Abstract
patogenesen av bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) er fortsatt dårlig forstått. S100 kalsiumbindende protein A6 (S100A6) har blitt forbundet med PDAC; Men effekten av S100A6 på PDAC migrasjon og invasjon ennå ikke er utforsket. I denne studien ble Panc-1 celler transfektert med et plasmid å indusere overekspresjon av S100A6 og β-catenin ble slått ned ved hjelp av en bestemt kort hårnål RNA (shRNA). Den sårhelende og Transwell analyser vist at S100A6 fremmet PDAC celle migrasjon og invasjon. Videre β-catenin shRNA hemmet migrasjon og invasjon av PDAC celler. Vi har bekreftet at S100A6 induserer PDAC cellemigrering og invasjon via aktivering av β-catenin in vitro. Vurdering av mRNA og proteinnivåer avslørte at S100A6 induserer økt uttrykk av β-catenin, N-cadherin og vimentin, og redusert uttrykk av E-cadherin i PDAC celler. β-catenin shRNA også endret uttrykk av epitel-mesenchymale overgang (EMT) -relaterte markører i PDAC celler. Nærmere bestemt ekspresjon av E-cadherin ble øket, mens ekspresjon av N-cadherin og vimentin ble redusert. Til slutt, demonstrerte vi at S100A6 endrer ekspresjonen av EMT-relaterte markører via β-catenin aktivering. I konklusjonen, induserer S100A6 EMT og fremmer celle migrasjon og invasjon i et β-catenin avhengig måte. S100A6 kan derfor representere en roman potensiell terapeutisk mål for behandling av bukspyttkjertelkreft
Citation. Chen X, Liu X, Lang H, Zhang S, Luo Y, Zhang J (2015) S100 Kalsium-Binding Protein A6 fremmer epitelial-Mesenchymale Transition gjennom β-catenin i kreft i bukspyttkjertelen cellelinje. PLoS ONE 10 (3): e0121319. doi: 10,1371 /journal.pone.0121319
Academic Redaktør: Yue Wang, Nasjonalt institutt for Viral Disease Control and Prevention, CDC, Kina, KINA
mottatt: 10 desember 2014; Godkjent: 30 januar 2015; Publisert: 23 mars 2015
Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den grunnleggende og samarbeid Foundation klinisk av Capital Medical University No.13JL77 (Kina). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er et alvorlig globalt helseproblem. Det er den fjerde vanligste årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, med en 5-års total relativ overlevelsesrate på 6% [1]. I Kina, Median overlevelse av PDAC pasienter er 7,8 måneder, med 30,0% av pasienter som gjennomgår kurativ hensikt operasjoner, og bare 9,8% av pasientene som fikk omfattende behandling [2]. Til tross for fremskritt i behandlingen, forblir PDAC ekstremt motstandsdyktig mot tilgjengelige strålebehandling og kjemoterapi-regimer [3]. En bidragsyter til dårlig prognose er begrenset forståelse av patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen. Det er derfor et presserende behov for å belyse de molekylære mekanismer som er knyttet til forekomst, utvikling og metastasering av denne dødelig sykdom.
S100A6 tilhører familien S100, ekspresjon av disse er koblet til tumorgenese og metastase [4] . Logsdon et al. [5] brukes mikromatriser å profilere PDAC genekspresjon, identifisere totalt 158 bukspyttkjertelkreft relaterte gener, inkludert S100A6. Vår gruppe har tidligere utførte immunohistokjemisk analyse av S100A6 ekspresjon i pankreatiske vev, noe som bekrefter at S100A6 ekspresjon er forhøyet i PDAC prøver, i forhold til normalt vev [6]. Ohuchida et al. [7] viser at ekspresjon av S100A6 er primært begrenset til kjernen av kreft i bukspyttkjertelen celler, og høye atom S100A6 proteinekspresjon nivåer er assosiert med en dårlig prognose. Rollen til S100A6 i forhold til tumordannelse og metastase er imidlertid dårlig forstått. Noen studier har vist at S100A6 er involvert i reguleringen av Wnt /β-catenin signalveien [8], noe som fører til degradering av β-catenin.
Wnt /β-catenin signal påvirkninger celle skjebne, spredning, polaritet, og celledød under embryonal utvikling, samt vev homeostase hos voksne [9]. Avvikende regulering av denne veien er derfor knyttet til en rekke sykdommer, inkludert kreft, fibrose og neurodegenerering [10]. Wnt veien er sammensatt av wnt ligand protein og celleoverflate-reseptor, i tillegg til cytoplasmiske komponenter og en spesifikk atom transkripsjonen kompleks [11]. Når wnt ligand-proteinet binder seg til frizzled, en celleoverflate-reseptor, er wnt veien aktivert. Cytoplasmatiske β-catenin deretter inn i cellekjernen hvor det modulerer transkripsjon og dermed påvirke celledeling og tumormetastase. I denne prosessen, er β-catenin nøkkelen effektor-molekylet [12]. En rekke cellulære proteiner, inkludert wnt, kan påvirke β-catenin produksjon og akkumulering i cytoplasma. RNA sekvensering av bukspyttkjertelen sirkulerende tumorceller impliserer Wnt og β-catenin i metastase [13].
Det er et vell av forskning om attributtene av sirkulerende tumorceller som er knyttet til den epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) [ ,,,0],14,15]. EMT refererer til transdifferensiering av epitelceller i mesenchymale celler under visse fysiologiske og patologiske tilstander, ledsaget av cellemorfologi og genekspresjon endringer [16]. EMT forekommer i en rekke forskjellige prosesser, slik som embryoutvikling, sårheling, noen kroniske sykdommer, og tidlig stadium tumor-metastase. Nedregulering av E-cadherin, en epitelial markør, er et kjennetegn på EMT. Tapet av E-cadherin er ledsaget av oppregulering av mesenchymale markører, slik som N-cadherin og vimentin. EMT er nødvendig for de fleste av tumormetastaser, inkludert PDAC [17]. Wnt /β-catenin veien er en av de viktigste signalveier involvert i EMT induksjon.
I denne rapporten undersøkte vi funksjonen og tilhørende mekanismen av S100A6 i forhold til EMT induksjon, ved å vurdere sin innflytelse på Panc-en celle migrasjon og invasjon.
Materialer og metoder
cellelinje
den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinje, Panc-1, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (USA). Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen, USA), 1% penicillin og streptomycin (Invitrogen, USA) ved 37 ° C med 5% CO
2.
plasmider og RNA interferens
den komplementære DNA for mennesker S100A6 og negativ kontroll DNA ble satt inn i en GV146 plasmid vektor kjøpt fra Genechem (Shanghai, Kina). En shRNA sekvens målrettet mot β-catenin (5′-ATCACTGAGCCTGCCATCTGTGCTCTTCG-3 «) og en negativ kontroll-sekvens ble syntetisert og ligert inn i pRFP-C-RS-vektor (Origene Technologies, USA). Plasmidene ble amplifisert i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensanalyse etter kloning viste 100% homologi til publiserte sekvenser.
Transient Transfeksjon og Opprettelse av stabile cellelinjer
S100A6 overekspresjon plasmid og kontroll plasmid ble transfektert inn i Panc-1 celler ved hjelp opti- MEM redusert serum medium (Invitrogen, USA) og Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA), i henhold til produsentens instruksjoner.
β-catenin shRNA og kontroll shRNA ble transfektert inn i Panc-1 celler som nevnt ovenfor. Etter transient transfeksjon ble Panc-1 celler valgt ved anvendelse av 1,0 ug /ml puromycin, og holdes i vekstmedium supplementert med 1,0 ug /ml puromycin. Klonale populasjoner av celler ble isolert ved å overføre enkelt klumper av cellene i individuelle brønner i en seks-brønns plate. Cellene ble deretter holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
Deretter S100A6 overekspresjon og kontroll plasmider ble transfektert inn i β-catenin knockdown stabile cellelinjer, som nevnt ovenfor.
sårhelende Assay
Celler ble sådd ut i seks-brønns plater og transfektert med S100A6 overekspresjon eller kontroll-plasmid, og β-catenin shRNA eller kontroll shRNA. Etter 36 timer ble fullstendig medium erstattet med FBS-fri DMEM, og etter ytterligere 6 timer ble cellemonolagene såret med en 200-mL sterile plastspiss. Kulturene ble deretter holdt i FBS-fri DMEM, og viklet områder ble observert og fotografert ved å bruke et invertert mikroskop på 0, 24 og 48 timer etter såret. Den viklet bredde ble målt ved hjelp av Image J programvare. Sårheling hastigheten ble vurdert som følger:
Transwell analysen
Transwell kamre (Corning, USA) med en 8-mikrometer pore ble brukt for å vurdere migrasjon i 24-brønners plater. Etter transfeksjon, en 200-mL volum av celler, ved en tetthet på 1 x 10
5 /ml i FBS-fri DMEM, ble podet inn i de øvre kamrene. De nedre kamre ble fylt med DMEM inneholdende 10% FBS som et stimulerende faktor. Kamrene ble inkubert i en fuktet vevskulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO
2 atmosfære i 8 timer. Cellene ble deretter fiksert med 95% etanol i 20 min, farget med krystallfiolett i 30 min, og telt ved bruk av et mikroskop med en 40 x objektiv.
For å vurdere celle invasjon, BioCoat Matrigel (BD Biosciences) (300 mg /ml, 100 mL per kammer) ble påført de øvre innleggskamrene 5 timer før du følger fremgangsmåten for migrasjon analysen beskrevet ovenfor.
Kvantitativ real-time PCR
Total RNA fra Panc -1-celler ble isolert ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, USA). Totalt RNA ble anvendt som en mal for å syntetisere cDNA, i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, USA). Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), med en reaksjonsblanding bestående av 5-pl 2 x SYBR grønn Master Mix, 1-pl templat, 0,4-ul forover primer, 0.4- mL revers primer og 3,2-mL RNA-fritt vann. Syklusbetingelsene var 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Genuttrykk nivåer var normalisert i forhold til at av GAPDH. Alle reaksjoner ble utført in triplo. Relative mRNA nivåer ble presentert som to
-ΔΔCt [18]. Primere som brukes er beskrevet i tabell 1.
Western blotting
Etter transfeksjon, ble cellene høstet ved hjelp av RIPA lysebuffer (Solarbio, Beijing, Kina) supplert med PMSF proteasehemmer (Solarbio , Beijing, Kina). Proteinkonsentrasjonene av prøvene ble bestemt ved hjelp av et protein kvantifisering kit (keygen Biotech, Nanjing, Kina). Prøver (40-100 ug) ble deretter utsatt for 10% SDS-PAGE og overført til en membran polyvinylidendifluorid (PVDF). Membraner ble blokkert i 2 timer i 5% fettfri tørrmelk. Membraner ble inkubert med spesifikke antistoffer ved 4 ° C over natten. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt i denne studien: anti-β-catenin (Cell Signaling Technology 8480, USA), anti-E cadherin (Abcam ab1416, USA), anti-N cadherin (Abcam ab19348, USA), anti-vimentin ( Abcam ab8069, USA) og anti-β-aktin (Cell Signaling Technology 8457, USA). Membranene ble deretter inkubert med de tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer (Odyssey). Western blot ble kvantifisert ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging. Protein ekspresjonsnivåer ble normalisert i forhold til den for β-aktin.
Statistical Analysis
Alle forsøk ble utført i triplikat og gjentatt uavhengig er minst tre ganger. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (standardavvik). Elevens
t
-test ble brukt for statistisk analyse. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 17.0 statistisk programpakke og tallene ble generert ved hjelp av GraphPad Prism 5-programvaren. For alle tester, p 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Resultater
S100A6 fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon in vitro
For å vurdere om S100A6 fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon, Panc-1 -celler ble transfektert med et plasmid S100A6 overekspresjon eller et kontroll-plasmidet. Real-time RT-PCR ble brukt til å verifisere at S100A6 overekspresjon plasmid økte mRNA nivåer av S100A6 i Panc-1 celler. Vi har oppdaget at en betydelig økning i nivået av S100A6 mRNA i S100A6-overekspresjon-celler, sammenlignet med kontrollceller (p 0,001) (. S1 Fig). Neste, vi utforsket effekten av S100A6 uttrykk på celle invasjon in vitro. En sårhelende analyse viste en signifikant økning i sårlegende hastighet i S100A6-overekspresjon-celler, sammenlignet med kontrollceller, ved 24 og 48 timer (p = 0,006 og p 0,001, respektivt) (Fig. 1A og 1B). En transwell-analysen viste også øket migrering og invasjon i S100A6 overekspresjon celler (p = 0,04 for migrering analysen, p = 0,006 for invasjonen assay) (fig. 1C og 1D). Disse dataene tyder på at S100A6 fremmer invasjon av PDAC celler.
(A) sårhelende analysen, celler som overuttrykker S100A6 (til venstre), kontrollceller (til høyre). (B) Den sårhelende var betraktelig høyere i S100A6 overekspresjon celler, sammenlignet med kontrollgruppen celler, på 24 og 48 timer. (C) Transwell-analyse, «I» representerer S100A6 overekspresjon i migrerings assay; «II» betegner kontrollgruppen i migrasjon assay; «III» representerer S100A6 overekspresjon i invasjonen analysen; «IV» representerer kontrollgruppen i invasjonen analysen. (D) Representative statistisk diagram for transwell analysen, som viser en betydelig økning i migreringen (I) og invasjon (II) ved S100A6 overekspresjon celler, i forhold til kontrollceller. * P 0,05; ** P 0.01.
S100A6 endrer uttrykk for β-catenin og EMT-relaterte markører i PDAC celler
Når du skal undersøke mulige nedstrøms mediatorer av S100A6 ansvarlige for markedsføringen av PDAC celle migrasjon og invasjon vi bemerket at overekspresjon av S100A6 resulterte i en signifikant økning i β-catenin mRNA-nivåer i Panc-1 celler (p = 0,006) (fig. 2A). Gitt at EMT spiller en viktig rolle i invasjonen-metastaseprosessen, fortsatte vi å undersøke uttrykk for EMT-relaterte markører. Ekspresjonen av det epiteliale markør E-cadherin ble redusert på mRNA-nivå, mens ekspresjon av de mesenchymale markører N-cadherin og vimentin ble økt (p 0,001, p = 0,002 og p 0,001, respektivt) (fig. 2B). Vi har også undersøkt proteinnivåer β-catenin og EMT markører ved hjelp av Western blotting, og bekreftet at overekspresjon av S100A6 øket ekspresjonen av β-catenin (p = 0,024) (Fig. 2C og 2D), redusert at av E-cadherin og økt ekspresjon av N-cadherin og vimentin (p = 0,009, p = 0,026, p = 0,044, respektivt) (fig. 2E og 2F). Sammen tyder disse resultater på at S100A6 løfter β-catenin nivåer og endrer ekspresjonen av EMT-relaterte markører i PDAC cellene.
(A) Overekspresjon av S100A6 resulterte i en betydelig økning i nivået av β-catenin mRNA i Panc-1 celler. (B) Real-time PCR viste at S100A6 overekspresjon resulterte i redusert uttrykk av E-cadherin og økt uttrykk av N-cadherin og vimentin. (C) Western blotting viste at S100A6 oppregulert β-catenin på proteinnivået. (D) Representative statistisk diagram som viser økt β-catenin proteinnivåer, sammenlignet med kontrollen. (E) Western blotting viste at S100A6 overekspresjon resultert i endrede ekspresjon av EMT-relaterte markører. Spesielt ble protein ekspresjon av E-cadherin redusert, mens ekspresjon av N-cadherin og vimentin ble økt. (F) De relative proteinnivåer av E-cadherin, N-cadherin og vimentin signifikant forskjellig mellom S100A6-overekspresjon tilstand og kontroll. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
β-catenin shRNA endret migrasjon og invasjon av PDAC celler in vitro
For å utforske effekten av β-catenin om migrasjon og invasjon av PDAC celler, brukte vi β- catenin shRNA å generere en stabil β-catenin knockdown Panc-en cellelinje. PANC-1-celler transfektert med ikke-target-shRNA ble anvendt som en kontroll. Knockdown av β-catenin ble bekreftet av real-time PCR og Western blotting (p 0,001 og p = 0,001, henholdsvis) (. S2 fig). En sårhelende assay og transwell-analyse ble utført for å vurdere effekten av β-catenin på migrering og invasjon. Den sårhelende assay viste at knockdown av β-catenin inhiberte signifikant migrering av PDAC celler sammenlignet med kontrollen tilstand ved både 24 og 48 timer (p = 0,013 og p = 0,002, respektivt) (Fig. 3A og 3B). Transwell Analysen viste redusert migrering og invasjon i β-catenin knockdown-celler, sammenlignet med kontrollgruppen (p = 0,009 for migrering analysen, p = 0,015 for invasjonen analyse) (Fig. 3C og 3D). Disse data indikerer at inhibering av β-catenin reduserer migrering og invasjon av PDAC celler in vitro.
(A) sårhelende analyse viste en signifikant reduksjon på migrasjon i β-catenin shRNA gruppe (til venstre) , i forhold til kontrollgruppen (til høyre). (B) Den sårhelende hastigheten var signifikant lavere i S100A6-uttrykkende celler, sammenlignet med kontrollen, ved 24 og 48 timer. (C) Et transwell-analysen viste at β-catenin shRNA dramatisk redusert antall trekkende og invaderende celler (x 40). «Jeg» representerer β-catenin shRNA i migrasjon analysen; «II» betegner kontrollgruppen i migrasjon assay; «III» representerer β-catenin shRNA i invasjonen analysen; «IV» representerer kontrollgruppen i invasjonen analysen. (D) Representative statistisk diagram for transwell analysen, som viser en signifikant reduksjon i migrasjon (I) og invasjon (II) i den β-catenin shRNA gruppe, sammenlignet med kontrollgruppen. * P 0,05; ** P 0.01.
β-catenin shRNA endrer uttrykk for EMT-relaterte markører i PDAC celler in vitro
For å vurdere om β-catenin er involvert i EMT, vurderte vi uttrykket av EMT-relaterte markører på mRNA og proteinnivåer i β-catenin-knockdown Panc-1 celler. Knockdown av β-catenin resulterte i økte verdier av E-cadherin mRNA, og reduserte nivåer av N-cadherin og vimentin mRNA (p = 0,002, p 0,001 og p 0,001, henholdsvis) (Fig. 4A). Western blotting resultater vedrørende protein ekspresjon var i samsvar med den sanntids RT-PCR-data. Spesielt ble protein ekspresjon av E-cadherin økt, mens ekspresjon av N-cadherin og vimentin ble redusert (p = 0,004, p = 0,007 og p = 0,017, respektivt), i β-catenin-knockdown Panc-1-celler (Fig . 4B og 4C). Disse data tyder på at den β-catenin ekspresjonsnivå korrelerer med ekspresjon av EMT-relaterte markører i PDAC cellene.
(A) β-catenin shRNA resulterte i en betydelig økning i nivåene av E-cadherin mRNA og en betydelig reduksjon i nivåene av N-cadherin og vimentin mRNA. (B) Western blotting viste at β-catenin shRNA resulterte i oppregulert protein ekspresjon av E-cadherin og downregulated protein ekspresjon av N-cadherin og vimentin. (C) Et proteinnivåer av E-cadherin, N-cadherin og vimentin var signifikant forskjellig mellom de β-catenin shRNA-gruppen og kontrollgruppen. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
S100A6 fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon via β-catenin aktivering in vitro
For å undersøke om S100A6 fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon via regulering av β-catenin, vi transfektert stabil β-catenin-knockdown Panc-1 celler med S100A6 overekspresjon plasmid. Vi vurderte β-catenin uttrykk med real-time RT-PCR og Western blot analyser. Det var ingen signifikante forskjeller i mRNA og proteinnivåer mellom de to gruppene (p = 0,354 og p = 0,765, respektivt) (S3 fig.). Disse resultatene tyder på at β-catenin var faktisk stabilt slått ned, og at dens uttrykk ble ikke påvirket av S100A6 overekspresjon. Deretter utførte vi sårhelende og Transwell analyser for å vurdere migrasjon og invasjon av disse cellene. Den sårhelende assay viste at migreringen var ikke signifikant forskjellig mellom de to gruppene, etter 24 eller 48 timer (p = 0,983 og p = 0,875, respektivt) (Fig. 5A og 5B). Resultatene av transwell analysen var i overensstemmelse med den sårhelende assay, med ingen signifikant forskjell mellom gruppene for enten migrasjon eller invasjon (p = 0,803 for migrering analysen, p = 0,659 for invasjonen analyse) (Fig. 5C og 5D ). Disse dataene indikerer at S100A6 har ingen effekt på migrasjon og invasjon i stabile β-catenin-knockdown PDAC celler. Dette tyder på at S100A6 fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon via β-catenin aktivering in vitro.
(A) sårhelende analysen viste ingen endring i migrasjon av β-catenin-shRNA celler som overuttrykker S100A6 (til venstre) sammenlignet med den β-catenin-shRNA kontrollgruppen (til høyre). (B) Det var ingen signifikant forskjell i den sårhelende hastighet mellom de to gruppene. (C) Det var ingen signifikant forskjell i transwellanalyseresultater mellom de to gruppene, både med hensyn til migrering og invasjon (x 40). «Jeg» representerer β-catenin-shRNA + S100A6 overekspresjon i migrasjon analysen; «II» representerer β-catenin-shRNA + S100A6-kontroll i migrasjon analysen; «III» representerer β-catenin-shRNA + S100A6 overekspresjon i invasjonen analysen; «IV» representerer β-catenin-shRNA + S100A6-kontroll i invasjonen analysen. (D) Representant statistisk Kart for transwell analysen viser ingen signifikant forskjell i migrasjon (I) eller invasjon (II) analyser mellom de to gruppene.
S100A6 fremmer EMT gjennom aktivering av β-catenin
for å undersøke potensialet mekanistiske forholdet mellom S100A6 og β-catenin i forhold til EMT i kreft i bukspyttkjertelen, transfektert vi stabile β-catenin-knockdown Panc-1 celler med en S100A6 overekspresjon plasmid eller en kontroll plasmid, og evalueres ekspresjonen av EMT-relaterte markører. Sanntids RT-PCR viste ingen signifikante forskjeller i mRNA-nivåene av E-cadherin, N-cadherin og vimentin mellom de to gruppene (p = 0,227, p = 0,228 og p = 0,067, respektivt) (fig. 6A). Vi bekreftet at protein nivåer av E-cadherin, N-cadherin og vimentin heller ikke forskjellig mellom de to gruppene (p = 0,267, p = 0,638 og p = 0,940, henholdsvis) (Fig. 6B og 6C). Disse resultatene tyder på at S100A6 ikke har noen effekt på EMT-relaterte markører i stabile β-catenin-knockdown PDAC celler, noe som indikerer at S100A6 endrer ekspresjonen av EMT-relaterte markører via aktivering av β-catenin.
(A) det var ingen signifikante forskjeller i uttrykket av EMT-relaterte markører mellom β-catenin-shRNA celler som overuttrykker S100A6 og β-catenin-shRNA kontrollceller. (B) Western blotting viste tilsvarende forandringer i ekspresjonen av EMT-relaterte markører i de to gruppene. (C) Ingen signifikante forskjeller ble sett mellom de to gruppene med hensyn til uttrykk av E-cadherin, N-cadherin og vimentin protein.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at S100A6 overekspresjon fremmer, og β-catenin shRNA hemmer, PDAC celle migrasjon og invasjon. Vi fastslått at S100A6 fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon via β-catenin aktivering in vitro. Vi bekreftet også at S100A6 uttrykk korrelerer med at av β-catenin og at uttrykket av EMT-relaterte markører i PDAC celler modifiseres av både S100A6 overekspresjon og β-catenin knockdown.
S100A6 er rapportert å være oppregulert i en rekke kreftformer, inkludert lunge-, kolorektal-, hud, mage, bukspyttkjertel ductal adenokarsinom og andre epiteliale cancere [19]. Det er rapportert at økt ekspresjon av S100A6 kan fremme celleproliferasjon og migrasjon på human leverkreft [20]. Videre kan serumnivåene S100A6 tjene som en potensiell prognostisk biomarkør i magekreft, og inhibering av S100A6 reduserer metastatisk potensial av magekreftceller [21]. I bukspyttkjertelen carcinogenesis, har immunhistokjemi analyser blitt anvendt for å demonstrere at Panins 1a celler ikke uttrykker S100A6, og at andelen av positivt fargede celler øker proporsjonalt med den Panins karakter, med S100A6 mRNA-nivåer øker også på en trinnvis måte [22,23] .
et bredt spekter av eksperimentelle modeller antyder en viktig rolle for β-catenin i bukspyttkjertelkreft metastaser [24]. Nowotny et al. [25,26] antydet at S100A6 kan ha en effekt på calcyclin-bindende protein (CacyBP) /Siah-1 samspill protein (SIP) og suppressor av G2 allel av Skp1 (Sgt1). CacyBP /SIP ble identifisert som en S100A6-bindende protein som er involvert i ubiquitinering og degradering av β-catenin [27]. Sekvensen av Sgt1 deler 20% identitet med det av CacyBP /SIP. Videre ble Sgt1 og CacyBP /SIP funnet å binde Skp1 og aktivere Skp1p-Cullin-F-box protein (SCF) ubiquitin ligase. Dette ligase er beskrevet i pattedyrceller som et kompleks som regulerer ubiquitinering og nedbrytning av fosforylert β-catenin [28]. En annen studie [29] bekreftet at CacyBP /SIP ikke blir oppdaget i normale bukspyttkjertelen vev, men er oppdaget i bukspyttkjertelkreft. Vi spekulerer derfor at S100A6 påvirker nedbrytningen av β-catenin via Cacy BP /SIP og Sgt1 i PDAC. I denne studien S100A6 indusert β-catenin ekspresjon både på mRNA og proteinnivå. Videre både en sårhelende analyse og en transwell analysen vist at S100A6 overekspresjon fremmer PDAC celle migrasjon og invasjon.
I mange modeller, inkludert melke epiteliale og carcinoma cellelinjer, Wnt /β-catenin veien er tenkt å indusere EMT. β-catenin er vanligvis bundet til E-cadherin, noe som er viktig for celle-celle-forbindelser og cadherin cytoskjelettet. I tillegg kan β-catenin transport inn i kjernen fremme ekspresjonen av EMT relaterte gener [30]. Noen studier [31-34] har bekreftet at visse faktorer kan kontrollere epitel plastisitet og endre metastase gjennom β-catenin avhengig regulering i PDAC, tykktarmskreft, leverkreft og brystkreft. Vår studie viste også at β-catenin knockdown kan indusere oppregulering av E-cadherin og nedregulering av N-cadherin og vimentin.
En fersk studie rapporterte at S100A4, et medlem av S100 familie, kan være en viktig faktor i å fremme EMT prosessen i PDAC [35]. I denne studien utforsket vi forholdet mellom S100A6, β-catenin, EMT og PDAC celle invasjon. Vi bekreftet at S100A6 kan indusere EMT i et β-catenin avhengig måte, ved å vise at S100A6 kan fremme celle migrasjon og invasjon gjennom β-catenin in vitro. Den eksakte rolle S100 familien og relaterte proteiner med hensyn til kreft i bukspyttkjertelen er en viktig sak som fortjener videre studier.
Konklusjon
S100A6 kan indusere EMT og fremme celle migrasjon og invasjon i en β -catenin-avhengig måte. S100A6 kan derfor representere en roman potensiell terapeutisk mål for PDAC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Transfeksjon med S100A6 overekspresjon resulterte i en betydelig økning i S100A6 mRNA nivå
*** p 0.001
doi:. 10,1371 /journal.pone.0121319.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. β-catenin ble vellykket slått ned i PDAC celler. product: (A) Sanntid RT-PCR avslørte en betydelig reduksjon i den β-catenin mRNA-nivå i β-catenin shRNA Panc-1 celler. (B) Western blotting viste en signifikant reduksjon i β-catenin protein i β-catenin shRNA gruppe, i forhold til kontrollen. (C) Nivået av β-catenin proteinet var signifikant forskjellig mellom de to gruppene. ** P 0,01; *** P 0.001
doi:. 10,1371 /journal.pone.0121319.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. β-catenin uttrykk ble ikke oppregulert ved S100A6 i β-catenin-knockdown stabile celler.
(A) Det var ingen signifikante forskjeller i β-catenin mRNA nivåer mellom stabile β-catenin-knockdown celler som overuttrykker S100A6 og stabil p-catenin knockdown celler som uttrykker kontroll plasmidet. (B) Western blotting viste tilsvarende endringer i β-catenin mellom de to gruppene. (C) Det var ingen signifikante forskjeller mellom β-catenin proteinnivåer mellom de to gruppene.
Engelsk i dette dokumentet er blitt kontrollert av minst to profesjonelle redaktører, både engelsk som morsmål. For et sertifikat, kan du see:https://www.textcheck.com/certificate/GZTsUk
doi:10.1371/journal.pone.0121319.s003
(TIF)
