Abstract
Bakgrunn
ovarialcancer er den ledende årsak til gynekologiske kreftdødsfall. De fleste pasienter responderer utgangspunktet til platina-basert kjemoterapi etter kirurgisk debulking, men tilbakefall er svært vanlig og til slutt platinamotstands framgår. Forstå mekanismen for tumorvekst, metastase og resistent tilbakefall vil dypt påvirke terapeutisk behandling av eggstokkreft.
Metoder /hovedfunnene
Ved hjelp av pasientens vev microarray (TMA),
i vitro Hotell og
in vivo
studier rapporterer vi en rolle av cystationin-beta-syntase (CBS), en svovel metabolisme enzym i ovarialcancer. Vi rapporterer her at uttrykket av cystationin-beta-syntase (CBS), et svovel metabolisme-enzym, som er vanlig i primær serøs eggstokk-karsinom.
in vitro
effekter av CBS lyddemping kan reverseres ved eksogene tilskudd med GSH og H
2S produsere kjemisk Na
2S. Dempe CBS i en cisplatin motstandsdyktig orthotopic modell
in vivo
av nanoliposomal levering av CBS siRNA hemmer tumorvekst, reduserer nodule dannelse og sensitizes eggstokkreft celler til cisplatin. Effektene ble ytterligere bekreftet ved immunohistokjemi som viser en reduksjon i H E, Ki-67 og CD31-positive celler i si-RNA behandlet som i forhold til egge-RNA-behandlede dyr. Videre CBS regulerer også bioenergi av eggstokkreft celler ved å regulere mitokondrielle ROS produksjon, oksygenforbruk og ATP generasjon. Denne studien rapporterer en viktig rolle i CBS i å fremme ovarian tumor vekst og opprettholde resistent fenotype ved å kontrollere mobilnettet redoks atferd og regulere mitokondrielle bioenergi.
Konklusjon
Den nåværende undersøkelsen fremhever CBS som en potensiell terapeutisk målet i residiverende og platina motstandsdyktig eggstokkreft
Citation. Bhattacharyya S, Saha S, Giri K, Lanza IR, Nair KS, Jennings NB, et al. (2013) cystation Beta-syntase (CBS) Bidrar til fremskreden kreft i eggstokkene Progresjon and Drug Resistance. PLoS ONE 8 (11): e79167. doi: 10,1371 /journal.pone.0079167
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: 30 august 2013; Godkjent: 18 september 2013; Publisert: 13.11.2013
Copyright: © 2013 Bhattacharyya et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) CA135011 og CA136494 (PM), CA 157 481 (RB), CA148747 (WC) og Mayo Clinic kvinner Cancer Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de siste årene gasotransmitter H
2S har fått enorm betydning spenner fra prokaryote til virveldyr biologi og utvide [1] – [6]. I en banebrytende artikkel, Roth et al. viste at forbehandling med H
2S hindres hypoksisk skade hos mus ved å drastisk redusere dyrets kjerne kroppstemperatur og metabolisme, beslektet med det som er observert i vinterdvale pattedyr [7]. Enda en artikkel viste at tap av H
2S syntetisere enzymer sensibilisert en overflod av sykdomsfremkallende bakterier til antibiotika hovedsakelig gjennom økt oksidativt stress [8]. Men en rolle for metabolske enzymer som syntetiserer H
2S ikke har blitt beskrevet i kreft biologi er fortsatt under etterforskning.
Hos mennesker, to viktigste metabolske enzymer syntetisere H
2S, cystationin beta syntase (CBS ) primært lokalisert i hjernen og levervev og cystationin y-lyase (CSE /CTH) først og fremst finnes i muskelvev [9]. CBS er den første hastighetsbegrensende enzym i reaksjonsveien transsulfuration og ved å utnytte homocystein (homocystein) produserer H
2S og cystein forløper cystationin [10]. Foruten cellulært opptak av cystin, cystein er syntese det hastighetsbegrensende trinn for glutation (GSH) produksjon, den allestedsnærværende antioksidant. Studier ved hjelp av CBS knockdown mus har understreket viktigheten av dette enzymet i hjerte- og nevrovaskulære forstyrrelser, primært forårsaker endotelial dysfunksjon, antas å være på grunn av forbedrede plasma homocystein nivåer [11] – [13]. Men kosttilskudd med vitamin B
12 og folsyre (som lette remetylering av homocystein til metionin) redusert sirkulerende homocystein nivåer ennå ikke klart å redusere symptomer på hjerte- og karsykdommer. På den annen side, vitamin B
6, en kofaktor for CBS, klarte ikke å redusere sirkulerende homocystein nivåene i de senere kliniske forsøk [14], [15]. Disse resultatene indikerer involvering av andre komponenter, i tillegg til homocystein, som å være sentrale aktører i de lidelser som er nevnt ovenfor.
Med tanke på bemerkelsesverdig cytoprotective virkningen av fysiologiske H
2S og glutation vi hevdet at kreftceller kan utnytte denne unike funksjon av CBS for å produsere H
2S når under oksidativt stress eller ved cytotoksiske fornærmelse. I denne sammenheng har vi fokusert på epitelial eggstokkreft, som er den største årsaken til gynekologisk kreft dødsfall hos kvinner. De fleste pasienter responderer utgangspunktet til platina-basert kjemoterapi etter kirurgisk debulking, men tilbakefall er svært vanlig og til slutt platinamotstands framgår. Mekanismen for denne tilbakefall og utvikling av resistens fenotype imidlertid fortsatt dårlig forstått [16], [17]. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten som beskriver en rolle for CBS i å opprettholde cellulære helse eggstokkreft celler ved å justere cellulære redoks atferd og mitokondrienes energiproduksjon. Dempe CBS hemmer betydelig eggstokkreft celleproliferasjon, metastatisk nodule dannelse og sensitizes dem til cisplatin begge
in vitro Hotell og i pre-kliniske ortotopiske musemodeller
in vivo
. Mekanistisk, tie CBS sterkt reduserer mobil GSH nivåer, svekker H
2S produksjon, aktiverer tumor suppressors slike som p53 og hemmer NF-kB aktivering. CBS co-lokaliserer med mitokondrielle markører i kreftceller, og stanse CBS reduserer mitokondrie oksygenforbruk med en samtidig økning i reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon. Disse resultatene sammen indikerer at CBS spiller en viktig rolle i regulering av redoks balanse og metabolisme av eggstokkreft celler fremme tumorvekst og metastasering.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP.
alle 210 deltakere påmeldt gjennom 2009, fra hvem vev for TMA ble innhentet, gitt skriftlig informert samtykke for IRB-godkjent protokoll (09-008365) og kliniske data ble abstrahert for alle tilfeller. Alle studier ble godkjent av Mayo Clinic Institutional Review Board (Protocol # 09-008365).
Dyreforsøk.
Kvinne atymiske nakne mus (NCR-NU) ble kjøpt fra National Cancer Institute -Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Alle mus ble plassert og holdt under spesifikke patogen-frie forhold i anlegg som er godkjent av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care (Acuf # 01-12-01531) og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, USA Department of Health and Human Services, og NIH. Alle studier ble godkjent av University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og bruk komité.
Reagenser
Detaljer om alle reagenser som brukes er gitt i
Fil S1.
OV167 og OV202 (oppnådd fra V. Sridhar, Mayo Clinic) cellelinjer ble dyrket i MEM og DMEM henholdsvis supplert med 10% FBS og 1% antibiotika (penicillin /streptomycin). OVCAR-5 var fra ATCC og dyrket i DMEM med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika (penicillin /streptomycin). A2780-celler (Sigma-Aldrich) ble dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% antibiotikum (penicillin /streptomycin) i henhold til leverandørens anbefaling. OVCAR-5-celler ble dyrket i DMEM høy glukose med 10% FBS, L-glutamin og NEAA. OSE (TST) celler ble dyrket i MCDB105 media med 15% FBS og 1% hygromycin. A2780 /CP-70-cellelinjer ble dyrket i henhold til vår tidligere publiserte prosedyrer [18]. SKOV3 cellelinje fra ATCC og SKOV3-ip fra V. Sridhar laboratorium (Mayo Clinic) ble dyrket i McCoys 5A media supplert med 10% FBS og 1% antibiotika.
deltagerne og bygging av microarray (TMA)
TMA ble opprettet fra formalinfiksert, parafininnstøpte svulster i 210 Mayo Clinic saker innmeldt til og med desember 2009. Alle deltakere gitt skriftlig informert samtykke for IRB-godkjent protokoll (09-008365) og kliniske data ble abstrahert for alle tilfeller. Alle studier ble godkjent av Mayo Clinic Institutional Review Board (Protocol # 09-008365).
Vi brukte en automatisert Beecher Instruments ATA-27 arrayer følgende patolog gjennomgang indikerer svulst plassering. Tre 0,6 mm-kjernene ble fjernet fra hvert tilfelle parafinblokk og anbragt i en mottaker parafinblokk i henhold til en randomisert elektronisk kart TMA. Mottaker blokker ble skiver i 5-mikrometer seksjoner og montert på ladede lysbilder.
antistoff, Immunohistochemistry, og poeng
TMA farging ble utført på Leica BOND auto Stainer, ved hjelp av bindingen polymer avgrense deteksjon kit (katalog # DS9800, Leica Microsystems). Lysbilder ble utsatt for primær antistoff som gjenkjenner CBS (1:1000, polyklonale A01, Abnova), etter å optimalisere fargeforhold på positive kontroll vev (granulosa celle svulster). Negative kontroller inkludert en uspesifikk isotype kamp og negative musesera (1:500); Lysbilder ble scoret uavhengig av 2 forfattere (RB og EB), og avvik ble løst ved en gynekologisk patolog (
Fil S1
).
Transfeksjon og Knockdown
Celler ble transfektert med egge kontroll siRNA eller CBS siRNA (Hs_CBS_5 FlexiTube siRNA (SI02777159, Qiagen) /SASI_Hs01_00214623 (Sigma)) ved HiPerFect® transfeksjon agent i suspensjon med en liten endring av produsentens protokoll (
Fil S1
).
Cell lysis og Western blotting
Cell lyse og western blotting ble utført i henhold til allerede publiserte prosedyre [19]. De primære antistoffer ble brukt ved en konsentrasjon på følgende måte: CBS (1:1000 fortynning), CSE antistoff (1:1000), α-tubulin (1:2000), β-aktin (1:1000 fortynning), NF-kB p65 (1:1000 fortynning) og p53 antistoff (1:200 fortynning).
Realtime PCR
Total RNA ble isolert fra transfekterte celler ved hjelp RNeasy Plus Mini (Qiagen). RNA ble først retrotranscribed hjelp iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad) og deretter realtime PCR ble utført ved hjelp av TaqMan® SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems). Primerne for mennesker CBS (PPH13484B-200) og beta aktin (PPH00073G-200 ACTB) var fra QIAGEN. For CSE, tilpasset designet primere (Forward: CAGCAATTACACCAGAAACCAAG og bakover: CAGCCTTCAATGTCAATCACC) ble brukt. Den komparative C
t metoden ble brukt for å beregne den relative overflod av mRNA og sammenlignet med den til beta-aktin uttrykk [20]. Forsøkene ble gjennomført tre ganger i tre eksemplarer.
Cell Proliferation Assay
Transfekterte eggstokkreft celler ble samlet ved trypsinering, telte sådd i 24-wellplates (4 × 10
4 per brønn) og dyrket i 24 timer og (3H) tymidin analysen gjennomført som tidligere beskrevet [21] (
File S1
).
Homocystein (homocystein) Måling
homocystein nivåer i cellelysater av Sc-siRNA og CBS siRNA behandlet A2780 celler ble bestemt 48 timer etter transfeksjon ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC /MS /MS) (
Fil S1
).
homocystein Overdose Eksperimenter
Omtrent 10
4 A2780, OSE eller SKOV3-ip-celler per brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate med respektive vekstkulturmedier. Etter 24 timer, ble forskjellige konsentrasjoner av homocystein oppløst i vekstkulturmedium tilsatt til cellene og inkubert i 24 timer i en CO
2 inkubator. 24 timer etter behandling, cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTS-analyse som nevnt ovenfor.
H
2S Måling
H
2S konsentrasjoner av ubehandlet eller behandlet AOAA eggstokkreft celler ble målt etter en litteratur rapportert protokoll med mindre modifikasjoner [22]. «H
2S konsentrasjon av hver prøve ble beregnet mot en kalibreringskurve over Na
2S.
H
2S Rescue Eksperiment
A2780-celler ble transfektert med egge kontroll siRNA eller CBS kontroll siRNA som nevnt ovenfor. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene høstet ved trypsinering og 10
4 celler /brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate. Etter 12 timer, ble forskjellige konsentrasjoner av Na
2S oppløst i RPMI-10% FBS tilsatt til cellene og inkubert i 24 timer i en CO
2 inkubator. Etter 24 timer ble celleviabilitet vurdert av MTS analysen som nevnt ovenfor.
GSH analysen
Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll (Cayman Chemicals). Kort sagt ble ovarian cancer-cellelinjer transfektert med det forvrengte styre eller CBS siRNA i 60 mm kulturplater som nevnt ovenfor. Etter 48 timer ble cellene skrapet av og samlet opp i 50 mM MES pH 6,0, og lysert ved sonikering ved 4 ° C. Lysatet ble deretter sentrifugert ved 14 000 rpm i 10 min ved 4 ° C og den klare supernatanten (dvs. cellelysat) ble oppsamlet. Lysatet ble de-proteinated ved hjelp av TEAM-reagens, og det totale cellulære GSH bestemt mot en standardkurve utviklet samtidig ved å måle absorbansen ved 405 nm i 25 minutter etter tilsetning av analysen cocktail. Forsøket ble utført i tre eksemplarer og betydning bestemmes ved hjelp av to-sidig Student t test, ble P≤0.05 betraktet som signifikant.
GSH Rescue Experiment
A2780 celler ble transfektert med egge kontroll siRNA eller CBS kontroll siRNA som nevnt ovenfor. Post 48 h transfeksjon, ble cellene høstet ved trypsinering og 10
4 celler /brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate. Etter 12 timer, ble forskjellige konsentrasjoner av redusert glutation oppløst i RPMI-10% FBS tilsatt til cellene og inkubert i 24 timer i en CO
2 inkubator. Post 24 h behandling, cellen levedyktighet ble vurdert av MTS analysen med Cell Titer 96® (Promega) i henhold til produsentens protokoll. Cellelevedyktigheten ble uttrykt som et prosentforhold av absorbansen til de behandlede celler til de ubehandlede kontroller.
ROS-analysen
ROS-analysen ble utført i A2780-celler 48 timer etter transfeksjon med egge kontroll eller CBS siRNA etter en modifisering av en tidligere utgitt prosedyre ved hjelp av flowcytometri [23] (
Fil S1
).
luciferaserapportørplasmid analysen
Omtrent 2 × 10
4 antall av A2780-celler ble sådd ut pr brønn i 96 brønners plate, dagen før transfeksjon. Den følgende dag ble cellene transfektert med en blanding av NF-kB drevet ildflue luciferase plasmid (100 ng), Renilla luciferase plasmid (50 ng) og siRNA (200 nM) per brønn ved hjelp av Lipofectamine og pluss reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll . Post 48 h transfeksjon, kultur media ble kastet og ble analysert for ildflue luciferase aktivitet og Renilla luciferase aktivitet ved hjelp av Dual Glo Luciferase Assay System (Promega) i henhold til produsentens metode. Forholdet for ildflue luciferase-aktivitet for å Renilla luciferase-aktivitet målt ved hjelp av luminescens ble deretter beregnet, og dataene ble normalisert. Eksperimentet ble utført i triplikat og signifikans bestemt ved anvendelse av to-sidig Student t test, ble betraktet som signifikant P≤0.05.
Konfokalmikroskopi
Lokalisering av CBS ble bestemt ved farging etterfulgt av konfokal mikroskopi. Omtrent, ble 1,5 × 10
3 celler belagt per kammer av en 4-kamret lysbilder. Etter 12 timer ble cellene behandlet med 200 nM Mitotracker Grønn (Invitrogen) i 30 minutter ved 37 ° C i komplett medium fiksert med 4% PFA, permeabilisert med 0,1% TritonX-100 i PBS, blokkert med 4% BSA i PBS, farget med primær CBS antistoff (fortynning 1:100) i 1% BSA-PBS, blokkert med 5% geiteserum i 1% BSA-PBS og farget med Cy3-merket geit anti-kanin sekundært antistoff. Cellene ble vasket 3 x 3 min med PBS etter hvert trinn i løpet av immunfarging. Bildene ble anskaffet ved hjelp Zeiss LSM510 mikroskop og behandlet ved hjelp ImageJ (NIH).
Oksygen Forbruk Eksperimenter
Høy oppløsning respirometri (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruk, AT) ble brukt for å måle oksygen forbruk i intakte celler [24]. DatLab programvare (Oroboros Instruments, Innsbruk AT) ble benyttet for å bestemme O
2 flux etter akutt AOAA behandling og i siRNA behandlet A2780 celler. Oksygen flux priser ble uttrykt per million celler
(File S1).
Mitokondriell ROS produksjon
Mitokondriell ROS-nivåer ble bestemt i egge kontroll siRNA og CBS siRNA behandlede celler 48 timer etter transfeksjon av MitoSOX (Invitrogen) farging ble utført i henhold til litteraturen protokollen [25]
(Detaljert i File S1)
.
citratsyntaseaktivitet (CS) aktivitet
CS aktivitet ble målt spektrofotometrisk i helcellelysater av A2780 celler etter behandling med forskjellige doser av AOAA i 3 timer etter en litteratur rapportert metode [26].
NAD /NADH Ratio Måling
NAD /NADH ratio ble målt ved hjelp av Abcam NAD /NADH Assay Kit (ab65348) i helcellelysater henhold til produsentenes protokollen (detaljer gitt i
Fil S1
).
Total ATP og ADP /ATP ratio
Totalt ATP nivåer i CBS forstummet A2780 celler og AOAA behandlet A2780 celler ble målt ved hjelp av Sigma Adenosin 5′-trifosfat (ATP) Bioluminescent Assay Kit (Flaa) og ADP /ATP-forholdet ble målt ved hjelp av Abcam sin ADP /ATP ratio analysesett i henhold til produsentens protokoller. Detaljert protokoll i
Fil S1.
Liposomalt siRNA Forberedelse
For
in vivo
levering, siRNA ble innlemmet i DOPC som tidligere beskrevet [18]. For mer informasjon se
Fil S1.
ortotopiske Modell for eggstokkreft
Før injeksjon kreftceller i mus (8-12 uker gamle), cellene ble vasket to ganger med PBS, frittliggende med 0,1% kald EDTA, sentrifugert i 7 minutter, og rekonstituert i HBSS (Invitrogen). Cellelevedyktigheten ble bekreftet ved trypan blå eksklusjon. Svulster ble etablert ved i.p. injeksjon av 1,0 × 10
6A2780 /CP20 celler. Når etablert, gjenspeiler denne svulsten modellen vekstmønster av avansert eggstokkreft [27]. For å vurdere effekten av siRNA terapi på tumorvekst, behandling ble igangsatt en uke etter i.p. injeksjon av tumorceller. De individene som gjorde obduksjon, kreft samlinger, og behandlingen vev ble blindet for behandling gruppeoppgaver (File S1).
Immunohistochemistry av tumorprøver
oktober frosne tumorprøver ble seksjonert og farget for H E, Ki-67 (MIB-1, Dako, M7240) eller CD31 (PECAM-en, Santacruz, sc-1506-R) som tidligere beskrevet [28]. (Fil S1).
Statistical Analysis
Alle resultatene vises som gjennomsnitt +/- s.d. Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av to-halet Student t test, og en verdi av P≤0.05 (*) ble betraktet som signifikant og P≤0.01 som svært signifikant (**). Til sammenligning blant flere grupper, ble Enveis ANOVA brukes (File S1).
Resultater
CBS er overuttrykt i Primær ovarialcancer og eggstokkreft cellelinjer
Tissue distribusjon studier på mennesker har vist at leveren og bukspyttkjertelen har den høyeste ekspresjon av CBS mRNA med noen ekspresjon i hjernen og nyrene [29]. I murine modeller, har CBS blitt foreslått å være involvert i oocytt utvikling og
cbs
– /- mus lider av uterin dysfunksjon [11], [30]. For å forstå hvilken rolle CBS i menneskelig eggstokkreft, vurdert vi uttrykket nivået av CBS i grunnskolen eggstokkreft prøver og dens forhold til kirurgisk-patologiske faktorer. Ved hjelp av en serie av microarray (TMA) konstruert fra primære epitelceller eggstokkreft vi identifisert 210 tilfeller med evaluerbare flekker ved hjelp av TMA. Vi har funnet uttrykk for CBS å være vanlig i cytosol av primære ovarietumorer, særlig i serøs karsinom, den mest vanlige histologisk variant. Tabell 1 oppsummerer de demografiske, kliniske og histologiske forhold som ble evaluert for en assosiasjon med moderat til sterk CBS ekspresjon (Tabell 1). Kort, moderat sterkt uttrykk var assosiert med serøs histologi (69,8% vs. 41,0% serøs vs. nonserous, p 0,001) og høyere grad av kreft (64,7% vs. 31,6%, grad 3 eller 4 vs. grad 1 eller 2, p = 0.005) (fig. 1A). Mens statistisk signifikant forskjellig på tvers av trinn, uttrykk var fortsatt til stede i 35% av tidlig stadium svulster. Ved å betrakte bare de 149 serøs tilfeller i større kullet, ekspresjon var moderat til sterk i 8/11 tidlig stadium (FIGO trinn I og II) krefttyper, noe som tyder på at CBS uttrykket er et forholdsvis tidlig karakteristikk av serøse eggstokkreft. Etter å ha demonstrert uttrykk for CBS i humane tumorvev, sammenlignet vi uttrykket for CBS i normal eggløsnings vs. cancercellelinjer. Vi anvendte kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) og immunblotting for å vurdere ekspresjonen av CBS på mRNA og proteinnivåene på henholdsvis (fig. 1B-D). Både på mRNA og proteinnivå, minimal til ingen ekspresjon av CBS ble iakttatt i det ikke-maligne ovarie overflate epitelcellelinje (OSE). Imidlertid 4 av 6 kreftcellelinjer uttrykte betydelig høy CBS både på protein og mRNA-nivå. Interessant, ekspresjon av CSE ble observert i cellelinjer som uttrykte liten eller ingen CBS inkludert OSE, noe som tyder på en invers korrelasjon mellom uttrykk for de to enzymer (Fig. 1B). Etter å ha bekreftet at CBS er uttrykt både i cellelinjer, og i primær eggstokkreft vi neste søkt å undersøke den funksjonelle betydningen av CBS.
(A) Immunhistokjemisk farging av en vev microarray av epitelial eggstokkreft prøver. Representative bilder er vist på ingen (i), svak (ii), moderat (iii) og (iv) sterk farging. (B) Uttrykk for CBS og CSE i ulike eggstokkene cellelinjer som bestemmes av immunoblotting. α-tubulin anvendes som laste kontroll. (C) RT-PCR-data som viser ekspresjonen av CBS mRNA i forskjellige ovarie cellelinjer. (D) RT-PCR-data som viser ekspresjonen av CSE-mRNA i forskjellige ovarie cellelinjer. (E) Effekt av CBS knockdown på proliferasjonen av OV202, SKOV3, A2780 og A2780 /CP-70-celler, og (F) immunblotting av data for å bestemme graden av siRNA-mediert knockdown. (G) Effekt av CBS hemming på spredning av OV202, SKOV3 og A2780 celler ved AOAA (24 h behandling) bestemmes gjennom MTS analysen.
nedregulering av CBS Svekker Cell Proliferation
in vitro
for å finne ut hvilken som helst rolle for CBS i eggstokkreft celleproliferasjon ble CBS stilnet i A2780, A2780 /CP-70, OV202 og SKOV3 celler ved hjelp av CBS-spesifikke siRNA. For å utelukke ikke-spesifikk målretting av siRNA, knockdown og spredning ble vurdert med siRNA fra to forskjellige kilder. En betydelig reduksjon i proliferasjon ble observert i alle ovarie cancer cellelinjer undersøkt ved CBS knockdown etter (
3 H) -tymidin-inkorporering (fig. 1E). Effektiv knockdown av CBS (~80%) ble også bekreftet ved immunoblotting 48 timer post-transfeksjon, i forhold til egge siRNA transfekterte celler (fig. 1F). For ytterligere å bekrefte effektene av CBS lyddemping for ovariekreft cellenes levedyktighet, ble det benyttet en spesifikk kjemisk inhibitor av CBS, Aminoxyacetic Acid (AOAA) [8]. Levedyktigheten til A2780, ble OV202 og SKOV3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AOAA i 24 timer bestemt ved MTS-analysen. Celleviabilitet redusert kraftig til 50% på ~ 7 mm AOAA konsentrasjon med ytterligere doseavhengig nedgang før tidligst ~ 10 mM konsentrasjon for A2780 og SKOV3 celler mens i OV202 effekten var mindre uttalt (Fig. 1G). Disse dataene antyder at en grenseverdi for CBS aktivitet foreligger som er nødvendig for å opprettholde spredning av eggstokkreft celler.
nedregulering av CBS Endrer antioksidantnivået, Triggers apoptotisk Cascades og Forbedrer Drug Sensitivity
Utgangen av CBS hemmet reaksjoner i cellen kan være a) en opphoping av homocystein b) reduserte H
2S og c) redusert cystationin, forløperen for GSH. Derfor må vi først testet om homocystein var en årsaksfaktor for redusert spredning (Fig. 2A, B). Vi supplert kulturmediet med økende konsentrasjoner av homocystein og deretter bestemt levedyktighet av OSE og eggstokkreft celler (SKOV3-ip og A2780) ved bruk av MTS-måling. Økende homocystein nivåer hadde ingen innvirkning på levedyktigheten til noen av cellene testet noe som indikerer at redusert nivå av H
2S eller cystationin var trolig ansvarlig for redusert spredning (Fig. 2B). Dessuten ble det ikke observert noen signifikant forskjell i cellulære homocystein nivåer målt ved massespektrometri på CBS knockdown i A2780 celler, ytterligere utelukker en rolle for homocystein i forårsaker redusert spredning (Fig. 2A). Imidlertid mangel på signifikante forskjeller i homocystein nivåer kan være fordi homocystein kan gjennomgå rask omdannelse til metionin ved metionin-syntase eller kan benyttes ved CSE for å fremstille H
2S, men ikke cystationin [31].
(A ) Endring i homocystein nivåer i cellelysatene av Sc-siRNA og CBS siRNA behandlet A2780 celler målt ved massespektrometri. (B) homocystein overdose eksperiment for å demonstrere effekten av homocystein (24 timers behandling) på proliferasjonen av OSE, A2780 og SKOV3-ip-celler ved MTS-analyse. (C) H
2S nivåer i OV202, SKOV3 og A2780 celler etter kronisk inhibering med forskjellige doser av AOAA i 3 timer. (D) Na
2S redning eksperimentet etter knockdown av CBS i A2780 celler. Cellene ble behandlet med forskjellige doser av Na
2S i 24 timer og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analyse. (E) Endring i total glutation nivå 48 timer etter transfeksjon med egge kontroll og CBS siRNA i OV202, SKOV3 og A2780 celler. (F) GSH redning eksperimentet etter knockdown av CBS i A2780 celler. Cellene ble behandlet med ulike doser av GSH i 24 timer, og cellelevedyktigheten ble vurdert av MTS analysen.
Vi neste testet bidraget fra H
2S i å støtte spredning av eggstokkreft kreftcellelinjer . En doseavhengig reduksjon i intracellulære nivåer av H
2S ble observert etter 3 timer inhibering av CBS med forskjellige konsentrasjoner av AOAA (Fig. 2C). Den generelle reduksjon i H
2S nivåer av OV202 celler var mindre markert enn i A2780 og SKOV3-celler som kan være på grunn av eksistensen av alternative H
2S synteseveien i OV202 celler. Disse resultatene indikerer at CBS spiller en kritisk rolle i H
2S syntese i disse eggstokkreft celler. Imidlertid er rollen til CSE kan ikke utelukkes på dette punkt, selv om det er usannsynlig, siden mesteparten av ovarie cancer-cellelinjer som ble testet her viste en lav til ubetydelig ekspresjon av CSE både på messenger og på proteinnivå. For å bekrefte en rolle H
ytterligere 2S vi supplert kulturmediet med økende konsentrasjoner av et H
2S donor, natriumsulfid (Na
2S) [(32, 33] i egge siRNA og CBS siRNA behandles A2780 celler. ved 5 mM Na
2S konsentrasjonen ble observert en ~ 20% redning i celle levedyktighet (fig. 2D). Delvis redning av celleproliferasjon ved H
2S i CBS-forstummet celler antyder at andre enn H trasé
2S biosyntese som GSH kan også spille en viktig rolle. Derfor har vi neste fokusert på å tyde en rolle GSH i eggstokkreft celleproliferasjon. lyddemping CBS betydelig redusert total cellular glutation (GSH + GSSG) nivåer i eggstokkreft celler dramatisk sammenlignet med kontrollceller (fig. 2E). Viktigere var en GSH konsentrasjonsavhengig redning av cellulær levedyktighet ble observert i CBS stilnet A2780-celler, med fullstendig redning ved 2 mM konsentrasjon i 24 timer (fig. 2F). Samtidig øker i cellulær ROS nivåer ble observert som bestemt ved H
2-karboksy DCF-fluorescens-analyse i CBS-dempede A2780-celler (fig. 3A) som bekrefter med fallet i total intracellulære glutation i CBS-forstummet celler. Disse resultater antyder at den mest signifikante effekt av tie CBS i kreftceller er hemming av den cellulære maskineri antioksidant. I denne forbindelse er to andre molekyler, p53 og NF-kB vist seg å være bemerkelsesverdig redox-sensitive [34] – [38]. Faktisk, tie CBS i A2780 celler indusert ekspresjon av p53 og redusert uttrykk for
RELA Twitter /p65 subenheten av NF-kB (Fig. 3B). I overensstemmelse, ble aktivering av NF-kB også inhibert med nesten 50% i CBS stilnet A2780-celler, som bestemt ved en promoter luciferase-assay som har flere NF-kB (p65 /p50) bindingsseter (fig. 3C). Imidlertid er en mer direkte rolle for CBS i tillegg til forbedret ROS i å forårsake redusert NF-kB-aktivering er også mulig. Siden intracellulære glutation og ROS ble bemerkelsesverdig berørt i CBS forstummet celler, neste fastsatte vi hvis kombinasjon med cisplatin ville forbedre terapeutisk effekt [39]. Faktisk behandling av A2780-celler med cisplatin redusert IC
50 verdi fra 13,1 pM i kontroll siRNA transfekterte celler til 7,9 pM i CBS siRNA transfekterte celler som bestemt ved MTS-analyse, 24 timer etter cisplatinbehandling (Fig. 3D). Disse data indikerer at CBS ved å virke gjennom glutation og H
2S kan tilveiebringe en stor overlevelsesfordel til kreftceller mot cytotoksiske fornærmelse.
(A) Virkning av CBS knockdown (48 timer etter transfeksjon) på total ROS nivå bestemt av DCF-analysen og kvantifisert ved hjelp av strømningscytometri. (B) immunblotting av data eksemplifiserer virkningen av CBS stanse på ekspresjon av p53 og NF-kB p65 i A2780 celler. β-actin tjener som lastkontrollen. (C) luciferase reporter-analyse som viser virkningen av CBS knockdown på aktiviteten av NF-kB i A2780 celler transfektert med ildflueluciferase med flere NF-kB-bindingssete og kryptert kontroll siRNA eller CBS siRNA.
wt
-renilla luciferase ble transfektert å normal ildflue luciferase aktivitet. (D) CBS stanse øker aktiviteten av cisplatin i A2780 celler. Den (•) og (О) viser virkningen av cisplatin på kryptert kontroll siRNA og CBS siRNA behandlede celler. Cellelevedyktigheten ble bestemt etter behandling med økende doser av cisplatin i 24 timer gjennom MTS-analyse og cellelevedyktigheten ble uttrykt som et prosentforhold av behandlede celler til de ubehandlede kontroller. IC
50 verdier ble oppnådd ved ikke-lineær regresjonsanalyse.
Dempe CBS Reduserer mitokondrie respirasjon og Hemmer ATP syntese
I et forsøk på å etterforske en rolle CBS foruten amino acid metabolism, vi først bestemmes den cellulære lokalisering av CBS enzymet ved hjelp av immunfluorescens.
