med periodevis rysting hver 15 min. Verapamil ble brukt for å verifisere SP fenotype, da det kan redusere den sidegren ved å blokkere multilegemiddel transportører. Etter å ha vasket to ganger med PBS, ble cellene resuspendert i iskald PBS inneholdende 2% FBS, ført gjennom en 40 pm sikt filter for å tilveiebringe enkelt-cellesuspensjoner, og holdt på is inntil strømningscytometri-analyse. Propidiumjodid (PI; 2 ug /ml; Sigma-Aldrich) ble tilsatt for å merke og ekskludere døde celler. Cell analyse og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) ble utført ved bruk av en FACS Vantage SE utstyrt med versjon 6.0 av FACS DIVA programvare (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia). Hoechst 33342 fargestoff ble opphisset av en 350 nm ultrafiolett laser og fluorescens utslipp var dual-bølgelengde analysert (Hoechst blå med 402-450 nm filter, Hoechst rød med 650-670 nm filter).
Cell spredning og cellecyklus-analyser
Ett tusen sortert SP og ikke-SP (NSP) celler ble sådd inn i separat brønn i en 96-brønns plate i triplikat og dyrket i Leibovitz L-15 medium med 1% penicillin /streptomycin og 10 % FBS i 3 dager. Veksten ble målt ved bruk av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) -metoden. I korthet, 20 ul MTT-løsning (5 mg /ml i PBS, Sigma) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. En 150 ul alikvot av DMSO ble deretter tilsatt, og absorbansen ble målt med en mikroplateleser (Multiscan MK3, Thermo Labsystem, USA) ved en bølgelengde på 490 nm.
For cellesyklus-analyse, 5 x 10
5 ferskt sorterte cellene ble vasket to ganger med PBS og fiksert med 2 ml 70% iskald etanol ved 4 ° C over natten. Cellene ble deretter overført til PBS, farget med 20 ug /ml PI og 1 mg /ml RNase, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Resultatene er uttrykt som prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen.
Klon formasjons assays
De følgende trinn ble anvendt for analysene (1). -Agar (10 g /l; DNA-kvalitet) ble smeltet i mikrobølgeovn og 2 x DMEM supplementert med 200 ml /l FBS ble oppvarmet til
oC 40 i et vannbad. Like volumer av disse to oppløsninger ble deretter blandet for å gi en ny løsning på 5 g /l agar + 1 x DMEM + 100 ml /l FBS (2). Deretter ble 1 ml blandet løsning tilsatt til hver brønn i en 6-brønns plate for å danne basis-agar (3). Deretter ble 7 g /l agar (DNA-kvalitet) smeltet i mikrobølgeovnen og avkjølt til
oC 40 i et vannbad, og 2 x DMEM og 200 ml /l FBS ble oppvarmet til den samme temperatur (4). Ferskt sortert SP og ikke-SP-celler ble ført gjennom en 40-mikrometer filter for å gi en enkeltcelle-suspensjon og ble tellet. Tre ml DMEM, 1,5 ml 2 x DMEM inneholdende 200 ml /l FBS og 1,5 ml agar inkludert 500 sorterte cellene ble deretter blandet sammen, og en 1,5 ml cellesuspensjon av denne oppløsning ble anbragt i hver brønn av en 6-brønns plate som top agar (5). Til slutt ble 100 celler sådd ut i hver brønn, og ble inkubert ved
oC 37 i en fuktet inkubator i 2-3 wk. Kolonier ble enten til venstre uten flekker, eller ble farget med 5 g /l MTT (Sigma-Aldrich) i 1 time, og tellet under et disseksjonsmikroskop (fremgangsmåten ble gjentatt tre ganger) (6). Etter at SP-celler ble sådd ut i soft agar-analyser ble kolonier som inneholdt mer enn 50 celler (primærkoloni) fjernes fra bløt agar med steril Pasteur pipetter, ble behandlet med trypsin og mekanisk dissosiert til enkeltceller. Deretter trinn (5) ble gjentatt for den sekundære kolonien.
Sphere formasjons analyser
Ordnet SP og NSP celler fra de tre h-PCCLs ble passert gjennom en 40-mikrometer filter for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Deretter, 4 ml medium inneholdende 100 celler ble tilsatt til 6-brønns plater med serumfritt kulturmedium DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies) supplert med epidermal vekstfaktor (10 ug /l), insulin (20 mg /L) og bFGF (10 ug /l). Aliquoter av epidermal vekstfaktor, insulin og basisk fibroblast vekstfaktor ble det tilsatt to ganger i uken. Etter 10 d, ble platene visuelt undersøkt for dannelsen av flytende kuler og kulene ble talt under et disseksjonsmikroskop.
Invasion assay
Invasivitet av sortert SP og NSP-celler ble bestemt ved bruk av 6-brønns Matrigel invasjonen kamre (BD Biosciences Disco Laboratorium). Celler ble sådd ut i toppkammeret på Matrigel belagte membran (24-brønns innsats, porestørrelse, 8 mm; Corning Costar) ved 2 x 10
5 per innskuddet i serumfritt DMEM ved 37
oC med 5 % CO
2 i 48 timer. Ytre brønner ble fylt med DMEM inneholdende 5% FBS som cellegift-tiltrekkende. De ikke-invaderende celler ble fjernet ved pensling toppsjikt av Matrigel med Q-tips. Membranen inneholdende invaderende celler ble farget med hematoksylin i 3 minutter, og deretter vasket og montert på objektglass. De invaderer celler på hele membranen ble talt under et lysmikroskop ved 40 × objektiv.
Transwell migrasjon analysen
Ordnet SP eller NSP celler på 1 x 10
5 ble belagt i toppkammeret på den ikke-belagte membran (24-brønns innsats, porestørrelse, 8 mm; Corning Costar) og tillatt å migrere mot serumholdig medium i det nedre kammer. Celler ble fast etter 24 timer inkubasjon med metanol og farget med 0,1% krystallfiolett (2 mg /ml, Sigma-Aldrich). Antall celler invaderer gjennom membranen ble regnet under et lysmikroskop (40 ×, tre tilfeldige felt per brønn).
Drug motstand analyse
Uttak av 2 × 10
3 fersk sortert SP og NSP-celler ble sådd ut i 96-brønners plater i tre eksemplarer med 200 ul DMEM per brønn. Etter en 12-timers restitusjonsperiode, ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin i 72 timer. Virkningene på celleveksten ble undersøkt ved MTT-analyse som beskrevet ovenfor. Celleoverlevelsesrate (SR) ble beregnet ved anvendelse av formelen: SR = (bety absorbansen til testbrønnen /betyr absorbansen til kontroll) x 100%; cellemotstanden rate (RR) ble beregnet ved anvendelse av formelen:. RR = 100% -SR
apoptotiske celler ble bestemt med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -Annexin-V metoder. I korte trekk, ble ferskt sorterte cellene sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn. Etter 12 timer for utvinning, ble cellene eksponert for varierende konsentrasjoner av gemcitabin i 48 timer. Cellene ble deretter farget med Annexin-V og PI bruker ApoAlert ™ Annexin V apoptose Kit (Clontech, Cosete Tech, Jinan) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene høstet ved trypsinering og vasket to ganger med kald PBS. Pelletene ble resuspendert i 100 pl 1 x Annexin bindingsbuffer og 5 pl FITC-Annexin-V. En en-pl arbeidsløsning av PI på 100 ug /ml ble tilsatt til hver 100 pl cellesuspensjon. Cellene ble inkubert på is i 1 time, vasket en gang med kald PBS og resuspendert i 300 pl 1 x Annexin-bindingsbuffer. De fargede cellene ble umiddelbart analysert ved hjelp av strømningscytometri.
In vitro differensiering studie
Ferskt sortert SP og NSP-celler ble dyrket ved en tetthet på 1 x 10
5 celler /brønn i en 6-brønners kulturplate i Leibovitz L-15 medium med 1% penicillin /streptomycin og 10% FBS og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. Etter 7 dager, SP- og ikke-SP-avledede celler ble på nytt analysert med hensyn på tilstedeværelsen av et SP-fraksjonen ved anvendelse av metodene beskrevet ovenfor.
tumorgenisitet assay in vivo
atymiske 4- til 5 -week gamle mus (BALB /c naken mus) ble levert av SLAC Laboratory Animal (Shanghai). Mus ble plassert og vedlikeholdes i laminær skap under patogenfrie forhold. Grupper av mus ble orthotopically inokulert s.c. til venstre ryggsiden av mus med fersk sortert SP celler på 1 x 10
3, 1 × 10
4, 1 × 10
5, og 1 x 10
6 eller NSP celler på en × 10
3, 1 × 10
4, 1 × 10
5, og 1 x 10
6 (fire mus per gruppe). Tumorvekst ble overvåket hver 2 dager etter andre uke av vaksinasjon. Musene ble avlivet på dag 50 eller når tumorene vokse til et maksimum på 1000 mm
3. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen 0,52 x lengde x bredde
2. Ganger forskjell i tumordannelse ble beregnet ved følgende formel: NSP
min /SP
min, hvor NSP
min, er det minste antall NSP celler som trengs for å generere en tumor og SP
min, er den minimale antall SP-celler som trengs for å generere en svulst. Til slutt, tumorer ble også fordøyet for å lage enkeltcellesuspensjon for SP re-analyse av de Hoechst33342 fargestoff dyseutstrømningen-analyse som beskrevet ovenfor.
Når de h-PCCL-induserte tumorer nådde et volum på omtrent 200 mm
3, en gruppe av mus fikk gemcitabin (200 mg /kg kroppsvekt ip, en injeksjon hver 3. dag, 6 injeksjoner totalt), og den andre gruppen (bærer de tilsvarende tumorer) ble injisert med bærer (0,9% NaCl; kontrollgruppen ). Tumor diameter ble målt hver 3 dager etter første injeksjon. Gemcitabin ble ansett som effektiv når tumorvolumet ble redusert med minst 50%. Tre dager etter den siste injeksjonen, ble musene avlivet og tumorene analysert for å bestemme andelen av SP-celler, som beskrevet ovenfor.
RNA-ekstraksjon og real-time PCR-analyse
sorterte cellene og dyrkede celler var behandlet med TRIzol reagens (Invitrogen Kina Limited, Shanghai) og blandes grundig med pipettering. De TRIzol-lysater ble deretter blandet med kloroform og sentrifugert ved 15.000 x g i 15 min. Etter sentrifugering ble totalt RNA innhentet av isopropanol nedbør i henhold til produsentens instruksjoner.
Enkelt strand cDNA ble revers transkribert fra total RNA ved hjelp tilfeldig primer under standardbetingelser med høy kapasitet cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). Kvantitativ real-time PCR med total cDNA ble utført med SYBR Grønn Master Mix sanntid Kjerne Reagenser på en ABI 7500 (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Amplifikasjonene ble utført ved 95 ° C i 10 sekunder etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 30 sek. For å kvantifisere den relative uttrykk for hvert gen, de Ct (terskel syklus) verdier ble normalisert for endogen referanse (
ΔCt = Ct target- Ct β-aktin) og sammenlignet med en kalibrator, ved hjelp av «
ΔΔCt metode «(
ΔΔCt =
ΔCt
sample –
ΔCt
kalibrator). Bruke
ΔΔCt verdi, ble relative uttrykk beregnet (
2-ΔΔCt). Som
ΔCt metoden gjelder bare når forsterknings effektiviteten av målet og referansen er i hovedsak lik, bestemt vi effektiviteten for 5 fortynninger, og delta Ct-verdiene (Ct
target-Ct
β- aktin) ble plottet mot utvanning (log). Helningen av linjen montert ble deretter bestemt. Alle prøver ble testet in triplo, og de gjennomsnittlige verdier ble anvendt for kvantifisering.
Western blot-analyse
Membran og cytosoliske proteinprøver ble ekstrahert fra SP og NSP celler fra alle tre H-PCCLs. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved proteininnholdet ble bestemt ved BCA Protein Assay Kit ved bruk av bovint serumalbumin som standard (Pierce, USA). Like mengder av proteinprøver (~ 50 ug) ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE (12% polyakrylamidgeler) og elektroforetisk overført til PVDF-membran (Millipore, Bedford, MA) ved bruk av et mini Trans-blot (Bio-Rad Laboratories, Shanghai). Proteinprøver (membranprøve for ABCG2 og CD133; cytosoliske prøve for ALDH1, Oct4, Sox2 og Nanog) ble inkubert med primære antistoffer i 1: 200 ved 4 ° C over natten. Affinitetsrenset kanin polyklonale anti-ABCG2 (Shanghai Ruiqi Bioteknologi Co LTD), kanin polyklonale anti-CD133 (Shanghai Xiangsheng Biotech Co LTD), kanin polyklonale anti-Oct4 (Cell Signa Shanghai), kanin polyklonale anti-Sox2 (Shanghai Excell Bio Co. LTD), ble kanin polyklonalt anti-ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), og kanin-polyklonalt anti-Nanog (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) anvendt som primære antistoffer. Neste dag, ble membranen inkubert med sekundære antistoffer (Molecular Probes) fortynnet i PBS i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt ble membranen vasket med PBS før skanne ved hjelp av infrarød Imaging System (LI-COR Biosciences). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll for lik input av proteinprøver, ved anvendelse av anti-GAPDH-antistoff. Western blot band ble kvantifisert ved hjelp QuantityOne programvare ved å måle bandet intensitet (Area × OD) for hver gruppe og normalisering til GAPDH. De endelige resultatene er uttrykt som fold endringer av normalisere data til kontrollverdiene.
Utarbeidelse av komplekse decoy oligodeoksynukleotid (cdODN)
Vi har utformet en cdODN bærer konsensussekvenser for fire transkripsjonsfaktorer Sox2, Oct4, og c-Myc, etter prinsippet etablert av Gao et al. [18]. Éntrådet fosforotioat oligodeoksynukleotider ble syntetisert av IDT inkorporering (Coralville, IA). De ODNs ble vasket i 70% etanol, tørket og oppløst i sterilisert Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris + 1 mM EDTA). Supernatanten ble renset ved hjelp av Micro Bio-spin30 kolonner (BioRad, Shanghai) og kvantifisert ved spektrofotometri. De dobbelt-trådede dODNs ble deretter fremstilt ved å varmebehandle komplementære enkelkjedede oligodeoksynukleotider ved oppvarming til
° C i 10 minutter etterfulgt av avkjøling til romtemperatur (RT) sakte i løpet av 2 timer 95. For enkelhets skyld, utpekt vi dette cdODN-SOC. En negativ kontroll fragment (NC-cdODN) som bærer basepar erstatning ble også syntetisert.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
EMSA ble utført ifølge fremgangsmåten beskrevet i Gao et al. [18]. Kort fortalt ble cdODN-SOC eller NC-ODN merket med [γ-
32P] ATP. Prøven ble deretter lastet inn i G-25-kolonne og sentrifugert ved 7000
g
i 2 min. De rekombinante humane proteiner Sox2, OCT4 og c-myc ble (Santa Cruz Biotechnology) ble inkubert separat cdODN-SOC eller NC-ODN ved RT i 15 minutter i 10 ul H
2o og 8 ul masterblanding (12 x ) inneholdende 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M EDTA, 5 M NaCl, 1 M ditiotreitol, 50% glyserol, 100 ug /mL bovint serumalbumin og 1 ug /ul poly (dIdC). For supershift eksperimenter ble antistoffer (1 ug) som inngår i reaksjonen. For konkurrerende eksperimenter ble umerket cdODN-SOC i 100-gangers overskudd av de merkede dODNs tilsatt i bindingsreaksjoner. DNA-proteinkomplekser ble separert ved nondenaturing polyakrylamid gel (7,5% i 0,4 x Tris-borat /EDTA) elektroforese. Geleer ble tørket og filmet.
Transfeksjon av cdODN-SOC i cellelinjer
sortert SP eller NSP celler ble transfektert med cdODN-SOC bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen Kina Limited, Shanghai). Cellene ble sådd ut i 96-brønners vevskulturplater. Ved 50% konfluens ble cellene vasket med serumfritt medium en gang og deretter inkubert med 50 ul frisk føtalt bovint serum (FBS) -fri medium. Decoy ODNs av varierende konsentrasjoner og lipofektamin (0,25 mL) ble separat blandet med 25 ul av Opti-MEM® jeg Redusert Serum Medium (Invitrogen Kina Limited, Shanghai) i 5 min. Da de to blandinger ble slått sammen og inkubert i 20 min ved RT. Den lipofektamin: cdODN blanding ble dråpevis tilsatt til cellene og inkubert ved 37 ° C i 5 timer. Deretter ble 25 ul friskt medium inneholdende 30% FBS tilsatt til brønnen, og cellene ble opprettholdt i kultur inntil bruk.
Administrering av cdODN-SOC til BALB /c nakne mus
Når tumorstørrelse nådde ~ 200 mm
3 (ca. 7 dager etter inokulering), cdODN-SOC ble administrert daglig ved en enkelt intratumoral injeksjon (20 ul av 100 nM cdODN-SOC blandet med Lipofectamine 2000). Tumorvekst ble overvåket regelmessig, og volumet (V) av svulster på dag 5 etter cdODN-SOC behandling ble beregnet ved hjelp av formelen V = 1/2 x lengde x (bredde)
2.
Data analyse
data er presentert som gjennomsnitt ± SEM for alle eksperimentelle data. Gruppe sammenligninger ble utført ved anvendelse av enveis ANOVA. Post hoc-analyser av betydelige viktigste effektene ble videre undersøkt ved hjelp av Fishers plsd tester. En to-tailed
P
0,05 verdi ble tatt for å indikere en statistisk signifikant forskjell mellom to grupper. Statistiske analyser ble utført med SPSS 11.5 og kurvetilpasning ble utført i Graphpad Prism programvare.
Resultater
Kjennetegn på menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer i kultur
I normal oksygen kultur medium, de menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (h-PCCLs) PANC-en, SW1990, og BxPc-3 alle viste tydelige cellegrenser, rik cytoplasma, distinkte kjernen, og synlig nukleoli, mange pågå dele celler med enda cellemorfologi hovedsakelig i epitel-lignende polygonal form og sjelden i spindelen form under et invertert mikroskop (figur 1A). Under hypoksiske dyrkningsforhold, men cellegrensene ble disig og cellestørrelse ble større, men med krympet cytoplasma, forstørret kjernen, og fuzzy nucleolus med mindre dele celler og mer spindel-formet celler.
(A) Representative mikrofotografier av Panc-1 og BxPc-3 celler 72 timer etter seeding. (B) (C) Vekstkurver av PANC-1 og BxPc-3-celler. Symboler er eksperimentelle data og kurver representerer de passer best til eksponentiell vekst likningen: Y = Y0 × exp (k × X), hvor Y0 er Y-verdien når X (tid) er null og K er hastighetskonstanten. τ er tidskonstanten (dag) og DT (dobling-tid) er i tidsenheter i X-aksen, beregnet som ln
2 /K.
Vekst av PANC-en og BxPc-3 celler ble vurdert. Med innledende lik seeding tetthet, disse cellene viste lignende vekstrater i henhold normoksisk forhold. Tre dager etter såing, cellene gikk inn i logaritmisk vekstfase og dannet en vekstsone som gradvis ble ekspanderer radialt. Cellene hadde uniform morfologi og ryddig aligned (figur 1B). Til sammenligning under hypoksiske dyrkningsbetingelser, cellevekst ble betydelig redusert uten åpenbar logaritmisk vekstfase (figur 1C). Celler ble uorden og celler i vekst sonen viste heterogen morfologi.
Identifikasjon av SP celler fra menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og effekter av cdODN-SOC
Ifølge vår Hoechst33342-FACS analysen, h-PCCLs PANC-1, SW1990, og BxPc-3 alle inneholdt en liten subpopulasjon av SP-celler med andeler av 8,7 ± 0,8, 4,6 ± 0,6 og 2,2 ± 0,4%, respektivt (figur 2A, B). SP-fraksjonen i cellelinjer ble betydelig redusert i nærvær av verapamil.
(A) Eksempler på flaket Cytometry analyse av SP-celler i nærvær eller fravær av 30 pM verapamil, cdODN-SOC (et kompleks lokkefugl oligodeoksynukleotid bærer
cis
-elements for Sox2, Oct4 og c-Myc) eller NC-ODN (negativ kontroll cdODN). (B) SP proporsjoner som andel av den totale befolkningen. ***
p
0,001
vs
kontroll; n = 4.
For å utnytte om SP cellene kan bli konvertert til NSP ved å målrette viktige molekyler bestemmer stemness av cscs, testet vi effekten av en kompleks lokkefugl oligodeoksynukleotider fragment (cdODN) på SP celler. Komplekset decoy oligodeoksynukleotid (cdODN-SOC) designet for denne studien inneholdt typisk
cis
-acting elementer for Sox2, Oct4, og c-Myc. Påfallende, etter forbehandlet med cdODN-SOC i 48 timer, ble SP-celler nesten forsvunnet i alle tre h-PCCLs, med 0,05 ± 0,03, 0,03 ± 0,1 og 0,03 ± 0,2% for PANC-1, SW1990, og BxPc-3, respektivt (Figur 2A, B). Som en negativ kontroll, ble NC-cdODN ikke signifikant påvirker SP fraksjoner i disse cellelinjene.
Sekvensen til denne cdODN-SOC er vist i figur 3A og evne til denne cd-ODN-SOC å binde Sox2, OCT4 og c-myc-proteiner ble bekreftet ved vår EMSA i forbindelse med supershift ved hjelp av antistoffer rettet mot disse transkripsjonsfaktorer. Som vist i figur 3B, er forskjøvet båndene indikerer cdODN-proteinbinding og supersfift båndene indikerte spesifikke cdODN-proteinbinding.
(A) Sekvensene til de cdODN-SOC bærer
cis
-elements for Sox2, Oct4 og c-Myc, og den negative kontroll-ODN med nukleotid-erstatninger (NC-ODN). (B) Eksempler på EMSA bilder som viser evnen til cdODN-SOC til å binde humant rekombinant Sox2, Oct4 eller c-Myc-proteinet. Skift båndene indikerer posisjonene til de DNA-proteinkomplekser og supershift båndene indikerer det spesifikke DNA-proteinbinding plukket opp av det respektive antistoffet. Lane etiketter: 1, kontroll uten proteiner; 2: i nærvær av kald eller umerket cdODN-SOC; 3: i nærvær av cdODN-SOC; 4: i nærvær av NC-ODN; og fem. med antistoff
Differensial genuttrykk mellom SP og NSP celler
neste forhold uttrykk for stamcellemarkører CD133 og ALDH1 (aldehyd dehydrogenase-1) [19, 20], pluripotency opprettholde faktorer Nanog, Sox2 og OCT4, onkogene transkripsjonsfaktor c-myc, signalmolekyl Notch1, og legemiddelresistente genet ABCG2 [21,22] i sortert SP og ikke-SP (NSP) celler ved QRT-PCR for transkripsjon nivå og Western blot på proteinnivået. Som illustrert i figur 4, SP-celler fra PANC-1 uttrykt vesentlig mer rikelig transkripsjoner av disse genene i forhold til NSP-celler, som klart viser de stamcelle-karakteristikker av SP-celler. Resultatene av Western blot-analyse var i overensstemmelse med endringer i mRNA-nivåer (figur 4B). SP celler fra to andre h-PCCLs viste kvantitativt de samme resultatene (figur S1 og Figur S2 online).
(A) Uttrykk for CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-myc, og Notch1 på mRNA-nivå, bestemt av sanntids RT-PCR. Verdiene ble oppnådd ved først normalisert til GAPDH for intern kontroll, og deretter presentert som et forhold av SP enn NSP. **
p
0,01 SP
vs
NSP; ***
p
0,001 SP
vs
NSP; n = 4. (B) Uttrykk for CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-myc, og Notch1 på proteinnivå, bestemmes av Western blot analyse. Verdiene ble oppnådd ved først normalisert til GAPDH for intern kontroll, og deretter presentert som et forhold av SP enn NSP. CD133: 120 kDa; ALDH1: 55 kDa; ABCG2: 72 kDa; Sox2: 40 kDa; Oct4: 45 kDa; Nanog: 35 kDa; c-myc: 62 kDa; Notch1: 300 kDa.
