Abstract
Angiogenese hemming er en viktig terapeutisk strategi for avansert stadium prostatakreft. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium viste at vedvarende stimulering av Rap1 med 8-pCPT-2′-O-Me-cAMP (8CPT) via aktivering av Epac, en Rap1 GEF, eller ved uttrykk for en konstitutivt aktiv Rap1 mutant (cRap1) undertrykker endothelial celle chemotaxis og påfølgende angiogenese. Når vi testet denne modellen i sammenheng med en prostata svulst xenograft, fant vi at 8CPT hadde ingen signifikant effekt på prostata tumorvekst alene. Imidlertid, i celler som cRap1, 8CPT dramatisk hemmet ikke bare prostatatumorvekst, men også VEGF-ekspresjon og angiogenese i svulsten mikromiljøet. Etterfølgende analyse av mekanismen viste at, i prostata tumor epitelceller, 8CPT handlet via stimulering av PKA snarere enn Epac /Rap1. PKA antagoniserer Rap1 og hypoksiske induksjon av 1α proteinekspresjon, VEGF-produksjon og, til slutt, angiogenese. Sammen disse funnene gi bevis for en roman samspill mellom Rap1, Epac, og PKA som regulerer tumor-stromal induksjon av angiogenese
Citation. Menon J, Doebele RC, Gomes S, Bevilacqua E, Reindl KM, Rosner MR (2012) A Novel Samspill mellom Rap1 og PKA Regulerer Induksjon av angiogenese i prostatakreft. PLoS ONE 7 (11): e49893. doi: 10,1371 /journal.pone.0049893
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 17 september 2012; Godkjent: 15 oktober 2012; Publisert: 15.11.2012
Copyright: © 2012 Menon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av PC094476 – Department of Defense (DOD) Prostate Cancer Research Program (PCRP) Post doc (JM) og National Institutes of Health /National Cancer Institute R01-CA109278 (MRR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn i USA [1]. Den høye sykelighet og dødelighet i forbindelse med utbruddet av hormon-ildfast, metastatisk prostatakreft mandater behovet for innovative behandlingsregimer for å forbedre prognosen for denne sykdommen. Flere strategier er blitt brukt til å målrette angiogenese i prostata cancer inkludert blokade av pro-angiogene faktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) via monoklonale antistoffer eller lavmolekylære inhibitorer som målretter nedstrøms signale effektor-trasé som VEGF-reseptor tyrosin-kinase pathway [2], [ ,,,0],3], [4]. Imidlertid er stor brist i denne løsning er det betydelig antall pro-angiogene faktorer, bortsett fra VEGF, som kan indusere angiogenese og derved unngå disse midler. Et alternativ til å hemme en eller flere av de pro-angiogene faktorer er å identifisere signalmolekyler som funksjon å regulere angiogenese [5].
Flere studier har innblandet Rap1 som en formidler av angiogenese [5], [6] , [7], [8], [9], [10], [11]. Defekt angiogenese og hematopoese ble observert hos mus som mangler Rap1a eller Rap1b, og en mekanisme som involverer integriner og VEGF-reseptorer i endotelceller ble nylig rapportert [12], [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Således tap av Rap1 hemmer angiogenese under utvikling, i samsvar med den rolle Rap1 spiller i cellesignalisering, integrin-mediert celleadhesjon og celle-celle kryss, funksjoner som er viktige for rørformet struktur formasjonen. CAMP-derivatet 8CPT-2Me-cAMP (8CPT) er en potent agonist for Epac, en guanin nukleotid utveksling faktor for Rap1, og en svak agonist av PKA [18], [19]. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har vist at, i primære, humane mikrovaskulære endotelceller, forlenget stimulering av Rap1 enten ved Epac aktiverings følgende 8CPT behandling eller ved ekspresjon av konstitutivt aktivert Rap1 A63E (cRap1) hemmer kjemotakse og angiogenese [8], [9]. Således kan angiogenese også bli hemmet i endotelceller, når Rap1 er utsatt for forlenget stimulering av medikamenter eller mutasjon. Sammen danner disse studier antyder at graden av Rap1 aktivering er kritisk for den angiogene prosess.
PKA har også vært knyttet til angiogenese som både en positiv og negativ regulator [20], [21], [22], [ ,,,0],23], [24], [25], [26]. Økt aktivitet av PKA fremmer endotelial rør formasjon, og dermed fremme angiogenese [27]. Omvendt bevirker PKA aktivering fosforyleringen av den transkripsjonelle repressoren Id1 [28] og forstyrrer dens nucleo-cytoplasmatisk skyt, og dermed hemme angiogenese [29]. I tillegg, enten over-ekspresjon av den katalytiske subenheten til PKA eller farmakologisk aktivering av PKA induserer død av endotelceller ved apoptose, undertrykke angiogenese [22], [23]. Til sammen tyder disse resultatene på at angiogenese resultatene fra en balanse mellom pro-og anti-angiogene faktorer, inkludert Rap1 og PKA, og enten ekstreme vil ha skadelige effekter.
Formålet med denne studien var å finne ut om Rap1 regulerer angiogenese i prostatakreft. Våre resultater tyder på at konstituerende Rap1 aktivering i menneskelige prostata kreftceller fremmer hypoksisk induksjon av VEGF og angiogenese, og PKA motvirker denne effekten. Videre viser våre studier tyder på at 8CPT behandling kan hemme angiogenese via to forskjellige mekanismer som involverer PKA aktivering i prostatatumorceller, som vist her, og Epac /Rap1 aktivering i endotelceller [8].
(A og B)
venstre panel
: Tumor volum (uttrykt i mm
3) av human PC3 og PC3-cRap1 xenotransplantater ble behandlet som indikert ble målt som beskrevet i Metoder. Dag 0 representerer den første dagen av behandlingen; * P
0,05, n = 7 for hver gruppe.
Høyre Panel
: Bilder av en representant svulst fra hver behandlingsgruppe ved slutten av forsøket (dag 28). (C) Tumor volum (uttrykt i mm
3) av human PC3 og PC3-cRap1 xenotransplantater behandlet som indikert ble målt som i A; * P
0,05, n = 7 for hver gruppe. (D) Tumorer fra panel C ble veid ved slutten av eksperimentet (dag 28) og uttrykt i gram; * P 0,05; (
n
= 7).
Materialer og metoder
Prostate Cancer Cell Lines, behandlinger, Antistoffer, Plasmider, og reagenser
Epac aktivator 8- (4-klorfenyltio) -2-O-metyl-cAMP (8CPT) og PKA aktivator N6-Benzoyladenosine- 3 «, 5’syklisk monofosfat (6-Bz-cAMP) ble kjøpt fra Biologisk Life Sciences Institute (Bremen , Tyskland). LNCaP-celler og PC3-celler, ble oppnådd fra American Tissue Culture Collection (Manassas, Virginia), holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i Mediatech RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum, 50 ug /mL penicillin og 50 U /ml streptomycin. Alle medier og vekst reagenser ble kjøpt fra Gibco BRL (Grand Island, New York). Celler ble inkubert i 24 timer med serumfritt medium før hver behandling. Celler ble behandlet over natten med 10 uM 8CPT eller 10 pM 6BZ-cAMP oppløst i PBS eller PBS alene som en kontroll medium. Celler ble viderebehandlet i 6 timer (med mindre annet er angitt) med 10 mM CoCl
2 for å etterligne hypoksiske betingelser eller med SDF-1α på 200 ng /ml i 20 min. Celler ble forbehandlet med den PKA-inhibitorer H-89 (10 pM) i 30 minutter før CoCl
2 behandling. Antistoffer mot Epac og tubulin ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California). Muse-anti-human CD31 og kanin-anti-human VEGF ble innkjøpt fra Abcam (Cambridge, MA). SDF-1α ble hentet fra R * P 0,05; n = 7; a.u. = vilkårlige enheter. (C) Tumor volum (uttrykt i mm
3) av humane PC3-cRap1 xenografter. PC3-cRap1 celler ble injisert som xenotransplantater på dag 0 og fikk vokse i 10 dager før en osmotisk minipumpe inneholdende de behandlingene ble implantert for konstant infusjon (dag 10, pumpe). Tumorer som ble behandlet som indikert ble målt som beskrevet i Methods; * P 0,05; n = 8 for hver gruppe. (D) Tumorvekt av humane PC3-cRap1 xenografter. Svulster fra panel C ble veid ved slutten av eksperimentet (dag 38) og uttrykt i gram; * P 0,05; (
n
= 8).
Etikk erklæringen
Alle prosedyrer som involverer mus holdt politikken til University of Chicago Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC ) og ble godkjent av IACUC under protokollen # 1196. Mus ble plassert i Vivarium i Gordon Senter for Integrative Science ved University of Chicago i dedikerte rom med ventilert bur med HEPA-filtrert luft (12-timers lys /mørke syklus). Mus som hadde full tilgang til vann og mat. Musene ble overvåket daglig av vitenskapelig ansatte. Muligheten til å få tilgang mat og vann, bakben mobilitet, normal pusting, normal bevegelse og, og sosial atferd ble evaluert. Dersom et dyr syntes å være syk ble det overvåket i 24 timer og deretter bedøvet med isofluran og avlivet ved gassformig middel etterfulgt av cervikal dislokasjon. Dyrene ble også avlivet på anbefaling av veterinær eller klinisk personale. Alle prosedyrer ble utført under ketamin /xylazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Xenotransplantat Model of Human Prostate Cancer
Mann atymiske mus (15-20 g, 4-6 uker av alder, ble National Cancer Institute, Frederick, MD) inokulert subkutant i nedre venstre flanke med 1 × 10
6 PC3 (PC3-GFP) eller PC3-cRap1 (PC3-cRap1A63E-GFP) prostatakreftceller suspendert i 200 ul av PBS. Musene ble randomisert til behandling med enten PBS eller 2,5 pmol 8CPT, eller 2,5 umol H-89. For dette formål ble musene bedøvet som beskrevet ovenfor og osmotiske minipumper (Alzet modell 2004, Durect Corp, Cupertino, CA) ble innført subkutant til infusjon av enten PBS, 8CPT eller H-89 i 28 dager. Ved slutten av behandlingen ble dyrene avlivet, ble tumorene fjernet, veiet og behandlet for immunhistokjemi. Tumorvolumet ble målt ved bruk av formelen -1/2 x l x w
2 annenhver dag, hvor l = lengden og w = bredde.
(A) VEGF-nivåene ble målt ved hjelp av ELISA i PC3 og PC3-cRap1 celler under hypoksiske lignende tilstander (CoCl
2), som beskrevet i Metoder; * P 0,05, (n = 3). (B) Immun analyse av kjernefysiske utdrag fra PC3 og PC3-cRap1 celler behandlet som angitt. HIF-1 a proteinnivåer ble bestemt ved immunoblotting med spesifikt antistoff; (C) Analyse av VEGF mRNA-nivåer hos qPCR i PC3 og PC3-celler cRap1 behandles som angitt. Data ble normalisert til GAPDH-nivåer; * P 0,05 (
n
= 3)
Immunohistochemistry
Mus svulster ble fiksert med 4% paraformaldehyde i 24 timer og inkuberes i 70% etanol for. 48 timer før parafin innebygging. De innebygde svulster ble kuttet i fem mikron tykke seksjoner og farget med hematoxylin og eosin å bestemme morfologi. Deler av svulster infused med 8CPT, H-89 eller PBS ble immunostained for VEGF, CD31 eller Ki67 hjelp av streptavidin-biotin metode for å måle celle angiogenese eller spredning. Fargete snitt ble visualisert og fotografert med et videobilde analysesystem (Scion, Inc., Frederick, MD). Et automatisert cellebildesystem ble anvendt for å kvantifisere VEGF immunhistokjemisk farging. Kapillær tetthet ble beregnet ved å telle fartøy immunfarget med CD31 +. Minst 6 tilfeldige felt ble talt i et representativt snitt. Verdier er representert som middel pluss eller minus SEM.
VEGF ELISA
Celler (5 x 10
4) ble sådd ut i 24-brønners plater. Når cellene var 70-80% sammenflytende, ble de behandlet som beskrevet ovenfor. Medium ble samlet fra brønnene og VEGF-nivåer ble bestemt i henhold til produsentens instruksjoner til human VEGF ELISA Development kits (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey).
RNA Isolation og revers transkripsjon /Real-time Polymerase Chain Reaction
RNA ble isolert fra cellene ved bruk av RNeasy QIAshredder og
R MINIKIT fra Qiagen Biosciences og ble underkastet RT-PCR ved anvendelse av høy kapasitet cDNA revers-transkriptase kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR) ble utført ved hjelp av genuttrykk Analyser fra Applied Biosystems og 2X mester mix fra Applied Biosystems eller ABGene på en Applied Biosystems 7300 i en StepOne Plus Real-Time PCR System. Resultatene ble kvantifisert som Ct-verdier, hvor Ct er definert som terskelen syklus av PCR-amplifisert ved hvilken produktet først ble detektert, og er definert som relativ genekspresjon (forholdet mellom target /kontroll). Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer og normalisert til GAPDH (Applied Biosystems, Carlsabad, CA).
Utarbeidelse av Nuclear Ekstrakter og Western Blotting
Sub-konfluent PC3 og PC3-cRap1 cellene ble lysert i kald kjerne buffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT og 5% glycerol), som inneholder komplette proteasehemmere (EMD Chemicals, Paulsboro, NJ). Preparatet ble sentrifugert ved 10.000 g i 15 min. Pelleten ble resuspendert i 50 ul buffer med høyt saltinnhold (10 mM HEPES, pH 7,9, 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM DTT og 5% glycerol), og inkubert på is i 20 min. Etter sentrifugering ved 14 000 g i 20 minutter, ble supernatanten samlet opp og tatt som den nukleære fraksjonen og lagret ved -80 ° C. Nukleære proteiner (50 ug /brønn) fra kontroll og 8CPT behandlede celler under hypoksi-lignende betingelser ble separert ved 7,5% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Membranene ble inkubert med primært antistoff over natten (HIF-1α, 1:500; Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO), etterfulgt av 1 time inkubasjon med sekundær anti-mus antistoff koplet til pepperrotperoksidase (1:2500; Sigma, St. Louis, MO). Kjemiluminiscerende reagenser ble brukt for å visualisere de immunoreaktive bånd. a-tubulin (1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) fungerte som lasting kontroll
siRNA Transfeksjon
Epac sirnas (ON-TARGETPlus siRNA, Dharmacon) på 100 nM. ble transfektert inn PC3 celler ved elektroporering (223 v for 23 millisekunder). Celler ble analysert 48 timer etter transfeksjon.
Rap1 aktivitetsanalyse
Rap1-GTP nivåene ble målt ved hjelp av en Rap1 Activation Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, California) etter produsentens protokoll.
Statistical Analysis
data ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc.). Data er gitt som middelverdi ± SE, og sammenlignet ved t-test, Wilcoxon test og en- eller to-veis ANOVA, som hensiktsmessig, etterfulgt av den aktuelle post hoc t-test for å bestemme p-verdier. En p-verdi på 0,05 ble ansett som signifikant
Cellene ble behandlet som angitt, og VEGF-nivåene ble målt ved hjelp av ELISA, som beskrevet i Metoder.. (A og B) PC3 eller PC3-cRap1 celler; * P 0,05, n = 3. (C og D) LNCaP eller LNCaP-cRap1 celler; * P 0,05, n = 2.
Cellene ble behandlet som angitt, og VEGF-nivåene ble målt ved hjelp av ELISA, som beskrevet i Metoder. (A) Reversering av 8CPT effekter av H-89 i PC3-cRap1 celler; * P 0,05, n = 3. (B) Tilbakeføring av 6BzcAMP (6 milliarder) effekter av H-89 i PC3-cRap1 celler; * P 0,05, n = 3. (C) Reversering av 8CPT effekter av H-89 i PC3-cRap1cells; * P 0,05, n = 3.
Resultater
8CPT hemmer Xenotransplantat veksten av prostata celler som uttrykker Aktivert Rap1
For å bestemme effekten av aktivert Rap1 på prostata tumorvekst, injiserte vi atymiske mus med PC3-celler som uttrykker konstitutivt aktivert Rap1A63E (PC3-cRap1) eller behandlet med det cAMP-derivatet 8CPT. For 8CPT levering ble dyrene behandlet subkutant med enten PBS eller 8CPT ved hjelp av en osmotisk minipumpe. 8CPT ble administrert i en dose på 2,5 umol over 28 dager, på grunnlag av en tidligere pilotundersøkelse som viser at dette infusjonshastigheten ble godt tolerert av musene. I løpet av infusjonsperioden, dyrene opprettholdt normal mat og vannforbruk og viste ingen tegn på nedsatt motorisk funksjon. Ingen grove patologiske forandringer ble observert i store organer, noe som indikerer en mangel på toksiske effekter på 8CPT dose gis. Den første dagen av infusjonen ble utpekt som dag 0, og dyrene ble avlivet etter 28 dagers behandling.
Verken konstitutivt uttrykt Rap1 (PC3-cRap1 + PBS) eller 8CPT behandling alene (PC3 + 8CPT) betydelig endret tumorvekst i PC3-xenotransplantater (fig. 1A, 1C). Imidlertid 8CPT dramatisk redusert tumorvekst i PC3-cRap1 xenografter (Fig. 1B, 1C). Analyse av tumorvektene bekreftet a 50% reduksjon i tumorer fra PC3-cRap1 mus behandlet med 8CPT (figur 1D.). Både aktivert Rap1 og 8CPT behandling var nødvendig for denne effekt, siden ingen forandring i tumorer ble observert i 8CPT-behandlede xenotransplantater PC3 eller PBS-behandlede xenotransplantater Rap1.
(A og B) PKA-inhibitor, H-89 (2,5 umol), reversert tumorvekstinhibitering og tumor vektreduksjon mediert av 8CPT i PC3-cRap1 xenografter. PC3-cRap1 svulster fra mus infusert med PBS, 8CPT, eller H-89 ble målt og tumorvolum bestemt som beskrevet i Methods; * P 0,05; n = 8 for hver behandlingsgruppe. (C) CD31 og VEGF immunoreaktivitet i PC3-tumorer cRap1 behandlet som angitt. Immunfarging ble målt som beskrevet i Metoder.
De øvre paneler
: Representative mikrofotografier.
Nedre paneler
: Kvantifisering av immunhistokjemisk farging av tumor skiver; * P 0,05; n = 8 for hver behandlingsgruppe; a.u. = Vilkårlige enheter.
8CPT hemmer angiogenese i PC3-cRap1 xenografter
For å overvåke effekten av 8CPT på angiogenese i prostatakreft, formalinfiksert tumor skiver ble immunostained med antistoffer mot CD31 og VEGF, en endotelcelle markør og en proangiogenic faktor, respektivt. Intra-tumorblodkarene (CD31 +) ble identifisert ved fartøy morfologi og telles (fig. 2A). Svulster fra den PC3 gruppen av dyrene som ble infusert med PBS eller 8CPT hadde lignende antall blodårer og nivåer av VEGF immunoreaktivitet (fig. 2A, 2B). Den samlede VEGF immunoreaktivitet i PC3-cRap1 musetumorer ble økt i forhold til de PC3 musetumorer uten i vesentlig grad å påvirke kapillær tetthet. Overraskende behandling med 8CPT, sammenlignet med PBS, dramatisk redusert både fartøyet tetthet og VEGF-immunreaktivitet i PC3-tumorer cRap1. Disse resultatene indikerer at konstitutivt aktiv Rap1 fremkaller VEGF-produksjon, og 8CPT motvirker denne effekten. Videre reduserer 8CPT blodkardannelse, noe som kan bidra til hemming av prostata tumorvekst i disse musene.
8CPT Reduserer fortsatt vekst i Pre-formet prostatakreft Uttrykke Rap1
I våre innledende forsøk (fig. 1), injiserte vi PC3-cRap1-celler og behandlet med 8CPT på den samme dag (dag 0) for å forhindre tumorvekst. For å avgjøre om 8CPT kan også blokkere pågående tumor cellevekst, injisert vi PC3-cRap1 celler i mus og tillot dem å vokse inn i en håndgripelig svulst før behandling med 8CPT via osmotiske minipumper (Fig. 2C). I likhet med den foregående diett, 8CPT behandling av eksisterende tumorer forårsaket mer enn 43% reduksjon i tumorvekt sammenlignet med PBS infusert dyr (fig. 2D). Analyse av tumorcelleproliferasjon ved farging med Ki67-antistoff viste bare en beskjeden reduksjon følgende 8CPT behandling, hvilket antyder at reduksjonen i celletallet er også på grunn av celletap (fig. S1). Imidlertid er apoptose alene neppe være ansvarlig, ettersom TUNEL-farging ikke viste en signifikant forskjell (data ikke vist). Resultatene tyder på at 8CPT ikke bare fungerer for å hindre tumorvekst, men reduserer også fortsatt vekst av pre-formet svulster.
8CPT hemmer Angiogene Inducere i PC3-cRap1 Cells Under hypoksiske betingelser
For å forstå mekanismen som 8CPT undertrykker VEGF i prostata svulst cRap1 xenografter, utviklet vi celledyrkningsforholdene å etterligne denne effekten. Solid tumorceller ofte vokse under hypoksiske betingelser, og hypoksi fremmer angiogenese. Derfor, analyserte vi VEGF-proteinnivåer i media isolert fra celler forbehandlet over natten med 8CPT i redusert serum og deretter ytterligere behandlet med CoCl
2 til 6 timer for å generere hypoksi-lignende tilstander. I PC3-celler cRap1, redusert 8CPT behandling VEGF-produksjon bare under hypoksiske lignende tilstander (CoCl
2) (fig. 3A). I motsetning til dette var det ingen markert reduksjon i VEGF-produksjon i PC3-celler etter behandling med 8CPT samtidig eksponering av CoCl
2 (fig. 3A). Disse resultatene tyder på at 8CPT-indusert hemming av VEGF uttrykk observert i PC3-cRap1 svulster kan rekapitulert
in vitro
ved å etterligne et hypoksisk miljø.
HIF-1α er en heterodimere transkripsjonsfaktor som oppreguleres på hypoksiske tumorceller og fremmer angiogenese ved å aktivere transkripsjon av pro-angiogene gener som VEGF [30]. For å avgjøre om HIF-1α hemming kan være mellommann for den 8CPT effekt på VEGF nivåer, analyserte vi HIF-1α protein uttrykk i atom ekstrakter fra PC3 og PC3-cRap1 celler behandlet med 8CPT og CoCl
2. Som forventet, ble en signifikant økning i nivået av HIF-1α protein ses både i PC3 og PC3-celler etter cRap1 CoCl
2 behandling. Imidlertid minsket HIF-1α proteinnivåer når PC3-celler, men ikke cRap1 PC3-celler ble forbehandlet med 8CPT (Fig. 3B). I samsvar med dette resultat, ble det observert en signifikant reduksjon i VEGF mRNA kun i PC3-cRap1 celler behandlet med både CoCl
2 og 8CPT (fig. 3C).
8CPT regulerer VEGF produksjon i prostata cellelinjer Behandlede med en fysiologisk aktivator av Rap1
Rap1 aktiveres av en rekke endogene faktorer, deriblant stromal avledet faktor 1α (SDF-1α), et kjemokin som bindes til CXCR4-reseptoren og letter homing av benmarg-avledede celler [ ,,,0],31], [32]. Som vist tidligere [31], behandling av PC3-celler med SDF-1α i 20 minutter markant økt nivå av aktiverte endogen Rap1-GTP (fig. S2). Vi observerte ikke forhøyede nivåer av endogen Rap1-GTP i enten PC3 eller PC3-cRap1 celler etter natten behandling av celler med 8CPT. Disse resultatene indikerer at enten akutt SDF-1α behandling eller konstituerende Rap1 aktivisering, men ikke vedvarende 8CPT behandling fører til forhøyet Rap1 aktivitet i prostata kreftceller.
For å finne ut om Rap1 aktivert i respons til SDF-1α handlinger på samme måte som konstitutivt aktiverte Rap1, undersøkte vi effekten av SDF-1α og 8CPT på utskilt VEGF. SDF-1α indusert VEGF produksjon i PC3-celler sammenlignet med ubehandlede PC3-celler (Fig. 4A), og denne induksjon ble blokkert i PC3-celler som uttrykker Rap1GAP, en Rap1 GTPase som inaktiverer Rap1 (fig. S3). I tillegg er behandling med CoCl
2 indusert ytterligere VEGF produksjon i SDF-1α-stimulerte PC3-celler, i likhet med CoCl
2 behandling av PC3-cRap1-celler (fig. 4A, 4B). Som med PC3-celler cRap1, 8CPT rever induksjon av VEGF-produksjon i SDF-1α-behandlede PC3 celler under hypoksiske betingelser.
Lignende resultater ble også observert i en mindre aggressiv, androgen-avhengig prostata tumorcellelinje, LNCaP, som enten ble behandlet med SDF-1α eller med stabilt uttrykt konstitutivt Rap1 (fig. 4C, 4D). Disse resultater indikerer at regulering av VEGF-produksjon ved 8CPT henhold hypoksiske betingelser ikke er begrenset til en celletype og er observert i respons til fysiologiske samt konstitutiv aktivering av Rap1.
8CPT regulerer VEGF Fremstilling Nedstrøms for Rap1
for å forstå hvilken rolle Rap1 aktivering i reguleringen av VEGF produksjon, tilsvarende studier med 8CPT eller CoCl
2 behandling ble gjennomført i ustimulerte eller SDF-1a-stimulerte PC3 celler som stabilt uttrykker Rap1GAP. Totalt sett er VEGF-nivåene ble redusert som et resultat av Rap1GAP ekspresjon (Fig. S4). Selv om induksjon på grunn av SDF-1α ble fullstendig undertrykket, CoCl
2 fremdeles stimulert VEGF-produksjon, i nærvær av Rap1GAP, i samsvar med HIF-1α stabilisering. Videre natten forbehandling med 8CPT fremdeles redusert CoCl
2-stimulert VEGF-produksjon, i samsvar med vår observasjon at 8CPT virker på oppstrømsiden av HIF-1α for å redusere det uttrykk nivåer (se fig. 3B). Til slutt, 8CPT forbehandling ikke redusere konstitutiv Rap1 aktivitet (Fig. S2), noe som tyder på at det virker på nedstrømssiden av Rap1. Til sammen dataene tyder på at 8CPT hemmer VEGF proteinproduksjon ved å hemme Rap1 eller hypoksisk induksjon av HIF-1α.
8CPT Regulerer VEGF Produksjon via PKA i prostata tumorceller
Selv om 8CPT aktiverer Rap1 via Epac i endotelceller [8], vår foreliggende resultater indikerer at 8CPT antagoniserer aktivert Rap1 funksjon i epitel-prostata tumor celler som tyder på at en forskjellig mekanisme er ansvarlig. I samsvar med denne hypotesen, fant delvis utarming av Epac1 og Epac2 av sirnas ikke ha noen effekt på utskilt VEGF i PC3-cRap1 celler (Fig. S5) selv om vi ikke kan utelukke en rolle for Epac.
8CPT kan aktivere PKA selv om dets affinitet for Epac er 107 ganger større [19], [33]. For å teste denne muligheten, bestemt vi enten 8CPT stimulerer PKA i PC3 og PC3-cRap1 celler ved hjelp av VASP fosforylering som en indikator på PKA aktivering. 8CPT aktivert PKA tilsvarende 6-benzoyl-cAMP (6BzcAMP), en mer selektiv PKA aktivator (fig. S6). Vi undersøkte deretter evnen til to PKA-inhibitorer, H-89 eller PKI, for å reversere inhibering av VEGF-produksjon mediert av 8CPT. Behandling av PC3-cRap1 celler eksponert for CoCl
2 og 8CPT med pKa-inhibitorer delvis reddet inhibering av VEGF-produksjon i PC3-cRap1 celler (Fig 5A;. Fig. S7). Videre 6BzcAMP lignet 8CPT ved inhibering av VEGF-produksjon i PC3-cRap1 celler under hypoksiske betingelser, og denne inhibering ble delvis reversert ved H-89 eller PKI (figur 5B;. Fig. S8). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at 8CPT fungerer som en hemmer av pro-angiogene faktorer i hypoksiske Rap1-stimulert prostata kreftceller via PKA aktivering.
For å teste denne mekanismen i prostatakreft, bestemt vi enten PKA hemming kan reversere svulst vekst og angiogenese hemming mediert av 8CPT
in vivo
. Etter injeksjon av atymiske mus med aktivt prolifererende PC3-celler cRap1 ble dyrene behandlet subkutant med PBS, 8CPT, eller H-89 + 8CPT ved hjelp av osmotiske minipumper. Som observert tidligere i mus injisert med PC3-celler cRap1, svulstene økt i størrelse over tid, men tumorvekst ble signifikant redusert ved behandling med 8CPT (Fig. 6A). Men samtidig behandling med 8CPT og H-89 reverserte tumorvekstinhibitering forårsaket av 8CPT i PC3-cRap1 xenografter. På lignende måte ble den reduksjon i tumorvekt av 8CPT-behandlede dyr 65% reddet ved samtidig behandling med H-89 (fig. 6B). Til slutt, som vist i fig. 6C, immunhistokjemisk analyse av CD31 og VEGF protein uttrykk i seksjoner fra mus infused med PBS, 8CPT, eller H-89 + 8CPT indikerte at PKA hemmer H-89 også reversert reduksjon i CD31 og VEGF immunoreaktivitets formidlet av 8CPT i PC3- cRap1 xenografter. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at PKA hemming kunne reversere tumorvekstinhibitering og angiogenese hemming mediert av 8CPT
in vivo
.
Diskusjoner
Ved hjelp av en kombinasjon av analyser fra både
in vitro Hotell og
in vivo
systemer, gir vår studie tyder på at en roman samspill mellom Rap1, Epac, og PKA regulerer tumor-mikromiljøet induksjon av angiogenese. Vi viste tidligere at vedvarende aktivering av Rap1 ved 8CPT /Epac eller cRap1 inhiberer endotelcelle kjemotaksis og angiogenese [8], [9]. For å teste betydningen av Rap1 aktivering i en prostata svulst xenograft modell, analyserte vi effektene av 8CPT eller cRap1 på PC3 celler. 8CPT hadde ingen effekt på tumorvekst i paren PC3-celler, men betydelig redusert ikke bare tumorstørrelse, men også VEGF og angiogenese hos dyr injisert med PC3 celler som uttrykker cRap1. Overraskende, 8CPT hemmet VEGF induksjon og prostata tumorvekst av en mekanisme som involverer PKA snarere enn Epac /Rap1 aktivering. Våre resultater tyder på at Rap1 aktivering i prostatatumorceller fremmer angiogenese i henhold hypoksiske lignende tilstander via HIF-1α og VEGF, og PKA aktivering motvirker denne induksjon (se skjema vist på fig. 7). I tillegg er våre studier tyder på at endotelceller fortrinnsvis aktivere Epac svar på vedvarende 8CPT behandling mens prostata epitelceller fortrinnsvis aktivere PKA.
Både Rap1 og PKA har vært knyttet tidligere til kreft i prostata epitelceller modell. Androgen-avhengige og-Uavhengig prostatakreftcellelinjer uttrykke endogen Rap1 [31], [34]. Rap1 aktiveres av en rekke vekstfaktorer, inkludert blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), epidermal vekstfaktor (EGF), endotelin, og lysofosfatidisk syre (LPA) gjennom ulike mekanismer inkludert aktivering av cAMP Epac [35]. Behandling av LNCaP, men ikke PC3 prostatakreftceller med forskolin eller cAMP fører Rap1 fosforylering og aktivering av proteinkinase A (PKA) [36], og aktivert Rap1 har vist seg å indusere MAPK-reaksjonsveien ved å stimulere B-Raf [37], [ ,,,0],38]. Men resultatene vi beskriver her tyder på at en annen mekanisme er ansvarlig for de observerte effektene. Først ser vi effektene i både LNCaP og PC3 celler. Videre, i stedet for poten Rap1 aktivitet, PKA virker på en antagonistisk måte for å undertrykke Rap1-indusert VEGF produksjon.
Rap1 har vært implisert i utviklingen av tumordannelse i stor grad gjennom regulering av celle adhesjon og celle-celle kryss. For eksempel, fremmer Rap1 invasjon og metastasering i PC3 cellene via regulering av inte α4β3 og αvβ3 [31]. Derimot, en fersk studie rapporterte at 8CPT hemmer cellemigrasjon i prostata kreft celler via aktivering av Epac [39]. Våre resultater tyder på at denne effekten kan skyldes delvis til PKA aktivering ved 8CPT, en tolkning konsistent med den observerte antagonisme mellom Rap1 og PKA i prostatatumorceller. Våre resultater tyder også på at aktivert Rap1 i prostata kreftceller sensitizes cellene hemming av HIF-1α aktivitet ved PKA.
