Abstract
Bakgrunn
Selv om multimodalitet behandling kan indusere høye frekvensen av remisjon i mange undergrupper av non-Hodgkin lymfom (NHL), betydelige andelen pasienter tilbakefall med uhelbredelig sykdom. Effekten av menneskelig benmarg (BM) mesenchymale stamceller (MSC) på tumorcellevekst er kontroversielt, og ingen spesifikk informasjon om effekten av BM-MSC på NHL.
Metodikk /hovedfunnene
effekten av BM-MSC ble analysert i to
in vivo
modeller av disseminert non-Hodgkins lymfom med en lat (EBV
– Burkitt-type BJAB, median overlevelse = 46 dager) og en aggressiv (EBV
+ B lymfoblastoid SKW6.4, median overlevelse = 27 dager) atferd i nude-SCID mus. Intra-peritoneal (ip) injeksjon av MSC (4 dager etter ip injeksjon av lymfom celler) økte betydelig total overlevelse på et optimalt MSC:lymphoma forholdet 1:10 i begge xenograft modeller (BJAB + MSC, median overlevelse = 58,5 dager; SKW6.4 + MSC, median overlevelse = 40 dager). Ved MSC injeksjon, i.p. tumormasser utviklet seg mer langsomt og i det histopatologiske observasjon, viste en massiv infiltrasjon stromal koplet til utstrakt intra-tumor nekrose. I
in vitro
eksperimenter, fant vi at: i) MSC /lymfom co-kulturer beskjedent påvirket lymfom celle overlevelse og ble preget av økt frigjøring av pro-angiogene cytokiner med hensyn til MSC, eller lymfom, kulturer; ii) MSC indusere migrering av endotelceller i Transwell analyser, men fremmet endotelceller apoptose i direkte MSC /endotelceller co-kulturer.
Konklusjon /Betydning
Våre data viser at BM-MSC viser anti-lymfom aktivitet i to distinkt xenograft SCID-mus modeller av disseminert NHL
Citation. Secchiero P, Zorzet S, Tripodo C, Corallini F, Melloni E, Caruso L, et al. (2010) human benmarg stamceller Vis Anti-Cancer Aktiviteten i SCID-mus med disseminert Non-Hodgkins lymfom xenografter. PLoS ONE 5 (6): e11140. doi: 10,1371 /journal.pone.0011140
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 23 februar 2010; Godkjent: 24 mai 2010; Publisert: 16 juni 2010
Copyright: © 2010 Secchiero et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca contro il Cancro (AIRC) stipend og ved CariFe Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for at multimodalitet behandling, inkludert kjemoterapi, stråling, og målet spesifikke monoklonale antistoffer, slik som rituximab, kan indusere høy grad av remisjon i mange undergrupper av non-Hodgkin lymfom (NHL), betydelige proporsjoner av pasientene tilbakefall med uhelbredelig sykdom. Dermed effektive behandlinger for NHL forbli en alvorlig udekket medisinsk behov, også med tanke på at forekomsten av NHL fortsetter å stige [1]. De mest utbredte formene for NHL er B-celle malignitet, hvorav follikulært lymfom (FL) og diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) utgjør flertallet [2]. Burkitt lymfom er en mindre utbredt form for NHL, karakterisert ved translokasjon av c-myc onkogen til Ig-tungkjede promoter /enhancer region [3]. Akkumulerende bevis har vist at, på samme måte som faste tumorer, er det stromale cellekomponenten i NHL ikke dannes av uskyldige tilskuere i den neoplastiske prosessen, men det er sammensatt av celletyper som kan aktivt påvirke og fremme veksten av de tilstøtende transformerte celler [4 ] – [9]. Men effekten av menneskelig benmarg (BM) mesenchymale stamceller (MSC), som anses de stromal forløper stamceller innenfor BM, på veksten av tumorceller er kontroversielt.
MSC er vanligvis isolert fra heft mononukleære fraksjon av BM aspirates kan spre seg for mange passasjer i kultur og har flere egenskaper som gjør dem til et attraktivt valg som celle terapeutiske midler. Faktisk, de er relativt ikke-immunogene, selv om mekanismen for deres immun rettigheten ikke er godt forstått, og er en gjenstand for intens undersøkelse [10] – [12]. På grunn av disse egenskapene, MSC utviser betydelig terapeutisk potensial i degenerative sykdommer [13], [14]. På den annen side, om deres potensial terapeutisk bruk i neoplastiske sykdommer, har noen studier antydet at adoptiv overført MSC kunne favorisere svulst engraftment og progresjon
in vivo product: [9], [12], [15]. De skadelige virkninger kunne stamme fra forskjellige MSC-karakteristikker. Faktisk MSC spesielt migrere mot steder med aktiv tumorgenese, hvor de kan integrere den spesialiserte tumor nisje, bidra til utvikling av tumor-assosierte fibroblaster og myofibroblasts [16] – [18], stimulere angiogenese [18] – [20], og fremme veksten og medikamentresistens av både faste tumorer og hematologiske maligniteter [18], [21] – [26]
på disse basene, i den foreliggende studie har vi undersøkt effekten av BM-avledet MSC administrering. i to modeller av disseminert NHL, etablert av intra-peritoneal (ip) injeksjon i nude-SCID-mus av EBV
– Burkitt-type BJAB og EBV
+ B lymfoblastoide SKW6.4 cellelinjer, preget av en lat ( BJAB) og en aggressiv (SKW6.4) atferd. I motsetning til vår forventning, fant vi at BM-MSC signifikant forlenget overlevelse av lymfom bærer xenografter.
Resultater
Karakterisering av BJAB og SKW6.4 xenograft modeller
SCID mus var ip injisert med en forhåndsbestemt optimal nummer (2 x 10
6) av lymfom (BJAB eller SKW6.4) celler. BJAB xenotransplantater ble preget av peritoneal tumorer, som begynte å bli håndgripelig og målbar ved ekstern observasjon på 18-20 dager etter injeksjon og jevnt progrediert til mus død (figur 1A). På den annen side, i SKW6.4 xenotransplantater, en tumorcellemassen var knapt følbar når som helst punkt undersøkt. Histopatologisk undersøkelse av peritoneal massene viste at både BJAB- og SKW6.4-avledet svulster har en solid mønster av vekst av CD20
+ lymfoblastoide celler (figur 1A). Variabel formidling av CD20
+ lymfoblastoide celler ble observert i lymfeknuter og milt, mens benmarg og nyrer var vanligvis upåvirket (Figur 1B). Videre har både lymfom-bærende xenografter, særlig SKW6.4 xenotransplantater, ofte utstilt isolert eller massiv infiltrasjon av CD20
+ lymfoblastoid-celler i leveren (figur 1B).
SCID-mus var i.p. injisert med BJAB eller SKW6.4 celler (2 × 10
6). A, ble BJAB men ikke SKW6.4 xenografter preget av peritoneal tumorer målbare ved ytre observasjon. Pilen viser den ytre grensen av tumormassen. I innfellinger, makroskopiske utseende på peritoneal massene og histologiske H er E og CD20 stainings (opprinnelig forstørrelse, 20 ×) vist. B, Histopatologisk undersøkelse av necroptic vevssnitt hentet fra SKW6.4 xenograft viser fraværende (nyre og benmarg), isolert (piler, milt og lever) eller massive (lymfeknute og lever) infiltrasjon av CD20
+ humane lymfoide celler. Original forstørrelse, 20 ×. C, Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av NHL xenograft modeller. Overlevelsesprosentandelen av mus injisert med BJAB (n = 15) eller SKW6.4 (n = 15) celler ble målt fra dagen for lymfomceller injeksjon til dødsdagen. Asterisk,
p
. 0,01
Av notatet, på tross av de større peritoneal massene i BJAB med hensyn til SKW6.4 xenograft mus, median overlevelse av SKW6.4 xenotransplantater var signifikant (p 0,01) kortere (27 dager) sammenlignet med den i BJAB xenotransplantater (47 dager, figur 1C).
Injeksjon av BM-avledede MSC forlenger overlevelse av både BJAB og SKW6.4 betydelig xenografter
for å bestemme effekten av menneskelig BM-MSC på overlevelse av Lymfekreft xenografter, grupper av SCID-mus var ip injisert med enten BJAB eller SKW6.4 celler og, etter 4 dager, med MSC ved en lymphoma:MSC forhold på 10:01. En gruppe av mus ble injisert med MSC alene som kontroll. Xenograft mus behandlet med BJAB + MSC og SKW6.4 + MSC viste en signifikant (p 0,01) økning i overlevelse sammenlignet med den respektive BJAB (figur 2A) eller SKW6.4 (figur 2B) xenografter. Av notatet, øke mengden av injiserte MSC til en lymphoma:MSC forhold på 02:01 ble ikke bedre den totale overlevelsen av BJAB xenografter (figur 2A). Videre, i BJAB xenograft modell, som tillater nøyaktig måling av tumormassen ved utvendig inspeksjon, har vi funnet at forbedring i overlevelse Parallelt med en signifikant (p 0,05) forsinkelse av tumorvekst i mus injisert med BJAB + MSC det gjelder til mus injisert med BJAB alene (Figur 2C).
SCID mus var ip injisert med enten BJAB (n = 10) eller SKW6.4 (n = 10) celler, og etter 4 dager, med MSC ved en lymphoma:MSC forhold på 10:01. Som kontroll, en gruppe mus (n = 10) ble injisert med MSC alene. Kaplan-Meier-analysen av NHL xenograft-modeller, sammenligner overlevelsen av mus injisert med BJAB ± MSC (A) eller SKW6.4 ± MSC (B). I BJAB xenograft mus, resultater oppnådd i en gruppe mus (n = 10) injisert med MSC ved en lymphoma:MSC forhold på 02:01 er også vist (A). Overlevelsen prosenten ble målt fra den dagen av lymfom celle injeksjon til dødsdagen. Asterisk,
p
0,05 i forhold til BJAB eller SKW mus. C, Peritoneal svulster ble målt hver uke, til dyr døden, slik det er beskrevet i materialet og metodene section.Results er midler ± SD. Asterisk,
p
. 0,05
Histopatologisk undersøkelse av tumorvevet fra xenograft SCID mus viste påfallende forskjellige egenskaper mellom peritoneal massene utviklet ved injeksjon med enten lymfom celler eller lymfom celler + MSC. Disse analysene ble hovedsakelig utført på BJAB xenograft modell på grunn av større størrelse av massene, men lignende histopatologiske egenskaper ble observert også i SKW6.4 xenografter. Som vist i figur 3A, BJAB tumorer oppviste et fast mønster av vekst med et lite synlig stromal nettvaren, bekreftes av Masson s Trichrome-farging, og få intra-tumorkarene, som detektert av CD31 immunhistokjemisk farging, et histopatologisk situasjon som minner om den som ble observert i de fleste av human NHL [27]. På den annen side, tumorale masser som er utviklet i mus som samtidig injisert med BJAB og MSC-celler viste et helt annet aspekt, karakterisert ved: områder som inneholder stroma-broer blandet med BJAB celle ark, slik det klart dokumentert av både H . E og Massons trichromic stainings, og immunophenotypical analyser utført med antistoffer anti-CD31 eller anti-αSMA, som angitt. I H E flekker seksjoner, stjernene indikerer liten foci av nekrose i tumormasser (B). I Massons trichromic fargete snitt, er kollagen fibrene farget i blått (pilspisser) og bevis en tynn og usynlig stromal meshwork mellom fast mønster av svulst i A, eller en mer diffus og tykk stromal arkitektur i B. CD31
+ endothelial celler og α-SMA myofibroblast-lignende celler er farget i brunt (piler i A og B). Original forstørrelse 20 ×.
in vitro
co-kultur med MSC marginalt påvirker lymfom celle overlevelse /spredning mens fremmer frigjøring av angiogene cytokiner
For for å fastslå hvorvidt det anti-lymfom-aktivitet hos MSC observert
in vivo
skyldtes en direkte inhibitorisk effekt av MSC på lymfomceller, har vi undersøkt hvorvidt MSC kunne modulere overlevelse /vekst av BJAB og SKW6.4 cellene i en
in vitro
co-kultur system. Celleviabilitet fra BJAB kulturer viste en moderat, men betydelig reduksjon (gjennomsnitt ± SD: 20 ± 6%, p 0,05), koplet til apoptose-induksjon, da BJAB ble ko-dyrket i nærvær av MSC-celler, ved en lymphoma:MSC forhold fra 10:01 (figur 4A). På den annen side, celleviabilitet og apoptose nivåer av SKW6.4 kulturer, var helt upåvirket av nærværet av MSC (figur 4A). I tillegg, for å sammenligne frigjøring av pro-angiogene cytokiner (tabell S1), utførte vi antistoffbaserte protein rekke analyse av kultursupernatanter av: i) SKW6.4 lymfomceller, ii) MSC, iii) SKW6.4 /MSC co-kultivert i direkte kontakt; iv) SKW6.4 /MSC co-dyrket i Transwell plater. Som forventet, MSC produserte signifikante nivåer av flere pro-angiogene cytokiner, hvorav noen (angiogenin, IL-8, CCL2 og VEGF) var signifikant oppregulert ved samtidig tilstedeværelse av SKW6.4 celler (figur 4B). Både direkte og transwell lymfom /MSC co-kulturer var like effektive i å fremme frigjøring av cytokiner. Mengdene av IL-8 og VEGF ble videre målt ved ELISA (figur 4C), og resultatene var i samsvar med de til protein rekke analyse (figur 4B). Som vist på figur 4C, bør det også bli lagt merke til at en signifikant (p 0,05) økning av frigjøringen av IL-8 og VEGF, med hensyn til MSC alene, ble det observert både i MSC /SKW6.4, så vel som i MSC /BJAB ko-kulturer.
BJAB og SKW6.4 celler ble dyrket i fravær eller nærvær av MSC, ved en lymphoma:MSC forhold på 10:01. A, Etter 96 timers dyrkning ble lymfom celleapoptose analysert ved hjelp av dobbelt Annexin V /PI farging. B, Kultursupernatantene ble høstet fra: SKW6.4 lymfom celler alene, MSC alene, SKW6.4 /MSC direkte co-kulturer og SKW6.4 /MSC Transwell co-kulturer. Utgivelsen av pro-angiogene cytokiner ble vurdert i kultursupernatantene ved hjelp av en proteom- profiler menneskelig angiogenese array. Sirklene på membraner markere fire cytokiner (angiogenin, IL-8, 2CCl og VEGF) utgitt av MSC, som er betydelig oppregulert ved samtidig tilstedeværelse av SKW6.4 celler. Lignende resultater ble oppnådd fra tre uavhengige forsøk og resultater fra en av dem er vist. Stolpediagrammet rapporterer resultatene av densitometriske analyser av membraner. Forkortelser av de analyserte cytokiner er definert i tabell S1. Asterisk, p 0,05. C, Nivåer av IL-8 og VEGF ble målt i kultursupernatantene av de angitte kulturer ved hjelp av ELISA. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD av fire uavhengige eksperimenter som hver ble utført i duplikat. Asterisk, p. 0,01
MSC indusere migrering av endotelceller og fremme endotelceller apoptose ved direkte MSC /endotelceller kontakt
Siden MSC frigi en cocktail av potent pro-angiogen faktorer [28] – [30], har vi undersøkt ved evnen til MSC for å drive migrering av endotelceller. Som vist i figur 5A, MSC kulturer som utøves en potent (p 0,01) pro-migrerende aktivitet på endotelceller, som evaluert i Transwell-analyser. Basert på disse observasjonene, i den siste gruppe av eksperimenter har vi undersøkt effekten av en direkte interaksjon mellom MSC og endotelceller. For dette formål ble Subkonfluente HUVEC utsådd i 6-brønners plater, og den følgende dag, MSC ble tilsatt ved en endotelial cell:MSC forhold på 05:01. I et sett av eksperimenter, før tilsetningen av MSC, ble HUVEC lastet med carbocyanine fluorichrome DII [31], tatt i betraktning at DII overføring fra forskjellige celletyper er blitt beskrevet. MSC /HUVEC o-kulturer ble deretter overvåket hver dag ved morfologisk undersøkelse (under et invertert fasekontrast og fluorescens mikroskop) og kvantifisering av den totale fluorescens sammenlignet med kulturer av bare HUVEC (figur 5B). Som forventet, på dag 1, ble fluorescensen begrenset til endotelceller, mens MSC var fullstendig negative. Over tid vi observerte hendelser av fluorescens farging diffus til MSC, noe som indikerer at MSC hadde slått sammen til endotelial cellenettverket (figur 5B). Parallelt på MSC /HUVEC ko-kulturer, dokumentert vi en progressiv kollaps av endotelial cellemonolaget, med forekomsten av døde endotelceller i nærheten av MSC og en betydelig økning av apoptotiske celler, kvantifisert ved Annexin-V /PI dobbel farging ( Figur 5B-C). Dessverre, i disse settene med forsøkene var vi ikke i stand til å utføre tredelt eksperimenter med tillegg også av lymfomceller, for tekniske problemer hovedsakelig på grunn av forskjeller i media krav kultur.
I A, ble HUVEC migrasjon vurdert i Transwell plater mot MSC, utsådd (72 timer før) i det nedre kammer av transwell plater, vs kontroll medium. 10 × forstørrelse bilder av representative fargede filtre er vist; mørkere områdene skyldes høyere celletetthet. Gjennomsnittlig antall trekkende celler per felt ble vurdert ved å telle minst fire kraftige tilfeldige felt per filter. Resultatene er gjennomsnitt ± SD fra tre forsøk hver utført i duplikat. I B og C, ble Subkonfluente HUVEC sådd i fravær eller nærvær av MSC (endotelial cell:MSC forhold på 05:01). Bilder av fluorescens og fasekontrastmikroskopi viser betydelig reduksjon av endotelial celletetthet ved tilsetning av MSC til kulturene. B, Representative bilder som viser røde Dil-merket endotelceller som de vises i HUVEC kulturer (innfelt), og MSC, som erverve flekker etter 4 dager med co-kulturer med merket HUVEC. Original forstørrelse 20 ×. Samlet kultur fluorescens av HUVEC og HUVEC + MSC ble kvantifisert med en fluorescens plateleser. C, er tilstedeværelsen av døde celler i representative bilder av fasekontrastmikroskop indikert med stjerner. Original forstørrelse 20 ×. Total celle apoptose ble evaluert av Annexin V /PI farging. Dataene i B og C er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk, hvert utført i duplikat. Asterisck,
p
. 0,05
Diskusjoner
Forrige
in vivo
studier har evaluert effekten av MSC i dyremodeller av hematologisk maligniteter innesperret i subkutane gel enheter [14], [15], [32]. Tatt i betraktning at de fleste NHL hovedsakelig utvikler seg som en systemisk malignitet, i denne studien har vi utviklet og beskrevet to dyremodeller som tillot oss etterforskningen av aktiviteten til MSC mot NHL i xenografter bærer spres svulster. Faktisk, etter i.p. injeksjon, ondartede BJAB og SKW6.4 lymfom celler dannet tumormasser, med hyppige formidling til leveren og mage lymfeknuter.
Den store funn i studien er at en enkelt MSC injeksjon, ved MSC:tumor celle ratio så lavt som 1:10, signifikant forlenget overlevelse hos dyr med indolent (BJAB) og aggressive (SKW6.4) lymfomer. Denne observasjonen var spesielt oppmuntrende siden den ble innhentet i disseminert NHL bærer xenografter, som etter vår mening er mer relevant enn de subkutane NHL modeller ansatt i tidligere studier [14], [15], [32]. Av notatet, øke antall MSC, opptil MSC:tumor celle forhold på 01:02, ikke resulterte i en betydelig forbedring av den terapeutiske effekten av MSC. Injeksjon av MSC forsinket utviklingen av de peritoneale tumorale masser av NHL xenotransplantater, og ved necroscopic analyse, vevsprøver utviklet i fravær eller nærvær av MSC viste signifikante histologiske forskjeller, som kan rekapitulert som følger: mens BJAB- og /eller SKW6.4-avledede peritoneale masser viste den typiske svak kapillært nettverk beskrives også i human NHL [27], er tilstedeværelsen av MSC fremmet en diffus økning i α-SMA
+ celle innlemmelse i løpet av stromal rommet variansen til snaut SMA
+ perivaskulær mønster hovedsakelig observert i fravær av MSC. Videre massive områder av intra-tumor nekrose ble fortrinnsvis observert i lymfom + MSC injisert dyr og sannsynligvis står for den reduserte tumormasser som karakteriserer disse musene med hensyn til dyr injisert med lymfom celler alene.
I forsøket på å belyse mekanismen (e) der MSC utøve anti-lymfom aktivitet
in vivo
, har vi utført en rekke
in vitro
eksperimenter i co-kultur-systemer. Resultatene avledet fra disse eksperimentene har en tendens til å utelukke en betydelig direkte cytotoksisk effekt av MSC på lymfomceller, fordi MSC moderat hemmet levedyktigheten til BJAB, men viste ikke noen nevneverdig virkning på SKW6.4 celleoverlevelse /vekst. Av interesse, evne til MSC kulturer av utskillende høye nivåer av angiogene cytokiner, for eksempel VEGF, IL-8, angiogenin og CCL2, var signifikant (p 0,01) forsterkes ved samtidig tilstedeværelse av lymfomceller. Konsekvent med sin evne til frigjøring flere pro-angiogene cytokiner, MSC potent fremmet migrasjon av endotelceller i Transwell analyser. Men når MSC var direkte ko-dyrket med endotelceller, vi har observert en signifikant induksjon av endotel celle apoptose. I dette henseende, vår nåværende funn er i overensstemmelse med de av andre forfattere som har demonstrert at MSC under visse omstendigheter kan utøve anti-angiogen aktivitet i høyt vaskulariserte Kaposi sarkom [33], så vel som i normale endoteliale cellekulturer
i vitro product: [34]. Dermed, selv om vi ikke var i stand til å dokumentere relevansen av disse
in vitro
data i våre dyremodeller, våre funn tyder på eksistensen av et komplekst samspill mellom MSC, lymfom celler og endotelceller, preget av: i) en betydelig frigjøring av pro-angiogene /pro-trekkende cytokiner ved MSC, som er forsterket av tilstedeværelsen av lymfom celler; ii) et potent kjemotaktisk aktivitet av MSC på endotelceller, etterfulgt av en cytotoksisk aktivitet av MSC på endotelceller, som krevde at MSC /endotel-cellekontakt.
Vi er også kjent med at ekstrapolering av en gitt dyremodell for å klinisk relevante situasjoner bør vurderes med ekstrem forsiktighet. Spesielt bør vi huske at en viktig begrensning av vår studie er representert ved det faktum at anti-tumorimmunrespons er ikke verdifull i vår SCID-modell, men sannsynlig er det viktig i den totale effekten av MSC på tumorvekst. Faktisk har det vist seg at den immunosuppressive virkning av MSC kan favorisere tumorvekst i dyr allogene [12]. Selv om noen kontroversielle data er til stede på seg rollen som MSC i kreftutvikling og /eller terapi [35], [36], flere nye konklusjoner kan oppsummeres fra vår studie: i)
in vitro
samspillet mellom BM avledede MSC og lymfom celler dårlig spår
in vivo
effekten av MSC på overlevelse av xenograft bærende dyr; ii) MSC betydelig modulere stromal nettverk av lymfomer
in vivo
, ved å øke antallet av α-SMA-positive celler og indusere en økning av intratumor nekrose; iii) MSC fremme endotelceller migrasjon
in vitro
fulgt av endotelceller død på MSC /endothelial direkte celle kontakt.
Materialer og metoder
Cells
SKW6.4 og BJAB-cellelinjer ble erholdt fra DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland) eller kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og dyrket i RPMI-1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco BRL, Gaithersbrg, MD). Human BM-avledet MSC og humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) ble anskaffet fra Lonza (Walkersville, MD). BM-MSC ble rutinemessig dyrket i MSC-vekstmedium (MSC-GM, Lonza). HUVEC ble dyrket i 0,2% gelatin-belagte vevskulturplater i M199 endotelial vekstmedium supplert med 20% FBS, 10 mg /ml heparin, og 50 mg /ml ECGF (alle fra Lonza) som tidligere beskrevet [37]. I alle forsøkene ble MSC og HUVEC brukes mellom 3
rd og 6
th passasje
in vitro.
NHL mus xenograft modeller
Kvinne CB -17 SCID mus (4 uker gammel) ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Hollister, California) og ble opprettholdt i samsvar med guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Mus ble plassert i mikro-isolator bur med fri tilgang til mat og vann. Prosedyrene som involverer dyr og deres omsorg ble gjennomført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care Utvalget ved Universitetet i Trieste (godkjenningsnummer for den italienske Ministry of Health 191 /2008-D). Spesielt ble alle krefter satt for å unngå unødig smerte for dyrene. SKW6.4 eller BJAB (2 x 10
6) celler ble høstet, suspendert i PBS, og i.p. injisert i 6 uker gamle mus. Etter 4 dager ble lymfom xenograft mus randomisert i grupper (i det minste 10 mus i hver gruppe), og dosert i.p. med kjøretøy (PBS) eller MSC (2 × 10
5 eller 1 × 10
6, svarende til en lymphoma:MSC forhold på 10:01 og 02:01 henholdsvis). I en gruppe av SKW6.4 mus (n = 10), ble MSC injisert 12 dager etter injeksjonen SKW6.4.
Dyrene ble overvåket daglig for endringer i vekt, bivirkninger av behandlingen eller tegn på en hvilken som helst sykdom. Tumorvekst ble bestemt ved kaliper-målinger på to ortogonale akser og tumorvolumet ble beregnet ved formelen: (π /6) x
en
2 x
b
, karakterisert ved at
en
er den korteste og
b
er den lengre aksen; tumoren tetthet var antatt å være lik en. Overlevelse ble beregnet som varigheten av dyrets levetid fra inokulering av lymfomceller inntil døden. Obduksjon ble utført for å bestemme makroskopisk utstrekning og histologiske karakteristika for de peritoneale massene. I tillegg store organer, inkludert hjertet, nyrer, femur (for benmarg), lever, milt, ble noder høstet for mikroskopisk undersøkelse og å vurdere mønster av formidling av engraftment.
Histopatologisk og immunophenotypical analyse
Animal prøvene ble fiksert i 10% bufret formalin-løsning og innebygd i parafin. For morfologisk analyse, ble 4-mikrometer tykke seksjoner kuttet fra parafinblokker og farget med hematoksylin-eosin. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av streptavidin-biotin-peroksidasekompleks metode ved hjelp av følgende primære mAb’er for: CD20, α-SMA og CD31 (Dako, Glostrup, Danmark). 3-3’diaminobenzidine ble anvendt som et kromogen (Vector Laboratories, Burlingame, CA). For bestemmelse av kollageninnhold, ble seksjonene farget med Masson s Trichrome. Etter stainings, ble platene undersøkt under et Leica DM2000 optisk mikroskop og microphotographs ble tatt med en Leica DFC320 digitalkamera.
Co-kultur eksperimenter
For lymfom /MSC co-kultur
in vitro
eksperimenter, MSC ble sådd i 6 brønners plater og den påfølgende dagen, enten BJAB eller SKW6.4 celler ble lagt til MSC kulturer ved en lymphoma:MSC forhold på 10:01. Ko-kulturer ble utført i opptil 96 timer, i lymfom cellemedium. I noen eksperimenter, ble ko-kulturer utført ved bruk av 24-Transwell plater (3,0 um porestørrelse, Corning Costar, Cambridge, MA), med MSC sådd ut i det nedre kammeret og lymfomceller er lagt i det øvre kammeret
for endothelial /MSC co-kulturer, ble HUVEC sådd i 6-brønners plater og neste dag, MSC ble lagt på en HUVEC:MSC forhold på 05:01. Ko-kulturer ble utført i opptil 5 dager i HUVEC medium. I noen eksperimenter, før tilsetning av MSC, ble HUVEC lastet med carbocyanine fluorokromkonjugerte DII (1,1’dioctadecyl-3,3,3 «, 3’tetramethylindocarbocyanine perklorat; Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgia). DII er et lipofilt molekyl som inkorporerer i cellemembranen, og har følgende spektral-karakteristika: absorpsjonsmaksimum ved 549 nm og en emisjonsmaksimum ved 565 nm. For dette formål ble HUVEC ble inkubert med 50 ug /ml DII i 2 timer før utførelse MSC: endotelial celle ko-kulturer. Morfologi av HUVEC kulturer og HUVEC /MSC co-kulturer ble observert med jevne mellomrom over tid under en omvendt fase kontrast og fluorescens mikroskop og den totale fluorescens ble kvantifisert med en fluorescens plateleser.
apoptose analysen
for analyse av apoptose ble cellene dobbel farget med Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (Alexis Biochemicals, Lausen, Sveits) og propidiumjodid (PI), i henhold til produsentens instruksjoner, og analysert ved hjelp av en FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson , San Jose, CA), som tidligere beskrevet [38]. For å unngå ikke-spesifikk fluorescens fra døde celler, ble levende celler gated tett ved hjelp fremover og sidespredning. Spesielt for HUVEC og MSC /HUVEC-kulturene, for å analysere graden av apoptose i hele cellepopulasjonen, ble substrat-tilkoblede cellene høstet ved trypsinbehandling og slått sammen med flytelegemer for farging.
Proteome profiler matrise og enzymbundet immunosorbentbestemmelser
Kultursupernatantene ble analysert ved hjelp av proteomet profiler menneskelige angiogenese array (R D Systems). Analysene ble utført i duplikat, og i henhold til produsentens instruksjoner. Resultater ble avlest ved en optisk tetthet på 450 nm ved hjelp av en Anthos 2010 ELISA-leser (Anthos Labtec Instruments, Wals Salzburg, Østerrike).
endotelceller migrasjon analysen
Cell migrasjon analysen ble utført i 24 -godt Transwell plater (8,0 um, porestørrelse) som tidligere beskrevet [39]. MSC ble sådd i HUVEC kulturmedium inn i det nedre kammer av Transwell platene og, etter 72 timer, 0,25 x 10
5 HUVEC per brønn ble tilsatt til de beste kamrene i 100 ul medium.
