Abstract
Lokalisert hypoksi i solide svulster aktiverer transkripsjonsprogrammer som fremmer metastatisk transformasjon av celler. Som hypoksi-induserbar hyper-vaskularisering, tap av retinoblastom protein (Rb) er en egenskap som er felles for avanserte stadier av tumorprogresjon i mange metastatisk kreft. Men ikke etablert koblingen mellom rollen som Rb og hypoksi-drevet metastatiske prosesser. Vi viste at Rb er en viktig formidler av hypoksisk respons mediert av HIF1α /β, master regulator av hypoksi respons, og dens avgjørende co-aktivator, skjoldbrusk hormon reseptor /retinoblastom-samspill protein (TRIP230). Videre er tapet av Rb avslører den fulle ko-aktivering potensialet av TRIP230. Ved hjelp av små hemmende RNA tilnærminger
in vivo
, etablerte vi at Rb demper den normale fysiologiske respons på hypoksi ved HIF1α. Spesielt, tap av Rb resulterer i hypoksi avhengig biokjemiske endringer som fremmer kjøp av en invasiv fenotype i MCF7 brystkreftceller. I tillegg er Rb til stede i HIF1α-Arnt /HIF1β transkripsjonelle komplekser forbundet med TRIP230 som bestemt ved ko-immuno-utfelling, GST-pull-down og chip-analyser. Disse resultater viser at Rb er en negativ modulator av hypoksi-regulert transkripsjon i kraft av dens direkte påvirkning på HIF1 komplekset. Dette arbeidet representerer den første koblingen mellom det funksjonelle ablasjon av Rb i tumorceller og HIF1α avhengig transkripsjonen aktivering og invasjon
Citation. Labrecque MP, Takhar MK, Jagdeo JM, Tam KJ, Chiu C, Wang TY, et al. (2014) En TRIP230-Retinoblastoma Protein Complex Regulerer Hypoksi-induserbar faktor-1α-mediert transkripsjon og kreft celle invasjon. PLoS ONE 9 (6): e99214. doi: 10,1371 /journal.pone.0099214
Redaktør: Sonia Rocha, University of Dundee, Storbritannia
mottatt: 5 mars 2014; Godkjent: 12 mai 2014; Publisert: 11 juni 2014
Copyright: © 2014 Labrecque et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i manuskriptet
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd fra den kanadiske Breast Cancer Foundation BC /Yukon (https://www.cbcf.org/bc/Pages/default.aspx ) og naturvitenskap og Engineering Research Council, RGPIN 356355 (https://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) fra Canada til TVB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hypoksi induserbar faktor-1α (HIF1α), dens orthologue HIF2α, og deres dimerization partner aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator, (ARNT eller HIF1β) som utgjør HIF1 kompleks [1], [2] regulerer en celle respons på forhold med lav oksygen. I friskt vev, dirigerer HIF1 kompleks bestilt og tett regulert ekspresjon av gener som styrer
de novo
syntese av nye blodkar for å støtte vev vekst eller vev re-perfusjon. Under hypoksi, HIF1α akkumuleres, translocates til kjernen, og binder ARNT. De HIF1 komplekse rekrutterer ko-aktivatorer, inkludert CBP /p300 [3], og Brm /Brg-1 [4] og aktiverer ekspresjon av gener, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), erytropoietin (EPO) og metastatiske markører, CXCR4 og prokollagen-lysyl-hydroksylase-2 (PLOD2) [1], [5], [6]. Tyder på at den HIF1 komplekset kan aktivere genekspresjon selvstendig eller sammen med andre transkripsjonsfaktorer [7], [8]. Demonstrasjon som HIF1α er istand til interaksjon med c-Myc, Notch og mer nylig FOXA2 å dirigere bestilte transkripsjon og forbedre tumordannelse [9] – [11] etterlater åpne muligheten for at HIF1 komplekset er en kjerne transkripsjonsenhet som modulerer multippel intracellulær signalise nettverk, hvorav mange kan være involvert i metastatisk transformasjon. Dermed mange av molekylene som kontrollerer ulike aspekter av HIF1 funksjon ennå ikke er identifisert.
HIF1 kompleks utfører denne funksjonen ved å rekruttere transcriptional co-aktivator proteiner, inkludert skjoldbrusk hormon reseptor /retinoblastom-samspill protein- 230 (TRIP230) til de regulatoriske regioner av hypoksi-responsive gener for å aktivere transkripsjon [12]. TRIP230, ble først identifisert som en skjoldbrusk hormon reseptor (TR) -interacting protein som forbedret TR aktivitet [13]. I tillegg har TRIP230 blitt isolert som en del av P160 ko-aktivator-kompleks [14], et bona fide ARNT ko-aktivator-kompleks [15]. Viktigere, har vi vist at TRIP230 rekrutteres ved ARNT som en transkripsjonen ko-aktivator, og det er viktig for den transkripsjonelle aktivitet av den HIF1 komplekset [12]. Videre ble det vist at TRIP230 samhandler med Rb og at Rb demper TRIP230 forbedret TR-drevet transkripsjon [16]. Dette og en senere studie viste at bare den hyper-fosforylert form av Rb samhandler med TRIP230 [17] fremhever en funksjon for Rb forskjellig fra sin kanoniske E2F avhengig regulering av cellesyklus, spesielt for sin hypo-fosforylert form.
tap av
RB1
, genet som koder for Rb [18], og eller tap-av-funksjon av Rb er forbundet med utvikling og metastatisk progresjon av mange andre faste tumorer, inkludert kreft i eggstokk, lunge, bryst, prostata og hjerne [19] – [23]. Den best forstås funksjon av Rb er at av cellesyklus regulator undertrykke E2F transkripsjonsfaktor-funksjon for derved å mediere celle-proliferasjon og differensiering [24]. Hypo-fosforylert Rb blokker cellecyklusprogresjonen ved å binde seg til E2F transkripsjonsfaktorer og påvirker E2F-avhengige transkripsjons utfall. Det gjør det ved å rekruttere kromatin-remodeling transkripsjons repressor proteiner som Sin3a /b, HDACs, SUV39H1 og DNMT1 [25] – [27]. Hyper-fosforylert Rb unnlater å undertrykke E2Fs og gir dem mulighet til å aktivere eller undertrykke ulike genuttrykk programmer [24].
Nyere studier tyder på at Rb kan ha fysiologiske roller i tillegg til sin kanoniske E2F funksjon [28]. Tidligere viste vi en direkte interaksjon mellom TRIP230 og ARNT [12]. I tillegg har vi vist at TRIP230 var uunnværlig for transkripsjon mediert av to forskjellige dimerisering partnere ARNT, nemlig aryl-hydrokarbon-reseptoren og HIF1α [12]. I denne rapporten gir vi den første bevis for eksistensen av en Rb-TRIP230-ARNT kompleks som medierer HIF1 transkripsjon. I tillegg, viser vi at Rb svekker aktiviteten av Arnt transkripsjonelle komplekser i kraft av sin tilknytning til TRIP230 og uavhengig av E2F. Til syvende og sist dette arbeidet viser evne til Rb å modulere HIF1-aktivert genuttrykk med konsekvenser for kreftcelle transformasjon.
Resultater
HIF1 regulerte Gene Expression forsterkes av siRNA Knock-down av Rb
TRIP230 er kjent for å binde direkte til TR og ARNT [12], [16]. Gitt at hyper-fosforylert-Rb undertrykker TRIP230 co-aktivert TR aktivitet [16], [17] og at TRIP230 uttrykk er nødvendig for transkripsjonen aktivitet av Arnt partnere, AHR og HIF1α [12], hypotese vi at Rb kan dempe hypoksi- induserbar gentranskripsjon. For å undersøke rollen til Rb på akkumulering av hypoksi-induserbar målgen mRNA-arter, utarmet vi Rb i humane kreftcellelinjer av siRNA-formidlet gen-
knock-down
. MCF7 og LNCaP-celler ble transfektert med enten egge (SCX) tak siRNA eller to Rb-spesifikke sirnas og mRNA akkumuleringen av HIF1 målgener som er utsatt for normoxia og hypoksi ble sammenlignet (figur 1). Rb RNA og proteinnivåer ble på tilsvarende måte undertrykkes under begge normoksisk og hypoksiske betingelser (figur 1A, og E). Ingen endring ble observert i CXCR4 eller VEGF uttrykk i Rb siRNA transfekterte celler under normoksisk forhold, men en økning i PLOD2 mRNA akkumulering etter normoksisk forhold ble observert i MCF7 celler (figur 1D), men ikke i LNCaP celler (figur 1E). I tillegg MCF7 celler transfektert med Rb-spesifikke sirnas viste signifikant mRNA akkumulering av HIF1 målgener CXCR4, VEGF og PLOD2 henhold hypoksiske forhold (figur 1B-D) økt. En lignende hypoksi avhengig effekt på CXCR4, VEGF og PLOD2 induksjon ble observert i respons til trykt Rb uttrykk i LNCaP prostatakreftceller (figur 1E) som tyder på at denne observasjonen er ikke celletype bestemt.
MCF7 celler (A , B, C og D) og LNCaP-celler (E) ble transfektert med enten egge siRNA (SCX) eller Rb sirnas siRb 1, og siRb 2. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene enten normoksisk holdt under betingelser eller 1% O
2 i ytterligere 24 timer. Genekspresjon ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR etter isolering og revers transkripsjon av total RNA. VEGF, ble CXCR4, PLOD2 og Rb uttrykk normalisert til konstitutivt aktiv 36B4 genuttrykk. Åpne barer representerer normoxia (20% O
2) og lukket (grå) barer representerer hypoksi (1% O
2). Feilfelt representerer ± S.D. * P. 0,05
Rb og Rb-assosiert repressor Proteiner er rekruttert til regulatoriske områder av Hypoksi induserbare gener under Aktivert transkripsjon
Vi observerte at tap av Rb resulterte i overdrevne uttrykk av HIF1 målgener i en hypoksi avhengig måte. Dermed var vi interessert i å finne ut om tilstedeværelsen av Rb kunne bli registrert i løpet av de regulatoriske regioner HIF1 regulerte gener som bærer godt karakterisert hypoksi respons elementer under aktivert transkripsjon; nemlig VEGF promoter og EPO forsterker. En skjematisk fremstilling av disse regionene og plassering av oligonukleotider for PCR-amplifisering av kromatin er avbildet i figur 2A. Kromatin immuno-utfelling (chip) analyse viste at Rb assosierer med regulerende regioner av HIF1-regulerte gener, VEGF og EPO i en hypoksi-avhengig måte i MCF7-celler (figur 2B). For å sikre at våre eksperimentelle forhold produsert riktig respons på hypoksi, vi også utfelt kromatin med antistoffer mot HIF1α, ARNT, TRIP230 eller en kontroll kanin IgG. Kontroll IgG var i stand til å utfelle kromatin som inneholder VEGF og EPO-regulatoriske regioner. Som vi har vist tidligere [12], var vi lettere kunne forsterke kromatin utfelt fra hypoksi behandlet lysatene enn fra de som stammer fra lysatene holdt under normoksisk forhold ved hjelp av HIF1α, Arnt, TRIP230 og Rb antistoffer. Vi kunne forsterke lave nivåer av VEGF promoter og EPO enhancer henhold normoksisk forhold (figur 2B) når utløsende kromatin med vår TRIP230 antistoff, derfor kan vi ikke utelukke at TRIP230 forbinder med hres ved lave nivåer til tross for normal oksygen spenning. Imidlertid, til vår manglende evne til å oppdage HIF1α eller HIF2α proteinet under disse betingelser (figur 2C) antyder muligheten for at Rb ikke er rekruttert til disse HRE regionene i henhold til normoksisk betingelser.
(A) En skjematisk av VEGF-promoteren og proksimale EPO enhancer og den relative plasseringen av oligonukleotider anvendt for PCR-amplifikasjon. (B) Statusen for HIF1α, ARNT, TRIP230, og Rb i VEGF-promoteren og EPO forsterker i MCF7-celler som bestemt ved kromatin-immuno-utfelling (chip) og polymerase kjedereaksjon (PCR) og sammenlignet med amplifikasjonsreaksjoner avledet fra lysater utfelt med kontroll IgG. Alle Chips ble utført minst tre ganger mindre annet er angitt. (C) HIF1α og HIF2α proteinnivåer er dramatisk beriket under hypoksi i MCF7 celler. MCF7-celler ble holdt i kultur i enten 20% eller 1% O
2 i 24 timer. Nukleære ekstrakter ble analysert ved hjelp av immuno-blot og membraner ble probet med affinitetsrensede antistoffer mot HIF1α og α-tubulin. Sekvensiell chip av den proksimale VEGF-promoteren og EPO enhancer ved anvendelse av enten anti-HIF1α (D) eller anti-ARNT (E) affinitet-renset antistoff, etterfulgt av immuno-utfelling med anti-TRIP230 og anti-Rb antistoffene. (F) chip av VEGF arrangøren etter i MCF7 celler etter transfeksjon med enten egge siRNA eller siRb1 og immuno-utfelling med anti-TRIP230 antistoff. Verdier er uttrykt som fold berikelse over kontrollen og ble bestemt av kvantitativ real-time PCR. Hver eksperimentelle verdi ble korrigert for innmating og eksperimenter ble utført to ganger. (G) Immuno-blot-analyse av siRNA-transfekterte MCF7 cellelysater anvendt i Chip eksperimenter. (H) chip av Rb-repressor komplekse proteiner i MCF7 celler. Cellene ble behandlet som beskrevet ovenfor, og kromatin komplekser ble isolert med affinitetsrensede antistoffer rettet til Sin3a, Sin3b, og HDACs 1-3.
Vi har utvidet våre undersøkelser i et forsøk på å finne ut om TRIP230 og Rb har evne til å samhandle med individuelle DNA-elementer i konsert med HIF1α og ARNT på hypoksiske responselementer. Vi utførte en sekvensiell to-trinns ChIP analysen, først isolere kromatin med affinitetsrensede antistoffer til Arnt eller HIF1α fulgt av utfelling av disse rensede kromatin fraksjoner med antistoffer mot TRIP230 og Rb. I hvert tilfelle VEGF-promoter DNA ble amplifisert ved PCR i en hypoksi avhengig måte (figur 2D og E) sterkt tyder på at HIF1α, ARNT, TRIP230 og Rb er til stede ved HRes i en multi-proteinkompleks. I tillegg knock-down av Rb som bestemt ved immun-blot (figur 2G), ikke resulterte i ytterligere anrikning av TRIP230 på VEGF-promoteren (figur 2F) antyder at Rb ikke forstyrrer TRIP230 rekruttering til HIF1 responsive elementer.
til slutt var vi interessert i å se om kjente Rb-forbundet repressor komplekser [26], [27] var til stede på disse elementene under hypoksi-drevet transkripsjon. ChIP analyse avslørte Sin3a /b, ble HDAC1 og HDAC3 beriket på HIF-responsive regulatoriske regioner av både VEGF og EPO gener under hypoksiske forhold (figur 2H) støtter vår hypotese om at Rb er en del av transcriptional repressor komplekse skuespill på HIF1 regulert transkripsjon. I kontrast, HDAC2 opptrådt på en mer kanonisk mote og ble avskjediget fra disse regionene i en hypoksi avhengig måte (figur 2 H). Disse dataene antyder at transkripsjons repressor proteiner blir rekruttert til hypoksi-regulerte gener under aktivert transkripsjon. Videre disse observasjonene støtter hypotesen om at transkripsjon må dempes for å sikre riktig transcriptional responsen.
ARNT og TRIP230 er avgjørende for Rb-regulering av HIF1 Aktivitets
Siden Rb og TRIP230 er samspill proteiner , de kvantitative RT-PCR-forsøk ble gjentatt ved bruk av et siRNA rettet mot TRIP230. Hypoksisk genet induksjon av CXCR4 mRNA akkumulering ble alvorlig svekket på knock-down av TRIP230 (figur 3A og B). Knock-down av Rb under disse betingelser, som vist ved immuno-blot-analyse (figur 3B) ikke resulterte i noen signifikant økning i CXCR4 mRNA, noe som gir ytterligere bevis på at denne effekten er TRIP230 avhengig. Bilder av hele immun-blotter kan finnes i figur S1. Videre er tapet av Rb ikke føre til en økning i CXCR4 mRNA akkumuleringen i celler ablasjon for ARNT ved siRNA-mediert knock-down ytterligere antyder at effekten mediert ved Rb er hypoksi avhengig (figur 3C og D). I tillegg siRNA-mediert undertrykkelse av DP1 ekspresjon i MCF7-celler reagerte på hypoksi så lett som kontrollceller (figur 3C og E) som indikerer at den regulerende funksjon av Rb på HIF-regulerte gener er uavhengig av E2F og frakoplet fra Rb er kanoniske rolle en cellesyklus mediator.
(A) MCF7-celler ble transfektert med enten egge siRNA (SCX) eller Rb sirnas siRb 1, og siRb 2, eller en kombinasjon av TRIP230 siRNA og siRb1. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene enten normoksisk holdt under betingelser eller 1% O
2 i ytterligere 24 timer. Genekspresjon ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR etter isolering og revers transkripsjon av total RNA. CXCR4 uttrykk ble normalisert til konstitutivt aktiv 36B4 genuttrykk. (B) Immuno-blot-analyse av TRIP230 og Rb etter siRNA transfeksjon med enten kryptert siRNA, eller en kombinasjon av siTRIP230 og siRb. Alfa-tubulin (α-tubulin) ble anvendt som en kontroll lasting. (C) MCF7-celler ble transfektert med enten egge siRNA (SCX) eller Rb sirnas siRb 1, og siRb 2, eller ARNT, eller DP1 siRNA eller en kombinasjon av ARNT /RB1 siRNA og behandlet som beskrevet ovenfor. (D) Immuno-blot av ARNT og α-TUB etter transfeksjon med enten egge kontroll av siRNA rettet til ARNT. (E) Immuno-blot av DP1, TRIP230 og α-tubulin (α-tubulin). MCF7-celler ble transfektert med enten egge kontroll (SCX) eller siRNA rettet til DP1. Dataene i figur 3A og 3C ble analysert ved bruk av en to-veis-variansanalyse. * P. 0,01
Tap av Rb fører til en økning i HIF1 Target Gene Protein Expression
Vi var interessert i å finne ut om effekten av Rb-tap på mRNA akkumulering ble reflektert på proteinnivået av HIF1 målgener og, spesielt hvis pro-metastatiske faktorer ble påvirket. Således vi også undersøkt rollen til Rb i ekspresjonen av nedstrøms metastatiske markører som er følsomme overfor hypoksi. Tap av Rb resulterte i en samtidig økning i CXCR4 proteinnivåer etter 48 timer med hypoksi og PLOD2 etter 96 timer med hypoksi (figur 4A). Videre er en 24 timers eksponering for hypoksi med Rb knock-down også resulterte i en økning i ekspresjon av mesenchymale markør, vimentin (figur S2A). Det kan dessuten tap av Rb ikke øke endogene nivåer av HIF1α (figur 4A), noe som tyder på at den observerte hypoksiske virkningen var ikke skyldes en økning i HIF1α uttrykk eller stabilitet. Til slutt, tidligere rapporter vist at TRIP230 forbinder med hyper-fosforylert Rb [16], [17]. Immuno-blotting-lysater fra MCF7 og LNCaP-celler med antistoffer rettet mot Rb, Rb-fosfo-serin
780 og Rb-fosfo-serin
807/811 viser at det er en betydelig mengde av fosforylert Rb i MCF7 og LNCaP celler (figur 4B).
MCF7 celler (A) ble transfektert med enten egge siRNA (SCX) eller Rb sirnas siRb en, og siRb 2. Rb, CXCR4, HIF1α, PLOD2 og a-tubulin protein nivåer var vurdert av immuno-blot etter eksponering for atmosfærisk O
2 eller 1% O
2 for 48 (Rb og CXCR4) eller 96 h (HIF1α, og PLOD2). (B) Immuno-blot av helcellelysater fra MCF7 og LNCaP-celler enten til venstre ved normoxia (N) eller behandlet med 1% O
2 til 6 timer (H). Blotter ble undersøkt med primære antistoffer til total Rb, Rb-fosfor-serin
780 (Rb-PS
780), Rb-fosfor-serin
807/811 (Rb-PS
807/811 ), eller α-tubulin som en lasting kontroll.
Tap av Rb Fremmer en invasiv fenotype MCF7- brystkreft celler
evnen til Rb knock-down for å forbedre HIF1 kompleks transkripsjonen aktivitet og protein uttrykk ledet oss til å vurdere om Rb undertrykkelse kan også forbedre hypoksi-indusert celle invasjon i tradisjonelt ikke-invasive MCF7- brystkreft celler [29]. For celler med en fullstendig komplement av Rb (det vil si celler transfektert med SCX kontroll siRNA), hypoksi hadde ingen virkning på invasjon av MCF7 celler inn i matrigel (Figur 5A og B). Imidlertid siRNA knock-down av Rb ført til økt invasjon av MCF7-celler i henhold til hypoksiske betingelser, men hadde ingen virkning på invasjon i henhold til normoksisk betingelser (figur 5A og B). Disse data understøtter rollen til Rb som en tumor suppressor av hypoksi regulert metastatiske programmer.
Tjuefire timer etter siRNA transfeksjon, ble cellene underkastet Matrigel invasjon analysen. Platene ble inkubert i normoksiske (20% O
2) eller hypoksiske betingelser (1% O
2) ved 37 ° C i 24 timer og invaderende celler ble fiksert og visualisert med toluidinblått. (A) Mikrofotografier av Matrigel-embedded MCF7 celler. (B) numerisk representasjon av relativ invasjon av Matrigel-innleiret MCF7-celler etter behandling med SCX eller siRb og eksponering til normoksisk eller hypoksiske betingelser (n = 6), (C) Knock-down av Rb i MCF7-celler endrer ikke celleproliferasjon i respons på CoCl
2. -Celler ble transfektert med siRNA s som beskrevet ovenfor. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med bærer eller 100 mM CoCl
2 for å aktivere HIF1α og celler ble tellet på 0, 6, 12, 24, 36 48, og 72 timer senere. Feilfelt representerer ± SEM * P. 0,01
Vi var bekymret for at økt invasivitet kan skyldes en dramatisk økning i celleproliferasjon grunn av tap av Rb kontroll av cellesyklus. For å unngå perioder med langvarig, alvorlig hypoksi, viste vi at HIF1α stabiliseringsmiddelet CoCl
2 ville etterligne effekten av hypoksi i matrigel analysen (figur S2C). Disse data understøtter videre vår hypotese at de observerte effektene formidles via HIF1 komplekset. Med CoCl
2 etablert som en effektiv etterligner av hypoksi etter knock-down av Rb i matrigel analysen, var vi i stand til å avgjøre om den observerte økningen i celle invasjonen var på grunn av en økning i cellevekst (figur 5C). MCF7 celle vekstdynamikk ble overvåket med jevne mellomrom ved å telle levedyktige celler over en 72 timers periode. I celler transfektert med enten SCX kontroll siRNA eller Rb siRNA og med separate prøver av hver enkelt vedlikeholdes enten i nærvær eller fravær av CoCl
2, observerte vi at tap av Rb redusert spredning i både ubehandlet og CoCl
2 behandlede celler (figur 5C) med ingen signifikant forskjell mellom de andre behandlinger. Likeledes Matrigel invasjonen av SCX kontrollceller ble utvisket under enten tilstand. Cellesortering etter propidiumjodidfarging avslørte en større del av Rb-knock-down-celler i sub-G1-fasen av cellesyklus (figur 5D og E). Samlet utgjør disse dataene sterkt at tap av Rb fremmer celle invasjon i en hypoksi avhengig måte, og at disse effektene er ikke på grunn av økt celle nummer eller spredning.
Rb Associates med PAS-B /TRIP230- interaksjon domene av ARNT Protein
muligheten for at ARNT, TRIP230 og Rb kan være en del av et multikompleks ble utforsket av immuno-utfelling av TRIP230 forbundet komplekser fra atom ekstrakter av MCF7 celler inkubert i 6 timer under hypoksisk forhold (Figur 6A). Immuno-blot-analyse avslørte ARNT og Rb for å være til stede i den anti-TRIP230 immuno-bunnfall, mens ingen av de tre faktorene ble detektert i utfellinger av lysater utført med ikke-immun IgG. Disse resultatene gir sterke bevis for at nativt TRIP230 protein er i stand til protein-protein interaksjoner med ARNT og Rb.
(A) Immuno-blot av kompleksene ble utfelt ved anvendelse av enten et mus monoklonalt antistoff rettet mot TRIP230 eller mus kontroll IgG fra atom ekstrakter av MCF7 celler. Blotter ble undersøkt for forekomst av TRIP30, ARNT og Rb. Den venstre kjørefelt i hver blot inneholder kjerneekstrakt som representerer 10% av input. (B) GST–PAS-B ARNT er i stand til å trekke ned TRIP230 og Rb. Immuno-blot analyse av GST-ARNT-PAS-B-trekk og GST rullegardin av TRIP230 og Rb fra MCF7 atom ekstrakter. GST-grupper ble fiksert til glutation-agarose perler og inkubert i 90 minutter ved 4 ° C med 500 ug av MCF7 cellekjerneekstrakt. Input baner var lastet med 250 mikrogram av kjerneekstrakt. Komplett blotter for paneler A og B kan bli funnet i Supplemental Figur S1. GST–PAS-B ARNT er i stand til å trekke ned fosforylert Rb. (C) Immuno-blot analyse av GST-ARNT-PAS-B-trekk og GST rullegardin av Rb-fosfor-serin
780 (Rb-PS
780) fra MCF7- atom ekstrakter høstet fra celler venstre ved normoxia (N) eller behandlet med 1% O
2 til 6 timer (H). (D) Chromatin immunutfellingen analyse av EPO enhancer og VEGF promoter regioner i MCF7 celler ved hjelp av kontroll eller Rb-fosfor-serin
780 antistoffer. Celler ble behandlet som beskrevet ovenfor. Rb demper TRIP230-mediert ko-aktivering av ARNT avhengig transkripsjonen aktivitet. De Rb- og ARNT-interaksjon domener er angitt. Hepa-1c1c7-celler (E) og MCF7 celler (F) ble transfektert med en hypoksi responsiv 4xHRE-drevet luciferase konstruere som en reporter, ekspresjonsplasmider for TRIP230, TRIP230ΔRB og Rb som angitt og utsatt for 1% O
2 eller atmosfærisk (20%) O
2 i 24 timer. Helcellelysater ble undersøkt for luciferase-aktivitet. (G) Et skjematisk av TRIP230ΔRB mutant. (H) TRIP230 protein nivåer er upåvirket av transfeksjon av Rb uttrykk plasmid inn Hepa1c1c7 celler. Helcellelysater ble analysert ved immuno-blot og membraner ble probet med affinitetsrensede antistoffer mot TRIP230, Rb og α-tubulin. * P. 0,05
Gitt at forrige
in vitro
interaksjonsstudier bestemt at Rb ikke direkte samhandler med ARNT [30], vi derfor var interessert i å finne ut om TRIP230 interaksjon domene innenfor ARNT kan brukes til å isolere Rb fra MCF7 cellekjerneekstrakter. Partch og kolleger har identifisert at TRIP230 samspillet domene innen ARNT ligger i sin PAS-B-regionen [31]. Vi smeltet aminosyrer 344-479 skjuler den utvidede PAS-B domene muse ARNT til GST. Ved hjelp av denne minimal medvirkning domenet ble gjort blant annet for å redusere potensialet for ARNT å samhandle med andre kjerneproteiner. Trekk ned av TRIP230 og Rb fra atom ekstrakter av hypoksi kondisjonerte MCF7 celler ble dramatisk beriket med GST–PAS-B ARNT domene forhold til GST alene (Figur 6B). Således er det mulig at en ARNT komplekse inkludert TRIP230 og Rb er utformet gjennom ARNT PAS-B domene. Dette domenet formidler samspillet mellom ARNT og flere co-aktivatorer som er avgjørende for ARNT-mediert transkripsjon: nemlig TRIP230 [12], de P160 /NCOA /SRC-familien av transkripsjons co-aktivatorer [15], og kakao [32] .
til slutt ønsket vi å finne ut spesielt hvis hyper-fosforylert Rb var involvert i HIF1 regulert gentranskripsjon. Vi undersøkt Immuno-blotter med en anti-fosfor-serin
780 Rb-spesifikt antistoff etter rullegardin hjelp GST-PAS-B. På denne måte ble det observert hyper-fosforylerte Rb i blot generert fra normoksisk og hypoksiske MCF7 celle nukleære ekstrakter (figur 6C). I tillegg, utspørring av de transkripsjonelle regulatoriske regioner av HRE-inneholdende VEGF-promoter og enhancer EPO avslørte tilstedeværelsen av Rb-pSER
780 i en hypoksi avhengig måte (figur 6D).
TRIP230 medierer undertrykkende Effekter av Rb på HIF-regulerte transkripsjons
Vi har etablert at Rb co-renser med TRIP230 og at Rb demper akkumulering av hypoksi-induserbar målet genet mRNA og proteinnivåer. For å bestemme om evnen til å modulere Rb HIF1-regulert transkripsjonen aktivitet ble formidlet via TRIP230, undersøkte vi effekten av Rb på ekspresjon av en hypoksi-responsive reporter-konstruksjonen ved hjelp av delesjonsmutanter av TRIP230 i Rb-negative og -positive cellelinjer . Rb-negative Hepa1c1c7-celler ble transfektert med et ekspresjonsplasmid som koder for TRIP230, eller en transkripsjonelt kompetent delesjon-mutant av TRIP230 (TRIP230ΔRb; skjematisk på figur 6G) mangler den Rb-interaksjonsdomenet [17], et Rb cDNA-ekspresjonsplasmid, og en syntetisk luciferase reporter konstruksjon inneholdende en multimerized hypoksi-responsive element (HRE) promoter (Figur 6E). Rb opphevet hypoksisk induksjon av rapportøraktivitet i celler transfektert med vill-type TRIP230, men var ineffektiv i celler transfektert med den mutante TRIP230. Transfeksjon av Rb inn i Hepa1c1c7 cellelinjen hadde ingen effekt på nivået av endogent TRIP230 protein (figur 6 H). Faktisk titrering av økende mengder av Rb-ekspresjonsplasmid trykt hypoksi-induserbar reporter-aktivitet på en doseavhengig måte (figur S2B). Transfeksjon av mutanten TRIP230 inn i Rb-positive MCF7 humane brystcancerceller ytterligere forbedret ekspresjon av reportergenet (figur 6F), for således å virke som en dominant negativ sannsynlig ved å konkurrere om HRes med endogen vill-type TRIP230. Disse dataene samlet viser at Rb er svekkende effekt på HIF1 transkripsjonen aktivitet ser ut til å være formidlet av TRIP230.
diskusjon
Vi har fastslått at Rb demper den fysiologiske responsen til hypoksi ved HIF1α, og at det er en integral og uunnværlig del av det transkripsjonelle HIF1 kompleks på grunn av en direkte interaksjon med TRIP230. Denne virkning er uavhengig av andre protein-protein interaksjoner som den undertrykkende virkning av Rb gikk tapt i celler som over-uttrykker et transkripsjonelt kompetent mutant av TRIP230 mangler Rb-interaksjonsdomenet (figur 6E og F) og i celler utarmet av TRIP230 (figur 3A ). I tillegg siRNA-mediert knock-down av Rb førte til en samtidig økning av kjente HIF1 målgener i en hypoksi-avhengig måte i human bryst MCF7 og i humane prostata LNCaP cancer-cellelinjer (figur 1). Videre var vi i stand til å ta opp Rb over godt karakteriserte hres i EPO og VEGF regulatoriske regioner (figur 2) som tyder på at Rb kan regulere uttrykket av disse genene på transkripsjonsnivået.
TRIP230 co-aktivator var klonet og karakterisert basert på dens evne til å interagere med thyroid hormon reseptor (TR) og forbedre dens funksjon transaktivering [13], [16], og i kraft av sin evne til å reagere med Rb [16]. I denne siste rapporten ble fremlagt bevis som støttet en rolle for Rb som en transkripsjons attenuator av skjoldbruskkjertel hormon reseptor funksjon, sannsynligvis mediert gjennom TRIP230 transkripsjonen co-aktivator. TRIP230 ble senere funnet å fungere som en viktig co-aktivator for ARNT-avhengige transkripsjons aktiviteter, inkludert hypoksi-induserbar genekspresjon [12]. Viktigere, har vi funnet at TRIP230 ikke samhandle med HIF1α i en gjær to-hybrid analysen (T. Beischlag, upubliserte data). Våre immuno-nedbør studier som benytter antistoffer rettet til TRIP230 vise at endogen ARNT og Rb samhandle med TRIP230 i MCF7 celler (Figur 6A) ytterligere støtte vår hypotese om at Rb er en del av en HIF1 transcriptional kompleks.
For ytterligere å avgrense naturen i dette antatt kompleks og for å avgjøre om ARNT, TRIP230 og Rb eksistere i en enkelt kompleks, eliminert vi andre kjente protein-protein interaksjons grensesnitt innenfor ARNT og brukt en GST pull-down strategi til interesse fangst TRIP230 og Rb. Den omfattende analyse av GST rullegardin utført av Elferink og kolleger klarte å påvise en direkte interaksjon med ARNT og Rb
in vitro product: [30]. I tillegg basert på våre tidligere studier som karakteriserer samspillet mellom ARNT og TRIP230 [12], Partch og kolleger identifisert aminosyrer i ARNT PAS-B domene som megle ARNT-TRIP230 interaksjon [31]. Vi laget en GST–PAS-B ARNT fusjon og dermed eliminere andre protein interaksjons domener i ARNT. Evnen til ARNT-PAS-B regionen for å trekke ned Rb støtter eksistensen av en multi-meric kompleks som inneholder ARNT, TRIP230 og Rb (figur 6B). Faktisk har PAS-B domene dukket opp som en bona fide plattform for rekruttering av flere former for transkripsjons co-regulerende komplekser [12], [15], [31], [33].
HIF1 * P 0,05.
