Abstract
Vi studerer forbedrende potensialet dimetylthiourea (DMTU), en OH
• radikal trapper og N-acetylcystein (NAC), en glutation forløper /H
2o
2 åtseldyr mot titandioksid nanopartikler (TiO
2-NPS) og multi-vegger karbon nanorør (MWCNTs) indusert CYTO-gentoksisitet i dyrkede humane lungekreft celler-A549. Cytogenotoxicity ble indusert ved å eksponere cellene til utvalgte konsentrasjoner (10 og 50 ug /ml) av hver av TiO
2-NPS eller MWCNTs i 24 timer. Anti-cytogenotoxicity effekter av DMTU og NAC ble undersøkt i to grupper, dvs. behandling på 30 minutter før toksisk fornærmelse (kortvarig eksponering), mens den andre gruppen fikk DMTU og NAC behandling i løpet av nanopartikler eksponering, dvs. 24 t (langtids utsettelse). Undersøkelsene ble gjennomført for celleviabilitet, generering av reaktive oksygenforbindelser (ROS), mikrokjerner (MN), og uttrykk for markører for oksidativt stress (HSP27, CYP2E1), gentoksisitet (P
53) og CYP2E1 avhengig n- nitrosodimethylamine- demetylase (NDMA-d) aktivitet. Generelt, ble behandlingen av både DMTU og NAC funnet å være effektiv i betydelig grad mot TiO
2-NPS og MWCNTs indusert cytogenotoxicity i A549-celler. Langtidsbehandling av DMTU og NAC i løpet av giftige fornærmelser har vist bedre forebygging enn kortsiktig forbehandling. Selv om cellene reagerte sterkt til både DMTU og NAC, men svarene var kjemisk bestemt. I del, ble TiO
2-NPS indusert giftige reaksjoner mediert gjennom OH
• radikaler generasjon og reduksjon i antioksidantforsvaret. Mens i tilfellet av MWCNTs, ugunstige virkninger skyldes hovedsakelig å endre /hemme den enzymatiske antioksidantsystem. Dataene indikerer anvendeligheten av human lunge-kreft-celler-A549 som et pre-screening for å identifisere målet spesifikk profylaktiske og terapeutiske potensial av legemidler kandidatmolekyler mot nanopartikler induserte cellulære skader
relasjon:. Srivastava RK, Rahman Q, Kashyap MP, Lohani M, bukse AB (2011) lindrende Effekter av Dimetylthiourea og N-acetylcystein på Nanopartikler Induced Cyto-Genotoksisitet i human Lung Cancer Celler-A549. PLoS ONE 6 (9): e25767. doi: 10,1371 /journal.pone.0025767
Redaktør: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, USA
mottatt: Mai 10, 2011; Godkjent: 12 september 2011; Publisert: 29.09.2011
Copyright: © 2011 Srivastava, et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble mottatt fra Council of Scientific Industrial Research, New Delhi, (SIP-08). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Intracellulære biologiske interaksjoner av metalloksyd-nanopartikler og karbonnanorør er blitt vist i litteraturen, og som er merket alarmerende til sikkerhets [1], [2]. Titandioksid nanopartikler (TiO
2 -NPs) og multiwalled karbon nanorør (MWCNTs) er kjent for å indusere cytotoksiske og gentoksiske responser både i
in vitro product: [3], [4], [5] og jeg
n vivo
modeller [6], [7]. Generelt ROS generasjon mediert oksidativt stress og nedsatt antioksidant status er blitt foreslått som hovedårsakene til cytotoksisitet og gentoksisitet av nanopartikler [8], [9], [10]. Dessuten, den rekke faktorer, inkludert partikkelstørrelse, kjemisk sammensetning og overflateladninger etc. har også spille rolle for å bestemme graden av nanopartikler toksisitet [11], [12], [13], [14]. Nanopartikler indusere ROS generering ved aktivering av enzymene cytokrom P450s familie [15], [16] og /eller ved å avbryte mitokondrielle elektrontransportkjeden funksjon [9]. Foreningen av ROS generasjon med induserte nivåer av varme sjokk protein 27 (HSP27), cytokrom P450 2E1 (CYP2E1) og P
53 er etablert som markører for kjemisk indusert oksidativt stress, apoptose og gentoksisitet [10], [17] [18].
en av de effektive måter å hindre at ROS mediert cellulær skade er kost eller legemidler styrking av frie radikaler. Derfor, forsøk har vært gjort for å hindre /gjenopprette nanopartikler indusere cytogenotoxicity ved hjelp radikalutvaskere, slik som desferoxamine [8], antioksidanter – resveratrol [19] og N-acetlylcysteine (NAC) [4], [20], [21], i ulike cellesystemer av human og animalsk opprinnelse. Imidlertid, endringer i nivåene av ekspresjon (mRNA og protein) av markører som er involvert i oksidativt stress og genotoksistet i dyrkede celler eksponert for nanopartikler er ikke undersøkt så langt. Dermed ble dagens undersøkelser forsøkte å studere mekanistiske innsikt av TiO
2-NPs og MWCNTs indusert oksidativt stress og CYTO-gentoksisitet i human lungekreft celler A549 og forbedrende effekt av frie radikaler trapper og antioksidanter DMTU og NAC hhv. DMTU, ble valgt i studien, ettersom dette thiogroup inneholdende forbindelsen har god reaktivitet overfor OH
• radikaler på grunn av den ekstremt gunstige elektron-donerende karakteristikker av sulfhydryl-gruppe; således, kjent som potensielle hydroksyl-radikaler [22]. Den andre sammensatte brukt dvs. er NAC en forløper av glutation (GSH), er en viktig cellular antioksidant og kjent for å spille en nøkkelrolle i å beskytte cellene mot oksidativt stress ved å hemme dannelsen av H
2o
2 under in vitro-betingelser [23]. NAC er også kjent å forbedre cellulært GSH nivå ved å rette cystin inn i GSH synteseveien, fordi cystin er en vanlig forløper for både NAC og GSH [24].
Resultater
Karakterisering av nanopartikler
de midlere hydrodynamiske diameter av TiO
2-NPS og MWCNTs suspensjon i fullstendig medium var 417,7 nm og 401,3 nm, og zeta (C,) potensialer ble beregnet som (-) 7,83 mV og (-) 14.4 mV henholdsvis (figur 1 en (I, II) og amp; b (I, II)). TEM studier viser partikkelstørrelsesområdet 5-20 nm i diameter og 300 til 2000 nm i lengde for MWCNTs (data er allerede blitt publisert av oss) [15]. TiO
2-NPS (anatase) ble brukt i studien var av 99,7% renhet og partikkelstørrelsen varierer mellom 5-25 nm i TEM-studier. Partiklene ble klebet på celleoverflaten mellom mikrovilli og pseudopodes, når inkubert i 24 timer, deretter internalisert i små vakuoler i cytoplasma kortikal (figur 2 A og b). Vi observerte ikke noen vesentlig endring i hydrodynamisk partikkel (TiO
2-NPs og MWCNTs) størrelse i nærvær av DMTU og NAC under DLS måling. Etter sterilisering, ble endotoksin ikke påvist i både nanopartikler av LAL-testen. Deteksjonsgrensen var 0,03 EU /ml
Størrelse distribusjon og zeta potensialet TiO
2-NPs (a, I II). Og MWCNTs (b, I II) ble bestemt ved bruk av dynamisk lysspredning og fase analyse lysspredning (PALS) i en Zetasizer Nano-ZS, Model ZEN3600.
TEM microphotographs viser internalisering av TiO
2-NPs (a, b) i menneskelig lungekreft celler-A549. Piler indikerer nanopartikler ble levd på celleoverflaten mellom microvilli og pseudopodes innen få minutter av gangen (a) og deretter internalisert i små vakuoler dypt i cytoplasma, når observert ved 24 h (b).
restaurering av celle levedyktighet
trenden for restaurering i celle levedyktighet var lik for alle tre analysene benyttet i studien. Imidlertid MTT-analysen ble funnet å være mest følsomt i forhold til de andre analysene viz., NRU og frigjort LDH. Resultatene av DMTU eller NAC indusert restaurering i prosent levedyktigheten til A549-celler eksponert for nanopartikler er oppsummert i figur 3 a b. Korttids blitt behandlet (30 minutter) av DMTU viser betydelig beskyttelse i levedyktigheten til A-549-celler utsatt for TiO
2-NPS (10, 50 ug /ml), mens responsen til NAC forbehandling var ikke-signifikante mot TiO
2-NP indusert tap av cellelevedyktighet. Celler mottar lang sikt (24 timer) eksponering av DMTU (10 mM) eller NAC (2 mM) sammen med TiO
2-NPS (10, 50 ug /ml) eksponering har vist seg mer eller mindre samme størrelsesorden og trender som observeres i kortvarig eksponering (Figur 3 a). Moderne dette ble kort eksponering av NAC sikt funnet å være signifikant mer effektiv mot MWCNTs eksponering, mens DMTU ikke var effektive. Langvarig eksponering av både NAC og DMTU har vist lignende trend og effekt mot MWCNTs eksponering, som var i tilfelle kortvarig eksponering (figur 3 b). Generelt er langtidseksponering av DMTU og NAC har vist litt bedre restaurering i celleviabilitet enn kort sikt.
(a) på kort sikt gruppe,-celler ble forbehandlet med enten av DMTU eller NAC i 30 minutter etterfulgt av eksponering av TiO
2-NPS (10 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sikt gruppe ble celler mottar en ko-eksponering (24 h) i DMTU /NAC og TiO
2-NPS (10 50 ug /ml). Cellene ble så analysert for DMTU /NAC mediert restaurering i cellelevedyktigheten reduseres på grunn av TiO
2-NPs eksponering. Alle verdier er gjennomsnitt ± bred singlett. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs TiO
2-NPs eksponering). ## P 0,01 (TiO
2-NPs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). (B) På kort sikt gruppe, cellene ble forbehandlet med enten av DMTU eller NAC i 30 minutter etterfulgt av eksponering av MWCNTs (10 sample- og 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sikt gruppe ble celler mottar en ko-eksponering (24 h) i DMTU /NAC og MWCNTs (10 50 ug /ml). Cellene ble så analysert for DMTU /NAC mediert restaurering i cellelevedyktigheten reduseres på grunn av MWCNTs eksponering. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs MWCNTs eksponering). ## P. 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling)
ROS generasjon
statistisk signifikant (p 0,01) ROS generasjon ble observert i A549 celler som får TiO
2-NPS og MWCNTs (10 50 ug /ml) i 24 timer. Begge kort sikt (30 min) og lang sikt (24 h) behandling av DMTU og NAC ble funnet å være effektiv signifikant (p 0,01) i avtagende ROS-nivåer. Imidlertid er omfanget av reduksjonen av ROS-nivåer var større i langtidsbehandling. Langtidsbehandling av NAC var mer effektiv enn DMTU (Figur 4 a b). Vi har ikke observere noen økning i fluorescensintensitet på grunn av suspenderte nanopartikler i kulturmedium (uten celler). På lignende måte ble ingen fluorescens økning observert med DCFH-DA fargestoff alene i kulturmedium (uten celler). Observasjonene tyder på at endringer i fluorescens intensiteten var på grunn av intracellulær ROS generert i A549 celler bare.
ROS generasjon ble påvist bruker «2, 7-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) fargestoff. (A) På kort sikt gruppe, cellene ble forbehandlet med enten av DMTU eller NAC i 30 minutter etterfulgt av eksponering av TiO
2-NPS (10 sample- og 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sikt gruppe ble celler mottar en ko-eksponering (24 h) i DMTU /NAC og TiO
2-NPS (10 50 ug /ml). Cellene ble så analysert for DMTU /NAC mediert restaurering i nivåene av intracellulær ROS, som ble indusert ved eksponering av TiO
2-NPs. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs TiO
2-NPs eksponering). ## P 0,01 (TiO
2-NPs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). Den positive kontrollgruppen ble bestående av A549 celler forbehandlet (1t) med 500 mikrometer fra H
2o
2. (B) På kort sikt gruppe, cellene ble forbehandlet med enten av DMTU eller NAC i 30 minutter etterfulgt av eksponering av MWCNTs (10 sample- og 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sikt gruppe ble celler mottar en ko-eksponering (24 h) i DMTU /NAC og MWCNTs (10 50 ug /ml). Cellene ble så analysert for DMTU /NAC mediert restaurering i nivåene av intracellulær ROS, som ble indusert ved eksponering av MWCNTs. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs MWCNTs eksponering). ## P 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). Den positive kontrollgruppen ble bestående av A549 celler forbehandlet (1t) med 500 mikrometer fra H
2o
2.
cytokinese blokkert mikronukleus (CBMN-analyse)
Resultatene av MN dannelse i A549 celler er vist i figur 5 a b. Eksponering av både TiO
2 og MWCNTs induserer betydelig antall MN i A549 celler i 24 timer med eksponering. Ved TiO
2-NPs, responsen var doseavhengig dvs. (12,66 ± 0,66 17,33 ± 0,33) ved 10 50 ug /ml, mens den lavere dose av MWCNTs (10 ug /ml) indusert mer MN (16,00 ± 0,57) enn høyere dose (50 ug /ml), dvs. (13,66 ± 0,33). Både DMTU og NAC ble funnet å være effektiv i å redusere Mn signifikant (p 0,01). Responsen DMTU var større mot TiO
2-NPs enn MWCNTs, mens NAC har vist bedre resultater mot MWCNTs. Skjønt, effekten av både DMTU og NAC var statistisk signifikant (p 0,01), men verdiene var enda større enn de ueksponerte kontrollcellene i hele eksponerings konsentrasjoner (Figur 5 A og B). Forskjellen i MN induksjon var ubetydelig mellom passiveringsmidlet behandles Vs ikke-passiveringsmidlet behandlede grupper
(a) Cellene ble utsatt for TiO
2-NPS (10 50 ug /ml). Med eller uten DMTU (10 mM) og NAC (2 mM) i 24 timer. Etyl metansulfonat (6 mM) ble anvendt som en positiv kontroll. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av tre lysbilder. En total 1000 bi-kjernedannet (BN) celler med veldefinert cytoplasma ble scoret. Parallelle settene ble også utført under identiske betingelser ved å utsette cellene bare med en av DMTU eller NAC. Denne gruppen ble brukt til å sammenligne data mellom gatefeier behandlet Vs ikke-åtseldyr behandlede celler. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs TiO
2-NPs eksponering). ## P 0,01 (TiO
2-NPs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). (B) Cellene ble utsatt for MWCNTs (10 50 ug /ml) med eller uten DMTU (10 mM) og NAC (2 mM) i 24 timer. Etyl metansulfonat (6 mM) ble anvendt som en positiv kontroll. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av tre lysbilder. En total 1000 bi-kjernedannet (BN) celler med veldefinert cytoplasma ble scoret. Parallelle settene ble også utført under identiske betingelser ved å utsette cellene bare med en av DMTU eller NAC. Denne gruppen ble brukt til å sammenligne data mellom gatefeier behandlet Vs ikke-åtseldyr behandlede celler. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter
** P. 0,01 (ueksponert kontroll Vs MWCNTs eksponering). ## P. 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling)
Western blot analyse
Generelt eksponering av begge (TiO
2-NPs MWCNTs ) på 50 mikrogram /ml indusere betydelig opp regulering av gentoksiske og oksidativt stress markørproteiner, nemlig P
53 (3,61 ± 0,40 . 3.24 ± 0.26 fold), CYP2E1 (2,62 ± 0,30 2,02 ± 0,39 ganger) , HSP27 (1,69 ± 0,47 2,56 ± 0,34 ganger) hhv. Ekspresjonsnivåene av p
53-protein ble funnet å bli redusert betydelig (p 0,01) etter behandling av både DMTU og NAC. Men responsen var mer intens i A549 celler som får eksponering av TiO
2-NPs. Ved CYP2E1, celler eksponert for MWCNTs vist bedre respons til DMTU og NAC med mer intense effekter av NAC. I motsetning til dette var effekten av DMTU var ikke signifikant i celler eksponert for TiO
2-NPs. Men både DMTU og NAC kunne ikke gjenopprette uttrykk for HSP27 protein betydelig i celler eksponert for TiO
2-NPs /MWCNTs (Figur 6 a b).
a (I) Vurdering av endret uttrykk for proteiner som er involvert i induksjon av oksidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksistet (P
53) på A549-celler utsatt for TiO
2-NPS (50 ug /ml) i 24 timer. GAPDH ble benyttet som intern kontroll for å normalisere dataene. Lane (1) ueksponerte kontroll (2) 50,0 ug /ml TiO
2-NPS (3) 50,0 ug /ml TiO
2-NPS + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml TiO
2-NPS + NAC (2 mM). (II) Relativ kvantifisering (endring) av proteiner som er involvert i induksjon av oksidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksistet (P
53) på A549-celler eksponert for TiO
2-NPs i 24 timer. GAPDH ble benyttet som intern kontroll for å normalisere dataene. Kvantifisering ble gjort i Gel Dokumentasjon System (Alpha Innotech, USA) ved hjelp av AlphaEase
TM FC Stående v.4.0 programvare. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs TiO
2-NPs eksponering). ## P 0,01 (TiO
2-NPs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). b (I) Vurdering av endrede uttrykk for proteiner som er involvert i induksjon av oksidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og gentoksisitet (P
53) på A549-celler eksponert for MWCNTs (50 ug /ml) i 24 timer. GAPDH ble benyttet som intern kontroll for å normalisere dataene. Lane (1) ueksponerte kontroll (2) 50,0 ug /ml MWCNTs (3) 50,0 ug /ml MWCNTs + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml MWCNTs + NAC (2 mM). (III) Relativ kvantifisering (endring) av proteiner som er involvert i induksjon av oksidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksistet (P
53) på A549-celler utsatt for MWCNTs i 24 timer. GAPDH ble benyttet som intern kontroll for å normalisere dataene. Kvantifisering ble gjort i Gel Dokumentasjon System (Alpha Innotech, USA) ved hjelp av AlphaEase
TM FC Stående v.4.0 programvare. Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs MWCNTs eksponering). ## P 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling)
CYP2E1 avhengig n- nitrosodimethylamine-demetylase (NDMA-d) aktivitet
Data av CYP2E1 avhengig katalytisk aktivitet. er presentert i figur 7. Den katalytiske aktivitet viser lignende tendenser som observert i western blot-analyse for protein ekspresjon for CYP2E1 i celler eksponert for TiO
2-NPS og MWCNTs (50 ug /ml). Disse endringene var signifikant (p 0,001) sammenlignet med ikke-eksponerte kontrollgruppe, så vel som til celler behandlet med DMTU /NAC dvs. henholdsvis bare 7,54 + 0,86 og 10,96 + 1,20 nmol /mg protein. Skjønt, både renovasjons vise betydelig restaurering i enzymaktivitet i cellene eksponert for TiO2-NPs og MWCNTs, men omfanget o effektiviteten var mer i tilfelle av NAC behandling. Behandling av DMTU eller NAC alene ikke viser noen virkning på den enzymatiske aktiviteten sammenlignet med ikke-eksponerte kontrollgruppen. Etanol (10 mM), viser en kjent induser av CYP2E1 meget signifikant (p 0,001). Øke NDMA-D-aktivitet (figur 7)
Alle verdier er gjennomsnitt ± S.E. av 3 eksperimenter.
** P 0,01 (ueksponert kontroll Vs TiO
2 -NPs /MWCNTs eksponering). ## P 0,01 (TiO
2-NPs /MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). Spesifikk aktivitet uttrykkes i nmol HCHO /min /mg protein. Etanol (100 mm), en kjent induktor av CYP2E1, ble brukt som positiv kontroll.
Diskusjoner
reaktive oksygenforbindelser (ROS) mediert oksidativ stress har blitt foreslått en blant de viktigste hendelser utløser nanopartikler indusert CYTO-gentoksisitet [25]. Vi har også observert en doseavhengig ROS produksjon i A549 celler enten utsatt for TiO
2-NPs eller MWCNTs på 10 50 ug /ml i 24 timer. Den viktigste ROS i redoks-signalering er antatt å være H
2o
2 /OH
• radikal. Således, for å bekrefte den ROS redoks-signalering, ble cellene eksponert for H
2o
2 (500 pM) i 1 time under identiske betingelser, som ble fungerte som positiv kontroll for. H
2o
2 induserte lignende svar for ROS produksjon som i tilfelle av nanopartikler, noe som tyder på innblanding av lignende signaltransduksjonsveiene. Reduksjonen av ROS med forhånds /co-behandling av DMTU og NAC i A549-celler, noe som ytterligere bekrefter involvering av ROS i prosessen med toksisitet og er i overensstemmelse med tidligere studier [4], [8]. NAC, en forløper for glutation (GSH), er en viktig cellular antioksidant og spiller en viktig rolle i å beskytte cellene mot oksidativt stress og hemmer dannelsen av H
2o
2
in vitro product: [ ,,,0],23], [26]. NAC behandling fører til forbedring av cellulær GSH nivå ved å dirigere cystin i den GSH synteseveien, fordi cystin er en vanlig forløper for både NAC og GSH [24]. Mens den store reaktiviteten til molekylet DMTU mot OH
• er på grunn av de svært gunstige elektron-donerende egenskapene til sulfhydrylgruppen [22].
I den foreliggende undersøkelse, cytotoksisiteten av TiO
2-NPs og MWCNTs ble funnet å være doseavhengig og tid. Ved TiO
2-NPs behandling med DMTU og NAC reduserer cytotoksiske effekt, noe som tyder på at både OH
• radikaler (ROS) generasjon og reduksjon i antioksidantforsvaret system er ansvarlig for redusert levedyktighet. Mens i tilfelle MWCNTs cytotoksisitet ble betydelig redusert ved NAC behandling. Det er bemerkelsesverdig at DMTU, en mer spesifikk hydroksyl radikaler, ikke var effektive i spyle hydroksylradikaler i våre målinger. Dette forenkler det MWCNTs forårsaker toksisitet ved å forandre /hampaering den enzymatiske antioxidant-systemet, og ikke ved direkte å fremkalle OH
• radikaler i A549-celler. Resultatene tyder på at den fraksjon av ROS som hemmes av NAC, men ikke ved DMTU, kan være en annen art av frie radikaler og også forskjellen i virkemåten av begge (TiO
2 og MWCNTs) kan være på grunn av deres forskjell i overflatestruktur [27], lengde [28], og nærvær av metallkatalysator [29] etc. Vi har også rapportert tidligere at MWCNTs betydelig redusert glutationnivåer i dose- og tidsavhengig måte [15]. Det er blitt hevdet at tapet av GSH kan kompromittere cellulære antioksidantforsvaret og føre til induksjon av ROS [30].
Videre NAC behandling gitt tilstrekkelig sterk antioksidant forsvar, noe som resulterer i økt celleviabilitet av celler eksponert for TiO
2 og MWCNTs. Ligner slags effekt ble observert med human lunge epithelial og luftveis epitel (HEp-2) cellelinje, ved samtidig behandling med antioksidant NAC og Resverartrol mot henholdsvis ZnO og CuO nanopartikler [19], [21].
både type nanopartikler (TiO
2 og MWCNTs) er kjent for å indusere Mikrokjerner (MN) på doseavhengig måte, som er godt definert biomarkør for tester ved analyse [31]. Våre funn av MN induksjon er godt i samsvar med tidligere studier ved hjelp av nano-TiO
2 i lymfoblastoide celler [32], og i rottelunge epitelceller utsatt for MWCNTs [33]. Den beskyttende effekt av DMTU (10 mM) og NAC (2 mM) på MN induksjon kunne observeres tydelig i de foreliggende undersøkelser (Figur 5 A og B). Våre MN studier ytterligere styrke rollen til oksidativt stress i gentoksisitet indusert av TiO
2-NPs og MWCNTs i A549 celler. I de foregående undersøkelse crocidoloite og chrysotile asbest fiber har også blitt rapportert å indusere MN, som i betydelig grad redusere etter behandling med NAL, et syntetisk salt av N-acetylcystein (0,2 mm) og DMTU (20 mm) i humane mesothelial celler [34].
i dagens undersøkelser, ble western blot analyse gjort for å vurdere endret uttrykk av proteiner som HSP27 og CYP2E1, indikatorer på oksidativt stress, og P
53 som en biomarkør for gentoksisitet. Varmesjokkproteiner (HSP) omfatter flere forskjellige familier av proteiner som blir indusert i respons til mange forskjellige fysiologiske og miljømessige fornærmelser. Et slikt protein er HSP27, som induseres sterkt under stressbetingelser. HSP27 er kjent for å interferere med ROS-induserte sentrale deler av apoptotiske signalveien, og er korrelert med økt overlevelse i respons til cytotoksiske stimuli [18]. Vårt studium viser at ved 50 pg /ml konsentrasjon, både nanopartiklene (TiO
2-NPS og MWCNTs) induserte signifikant ekspresjon av HSP27, noe som tyder på at cellene var under stress. Behandlingen av DMTU og NAC viste ikke signifikante endringer i nanopartiklene indusert uttrykk for HSP27. Det indikerer at enten cellene er fremdeles under spenningsbetingelser eller DMTU og NAC reduserer oksidativt stress ved en annen rute under våre eksperimentelle betingelser. Ytterligere eksperimenter med forskjellige utvalg av tidspunkter, eksponeringskonsentrasjoner, etc. blir gjennomført for å utforske betydningen av forhøyede nivåer av HSP27 i nærvær av DMTU og NAC i celler eksponert for disse nanopartiklene.
oppregulering i protein uttrykk av CYP2E1 er korrelert med indusert dannelse av ROS, heving av lipidperoksidasjon og cytotoksiske skader i alkohol indusert hepatotoxcity [35], [36]. Vi rapporterer TiO
2-NPs og MWCNTs indusert induksjon i CYP2E1 bestemt NDMA-d katalytisk aktivitet og betydelig restaurering av to scavenges-DMTU og NAC i human lungekreft celler-A549. Til kunnskap, er nanopartikler indusert protein uttrykk og aktivitet av CYP2E1 og påfølgende induserte nivåer av ROS blir presentert for første gang i menneskehetens lungekreft celler A549. Induserte nivåer av CYP2E1 protein uttrykk og NDMA-d aktivitet i dagens undersøkelser støtter også våre tidligere funn i de samme cellene som MWCNTs induserer ROS generasjon av ulike oksidative aktivitet snarere enn mitokondrie avbrudd [15]. Etter eksponering av TiO
2-NPS og MWCNTs, ble det observert indusert ekspresjon og aktivitet av CYP2E1, som kan korreleres med ROS induksjon og oksidativt stress. Som våre data av ROS generasjon målt ved DCFH-DA er godt underbyggende med CYP2E1 induksjon. Den lignende type korrelasjon mellom ROS produksjon og CYP2E1 etter eksponering av Monocrotophos, et organofosfat plantevernmidler, i PC12-celler har også blitt rapportert nylig [37]. Vi fikk en betydelig reduksjon i nivåene av MWCNTs induserte oksidativt stress og CYP2E1 (ekspresjon og aktivitet) i nærvær av DMTU og NAC, som bekrefter rollen til CYP2E1 i MWCNTs induserte toksiske responser. Mens i tilfelle av TiO
2-NPS, bare NAC ble funnet effektive i å redusere ekspresjon og aktivitet av CYP2E1. Det indikerer at TiO
2-NPs utøves av oksidativt stress hovedsakelig av H
2o
2 produksjons heller OH-radikaler. Som DMTU er kjent for å absorbere den OH
• radikaler som dannes ved omdannelse av O
2
– i nærvær av jern ved en modifisert Haber-Weiss reaksjon [38]. Lignende effekter ble også rapportert i nærvær av diallyl-sulfid (en annen tiol gruppe inneholdende forbindelse) i etanol mediert uttrykk for CYP2E1 i polariserte leverceller WIF-B [39].
I dagens undersøkelser, nivåene av protein uttrykk for P
53 var godt samsvarende med data innhentet for mikronuklei (MN) induksjon. P
53 er en av de viktige utløsende molekylære markører for vurdering genotoksisitetstesten i tilfelle av oksidativt stress-indusert DNA-skade [10]. Cellular skade ved ROS er positivt knyttet til P
53 aktivering, og indusert uttrykk for P
53 protein har blitt foreslått som et verktøy for å oppdage oksidativt stress indusert CYTO-gentoksisitet [10]. Således er de forhøyede nivåer av P
53 protein er en indikasjon på TiO
2-NPS og MWCNTs induserte oksidativt stress mediert genotoksistet. Behandling av DMTU og NAC ble funnet å være effektiv i betydelig grad for å bringe ned de forhøyede nivåer av p
53-protein i TiO
2 og MWCNTs eksponerte celler. Denne effekten kan være korrelert med den sterke anti-oksidanter og anti-ROS aktivitet av DMTU og NAC observert i de foreliggende undersøkelser så vel som i andre studier [34]. På lignende funn ved Mroz et al. [40] har også vist at NAC blokkert partikler drevet p-ser15-p
53 respons i A549 celler.
I konklusjonen, presentere undersøkelser avslører at TiO
2-NPS (10, 50 mikrogram /ml) og MWCNTs (10, 50 ug /ml) eksponering i 24 timer induserer markører for oksidativt stress og cytomegalovirus-genotoksistet i A549-celler. TiO
2-NPS induserte toksiske responser ble formidlet primært gjennom H
2o
2 generasjon, og reduksjon i antioksidantforsvar. Mens, i tilfelle MWCNTs, skadevirkninger skyldes hovedsakelig endring /hindrer den enzymatiske antioksidantsystem. DMTU og NAC ble funnet å være effektive vesentlig i å redusere nivåene av oksidativt stress og gentoksisitet markører studert unntatt HSP27.
Materialer og metoder
Alle de spesifiserte kjemikalier og reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Chemical Company Pvt. Ltd St. Louis, Missouri, USA, med mindre annet er oppgitt. Alle kjemikalier og reagenser som ble brukt var av høyeste renhet tilgjengelig
Nanopartikler forberedelse
TiO
2-NPs (d. 25 nm, spesifikk overflate 200-220 m
2 /g, 99,7% rent spormetallbasis, firkantet i krystallografiske system, sfærisk form) uten noe belegg ble innkjøpt fra Sigma Aldrich, USA, (Cat nr. 637 254), mens MWCNTs brukt i denne studien ble generøst Gitt av Dieter g . Weiss, professor ved Institutt for biologi, Institutt for cellebiologi og Biosystems Technology, Rostock University, Tyskland. Sterilisering av nanopartikler ble utført ved oppvarming ved 120 ° C i 2 timer og deretter suspendert i fullstendig DMEM-F12-medium. Stamløsninger (1 mg /ml) av nanopartikler ble ultralydbehandlet for å sikre en jevn suspensjon før den ble fortynnet med dyrkningsmedium som brukes for eksponering av celler [15], [41]. Før du bruker i forsøkene, både nanopartikler ble analysert for forekomst av bakterielle endotoksiner ved hjelp av Limulus amebocyttlysat (LAL) test.
Karakterisering av nanopartikler
Transmission elektronmikroskopi.
Den ultra-strukturell karakterisering inkludert tekstur, størrelse og internalisering ble gjort av Ludwig Jonas, professor ved Avdeling for patologi, Electron Mikroskopisk Center, Det medisinske fakultet, Universitetet i Rostock, Tyskland. I korte trekk, ble TiO
2-NPs og MWCNTs suspendert i destillert vann og falt på karbon film belagt kobber nett for transmisjonselektronmikroskopi. Diameteren på TiO
2-NPs og lengde /diameter MWCNTs ble målt ved hjelp av TEM Libra 120 (Carl Zeiss Oberkochen, Tyskland) utstyrt med morfometrisk analyse programvare (SAK OSIS Münster Tyskland). Parallelle sett av cellene ble utsatt for TiO
2-NPS og MWCNTs i 24 timer ved 37 ° C, fiksert i glutaraldehyd (4% i PBS) og behandlet for å studere fagocytose og pinocytose ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Bilder ble tatt ved forskjellige forstørrelser av 2K ProScan kameraet ved hjelp av programvare element (OSIS Münster, Tyskland).
Dynamisk lysspredning.
Størrelse distribusjon og zeta potensialet TiO
2-NPs og MWCNTs, alene eller i nærvær av DMTU og NAC, ble bestemt ved hjelp av dynamisk lysspredning og fase analyse lysspredning (PALS) i en Zetasizer Nano-ZS, Model ZEN3600 utstyrt med 4.0mW, 633nm laser (Malvern Instruments Ltd. , UK) som beskrevet tidligere av oss [15]
Cell kultur
menneske~~POS=TRUNC -. A549 (ATCC CCL-185TM) som brukes i studien ble opprinnelig anskaffet fra Nasjonalt senter
