Abstract
Niemann-Picks Type C2 (NPC2) spiller en viktig rolle i reguleringen av intracellulær kolesterol homeostase via direkte binding med gratis kolesterol. Men lite er kjent om betydningen av NPC2 i kreft. I denne studien har vi pekt på effekten av ulike kreftformer på NPC2 uttrykk. En rekke anti-NPC2 monoklonale antistoffer (mAbs) med IgG2a-isotypen ble samlet og peptid screening viste at det reaktive epitopen var aminosyrerester 31-40 i den menneskelige NPC2 protein. Spesifisiteten av disse mAbs ble bekreftet ved Western blotting ved hjelp shRNA mediert knock-down av NPC2 i menneskelige SK-Hep1 celler. Ved immunhistokjemisk farging, er NPC2 uttrykt i normal nyre, lever, bryst, tykktarm, lunge, øsofageal, livmorhals, bukspyttkjertel og mage vev. Sterk uttrykk for NPC2 ble funnet i den distale og proksimale nyretubuli av nyre og hepatocytter i leveren. Normal esophageal, livmorhals, bukspyttkjertel, mage, bryst, tykktarm og lungevev farget moderat til svake. Når sammenlignet med deres normale vevsekvivalenter, ble NPC2 overekspresjon observert i kreft i bryst, tykktarm og lunge. Angående til brystkreft, NPC2 oppregulering er assosiert med østrogenreseptoren (-), progesteron reseptor (-) og human epidermal vekstfaktor-reseptor (+). På den annen side ble NPC2 funnet å bli nedregulert i nyrecellekarsinom, levercirrhose og hepatomceller vev. Ved antigen-fangst enzym immunoassay ELISA er serum NPC2 økt hos pasienter med skrumplever og leverkreft. Ifølge vestlige blot data er endringen av glykosylert mønster av NPC2 i serum i forbindelse med skrumplever og leverkreft. Så langt vi kjenner til, er dette den første omfattende immunhistokjemiske og serologisk studie som undersøkte uttrykk for NPC2 i en rekke forskjellige kreft hos mennesker. Disse nye monoklonale antistoffer bør bidra med å belyse rollene NPC2 i svulstutvikling, spesielt i lever og bryst kreft
Citation. Liao YJ, Lin MW, Yen CH, Lin YT, Wang CK, Huang SF, et al. (2013) Karakterisering av Niemann-Picks Type C2 Protein Expression i flere kreft ved hjelp av en roman NPC2 monoklonalt antistoff. PLoS ONE 8 (10): e77586. doi: 10,1371 /journal.pone.0077586
Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan
mottatt: May 30, 2013; Godkjent: 04.09.2013; Publisert: 17 oktober 2013
Copyright: © 2013 Liao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av et stipend fra National Science Council of republikken Kina (gi NSC100-2325-B-010-008 og NSC102-2320-B-038-003) og Taipei Medical University (gi TMU101-AE1-B29). TLCN har blitt støttet med tilskudd fra National Science Council siden 2005 (NSC 100-2325-B- 182-006) og National Health Research Institutes, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Niemann-Picks type C2 (NPC2) protein er en lite oppløselig glykoprotein som inneholder en nitten aminosyrer signal peptid. Proteinet ble først karakterisert som en viktig sekretorisk protein i humane epididymis [1]. NPC2 spiller en viktig rolle i reguleringen av intracellulær kolesterol homeostase ved direkte binding med fritt kolesterol [2]. En mangel på NPC2 resulterer i akkumulering av fri kolesterol i lysosomet [3]. Analyse av NPC2 mRNA ved Northern blotting har avdekket et enkelt transkript på 0,9 kb i alle undersøkte vev, med det høyeste mRNA-nivåer i testikkel, nyre og lever [4]. Den modne, humane NPC2-protein består av 132 aminosyrer og er uttrykt som forskjellige isoformer; disse varierer i størrelse fra 19 til 23 kD i en vev-spesifikk måte [5,6]. Nylig viste vi at NPC2 opptrer koordinert med glycin N-metyltransferase å regulere lever kolesterol homeostase og fatty leversykdom progresjon [7]. Videre er NPC2 viktig for papiller dannelse og modulerer papillære vekst [8]. NPC2 kommer også til uttrykk i alveolar epithelial type II celler fra lungene [9]. Siden NPC2 negativt regulerer ERK1 /2 mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) fosforylering i fibroblastceller [10], kan en forstyrrelse i NPC2 uttrykk være forbundet med viktige menneskelige sykdommer, inkludert kreft. Imidlertid har de uttrykk for NPC2 i humane kreftformer ikke blitt undersøkt i detalj. Derfor vår forskning mål var (a) for å utvikle et panel av monoklonale antistoffer (mAbs) rettet mot NPC2 protein og (b) for å karakterisere deres egenskaper og mulige kliniske anvendelser. Ved bruk av immunhistokjemisk farging ble sterke nivåer av ekspresjon av NPC2 funnet i den distale og proksimale nyretubuli av nyre og i hepatocyttene i leveren. Ekspresjon av NPC2 ble funnet å være oppregulert på humane bryst, tykktarm og lunge cancer, mens i motsetning til dette var det nedregulering av ekspresjon NPC2 i nyre og leverkreft. Til slutt har vi videre vist at oppregulering av NPC2 er korrelert med status av østrogenreseptor (ER), progesteronreseptoren (PR) og human epidermal vekstfaktor-reseptor (HER-2) ekspresjon. I tillegg er feilregulering av sera NPC2 forbundet med levercirrhose og leverkreft (HCC).
Materialer og metoder
Generering av monoklonale antistoffer mot NPC2
For å generere en serie av mAbs mot NPC2, renset GST-NPC2 eller renset His-NPC2 (figur 1A) rekombinant protein (RP) ble blandet med Freunds fullstendige adjuvans (for den første immunisering) eller ufullstendig Freunds adjuvant (for booster-injeksjoner) (Sigma Co., St. Louis, Mo., USA) og den resulterende blandingen ble anvendt som et immunogen. His-NPC2 RP ble anvendt som en screening-antigen for antistoff oppsto ved GST-NPC2 RP. Mus mAbs ble fremstilt ved hjelp av hybridomet teknikk [11]. De hybridomer ble fordelt i seks 96-brønners plater og dyrket i et valgt medium [12]. Kultursupernatantene ble screenet ved anvendelse av en enzym immunoassay med GST-NPC2 RP og His-NPC2 RP som antigenene. Hybridomceller som har en høy optisk tetthet ved enzym-immunoassay ble bekreftet ved Western blot-analyse umiddelbart. Hver brønn av celler som produserte et positivt resultat ble sub-klonet inn i en 96-brønns plate med en celletetthet på 0,5 celle per brønn. Resulterende enkle kloner med et positivt resultat ble deretter inokulert i en dose på 2 x 10
6 inn i en BALB /c-mus som var blitt primet med 0,5 ml av ufullstendig adjuvant (Sigma) tidligere. Monoklonalt antistoff ble renset fra mus asketiske væske ved hjelp av protein G pluss protein A Agrose (Calbiochem, San Diego, CA, USA) og deretter konsentrert ved Vivaspin 20 (GE Healthcare). Isotypen av hver mAb ble bestemt ved anvendelse av monoklonalt antistoff fra mus Isotyping reagenser (Sigma).
(A) Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for GST-NPC2 og His-NPC2. (B) Bakterie NPC2 fusjonsproteinene ble uttrykt i BL21-celler og deretter indusert ved anvendelse av 1 mM IPTG. SDS-PAGE og Coomassie-blått-farging ble anvendt for å vise molekylvektene til de to proteinene var tilnærmet 43,3 kD for GST-NPC2 og 17 kD for His-NPC2. (C) Western blot analyse ved hjelp av mAbs (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7D, 1-5B og 1-2g) mot GST-NPC2 og Hans-NPC2 . (D) Western blot analyse ved hjelp av mAbs mot muse bitestikkelen.
Cells og plasmider
SK-Hep1 celler, kjøpt fra ATCC, ble dyrket i DMEM (Gibco BRL, Grand Island , NY) med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (HyClone, Logan, UT, USA), penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml), ikke-essensielle aminosyrer (0,1 mM), og L-glutamin (2 mM) i en fuktig inkubator med 5% CO
2. Plasmid DNA ble transfektert hjelp TurboFect ™ Reagent (Fermentas, Hanover, MD, USA). Primersekvensene og restriksjonsenzymer som anvendes for full-lengde og forskjellige lengder av humane NPC2 gener har blitt tidligere descried av Liao, et al [7]. Plasmid koding shRNA for NPC2 (TRCN0000029323) ble hentet fra National RNAi Kjerne Facility (Academia Sinica, Taiwan).
humane prøver
HCC vev lysbilder (n = 50) og sera (n = 165) ble hentet fra Taiwan leverkreft Network (TLCN) og Taipei City Hospital. De kliniske funksjoner av disse pasientene er vist i tabell S1 og Tabell S2. Sunn kontroll og pasienter med kronisk hepatitt infeksjon, fettlever, skrumplever og HCC hadde blitt rekruttert mellom 2008 og 2010 fra Institutt for International Medicine, Taipei City Hospital, Ran-Ai Branch, Taipei, Taiwan og TLCN. Totalt 33 invasiv brystkreft pasienter ble identifisert i Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital. Vi behandlet alle vevsprøver under samme forhold. Den etiske komiteen av Institutional Review Board of National Yang Ming University (IRB nr 1000041) og Taipei City Hospital Institutional Review Board (IRB No. TCHIRB980509) godkjent de kliniske undersøkelser, og alle fag ga skriftlig informert samtykke. Diagnostisering av HCC ble bekreftet ved histologisk undersøkelse. Brystet (BR721), kolon (CO803), lunge (LC1006), nyre (KD991), flere kreft (BCN721), flere sykdommer i leveren (LV1201) og levercirrhose og hepatitt (LV805) vev arrays ble kjøpt fra Biomaks, USA . Klinisk og patologisk informasjon om de enkelte kreftprøver er tilgjengelige, og ble hentet fra tabellen produsenten.
Peptide screening, Western blotting og immunhistokjemisk (IHC) farging
En ELISA-plate belagt med peptider ble brukt å kartlegge epitoper av en rekke anti-NPC2 mAbs. Disse peptidene (hver med en lengde på 10 A.A.) dekket hele lengden av 1-40 A.A. region av NPC2 proteinet. For Western blotting, ble mobilnettet eller mus bitestikkel proteiner separert med SDS-PAGE. fosfo-ERK1 /2 og ERK1 /2; fosfor-p38 og p38; fosfor-JNK og JNK ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Immunoblotting signaler ble normalisert ved hjelp av α-tubulin eller β-actin og kvantifisert ved densitometrisk scanning. IHC påvisning av NPC2 protein ble utført ved anvendelse av NPC2 monoklonalt Ab (3-6B) ved en fortynning på 1: 200 [7]. Parafininnstøpte vevssnitt ble inkubert med den primære antistoff og oppdaget ved hjelp av Universal LSAB
TM2 kit (DakoCytomation) i henhold til produsentens instruksjoner.
Antigen-capture enzymimmunoassay ELISA
I korthet 100 ul polyklonalt NPC2 antistoff (5 pg /ml) i 0,1 M karbonatbuffer (pH 9,6) ble tilsatt til hver brønn i en 96-brønners mikrotiterplate (Corning Costar, Acton, MA) og inkubert ved 4 ° C over natten. Deretter, blokkering med 5% BSA i PBST (PBS-buffer inneholdende 0,05% Tween) ved 37 ° C i 2 timer. Hver pasients serum (100 ul ved en 1: 1-fortynning) ble tilsatt til 96 brønners-plater og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Etter tre omfattende vaskinger med PBST, monoklonalt NPC2 antistoff (1: 1000 fortynning) ble tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av inkubering med 200 ul substrat (0,015% o-fenylendiamindihydroklorid) (Sigma-Aldrich) til en annen 30 min ved 37 ° C. Reaksjoner ble stoppet ved tilsetning av 3N HCl; absorbans ble målt med et spektrofotometer ved 490 nm.
glykosidase Fordøyelse
Seksti mikrogram lever proteiner fra humant serum ble inkubert med eller uten N-glykosidase F (PNGase F) i henhold til produsentens anvisninger (NE Biolabs, Beverly, MA). Reaksjonsproduktene ble utsatt for western blot analyse.
Statistiske analyser
Chi-square egnethets, nonparametric Wilcoxon Signed Ranks test eller Mann-Whitney U-test ble brukt for å vurdere sammenhengen mellom NPC2 uttrykk og kliniske sykdommer. En
p
verdien av ≦ 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Produksjon og karakterisering av mAbs mot NPC2
For å utvikle NPC2 mAbs som vil oppdage NPC2 uttrykk i ulike cellelinjer og vev, vi først klonet en full NPC2 fragment og uttrykte GST-NPC2 og Hans-NPC2 fusjonsproteiner i en bakteriell system (figur 1A). Som vist i figur 1B, GST-NPC2 og Hans-NPC2 rekombinante proteiner, med størrelser på 43,3 og 17 kD, henholdsvis først i den IPTG-induserte bakterielle lysater. Det rensede GST-NPC2 og Hans-NPC2 rekombinante proteiner ble anvendt som antigenet i løpet av genereringen av mAbs mot NPC2. I alt ble åtte mAbs (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7B, 1-5B og 1-2g) til slutt generert og funnet å reagere med GST-NPC2 og Hans-NPC2 rekombinante proteiner (figur 1C). Siden NPC2 er en stor sekretorisk protein uttrykt i epididymal fluid [1], søkte vi vår NPC2 mAb’er til å detektere NPC2 ekspresjon i mus epididymis ved hjelp av Western blotting. Som vist i figur 1D, ble NPC2 detektert i totale ekstrakter bitestikkel som proteinbånd på omtrent 16 til 22 kD. Isotypebestemmelse identifisert alle mAb’er som tilhører IgG2a isotype og deres lette kjeder ble identifisert som κ kjeder.
For å kartlegge den reaktive regionen anerkjent av NPC2 mAbs, transfektert vi et eget sett med plasmider som uttrykker forskjellige lengder av NPC2 -Ha (inkludert full-lengde NPC2 [1-151 aa], domene A og B [1-80 aa], domene B og C [40-105 aa], og domene C og D [81-151 aa]) for 24 timer. Som vist i figur 2A, kan alle åtte NPC2 mAb’er gjenkjenne full lengde og den N-terminale halvdel (1-80 A.A.) av pNPC2-HA. Mens, fragmenter som inneholder 41-105 A.A. region av NPC2 og den C-terminale halvdel (81-151 A.A.) av NPC2 reagerte ikke med den NPC2 mAbs. Disse funnene antyder at alle de NPC2 mAb’er gjenkjenne aminosyrene 1-40 av NPC2 protein. For ytterligere å kartlegge de reaktive epitoper som gjenkjennes av mAb NPC2, ble en ELISA utført ved bruk av et peptid panel bestående av fire peptider som dekker aminosyrene 1-40 av NPC2 protein. Våre resultater tyder på at bare ett peptid (aminosyrer 31-40) ble anerkjent av seks av de valgte NPC2 mAbs (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7B, 1-5B og 1-2g) (Figur 2B). Som vist i figur 2C, sensitiviteten og spesifisiteten til NPC2 mAbs (3-6B, 14-8D, 5-4B og 2-7B) ble deretter påvist ved anvendelse av SK-Hep1 celler transfektert med eller uten shNPC2. Blant disse NPC2 mAbs, valgte vi en NPC2 mAb (3-6B) som det beste for videre forskning og bruk i kliniske applikasjoner.
(A) epitop region kartlegging av monoklonale NPC2 antistoffer. Annen lengde på pNPC2-HA inkludert full-lengde pNPC2-HA, N-terminale halverings (1-80 A.A.), C-terminal halvparten (81-151 A.A.) og 41-105 A.A. ble transfektert inn i 293T-celler, og 24 timer senere ble høstet for Western blot-analyse. Lane 1, 1-2g; Land 2, 1-5B; Lane 3, 2-7B; Lane 4, 3-6B; Lane 5, mAb-HA; Lane 6, 4-12C; Lane 7, 5-4B, Lane 8, 5-5B; Lane 9, 14-8D. (B) En ELISA-plate belagt med fire peptider som dekker 1-40 A.A. region av NPC2 protein ble anvendt for epitopkartlegging. Representative resultater fra mAbs (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7D, 1-5B og 1-2g) vises. (C) Den knockdown effekten av shNPC2 på SK-Hep1 celler ble oppdaget ved hjelp av anti-NPC2 mAbs (3-6B, 14-8D, 5-4B og 2-7B).
Differensial uttrykk for NPC2 i menneskelige normale og tumorvev
for å undersøke klinisk anvendelse av NPC2 mAb, vi oppdaget uttrykk for NPC2 i ulike normale og kreft vev ved hjelp av IHC farging. Normal esophageal, livmorhals, bukspyttkjertel, mage, bryst, tykktarm og lungevev viste moderat til svak intensitet NPC2 farging (figur 3A og 3C). Som vist i figur 3B, ble sterk ekspresjon av NPC2 funnet i normale hepatocytter i leveren. I nyre, ble NPC2 uttrykt både i den distale og proksimale nyretubuli, men ikke i glomerulus (figur 3B)
Forstørrelse:. 200x. (A) NPC2 var oppregulert i bryst, tykktarm og lunge kreftprøver. (B) NPC2 ble nedregulert i nyre og levertumorprøver. (C) Uttrykket av NPC2 forble uendret i bukspyttkjertelen, spiserøret, livmorhals og mage vevsprøve par.
Sammenligning mellom disse normale vev (N) og tilhørende tumorvev (T) ble gjennomført ut og det ble funnet at NPC2 var signifikant oppregulert i bryst, kolon og lungekreft (figur 3A). Blant de 23 parene av bryst svulst og normalt vev testet, 18 (78%) av tumorvev viste høyere NPC2 uttrykk nivåer enn sine normale vev (
p
0,0001, tabell 1). Ut av 44 matchet ikke-småcellet lungekreft par, 30 kreft vevsprøver (68%) hadde større NPC2 uttrykk enn sine vanlige kolleger (
p
= 0,02, tabell 1). I motsetning til dette, NPC2 var signifikant nedregulert i nyrecellekreft og leverkreft (figur 3B). Blant 33 par av nyre tumor og normalt vev, 31 (94%) tumorvev prøver hadde en mye lavere NPC2 uttrykk enn den tilsvarende normale vev prøven (
p
0,0001, tabell 1). Blant 50 matchet leveren tumorvev og tumor-tilstøtende vev par, 36 kreft vevsprøver (72%) viste mye lavere NPC2 uttrykk enn deres tumor-tilstøtende vevsprøve (
p
= 0,02, tabell 1). Imidlertid var det ingen forskjell mellom normale og kreft vevsprøver for karsinom i spiserøret, livmorhalsen, bukspyttkjertel, mage og (figur 3C). . Samlet utgjør disse resultatene indikerte at avvikende uttrykk for NPC2 er assosiert med ulike kreftformer, og at endringen i uttrykket kan være enten opp eller ned, avhengig av vev
Kreft
T N n (%)
T = N n (%)
T N n (%)
p
verdi
økning i tumor tissuesBreast (n = 23) 18 (78%) 4 (17%) 1 (4%) 0.0001Colon (n = 38) 18 (47%) 14 (37%) 6 (16%) 0.0523Lung
# (n = 44) 30 (68%) 5 (11%) 9 (20%) 0.02Decrease i tumor tissuesKidney (n = 33) 2 (6%) 031 (94%) 0.0001Liver (n = 50) 2 (4%) 12 (24%) 36 (72%) 0.02 . Tabell 1. immunhistokjemi resultatene av NPC2 uttrykk i menneskelig bryst, tykktarm, lunge, nyre og leverkreft sammenkoblet vev
T, tumorvev; N, normalt vev;
#, Ikke-småcellet lungekreft. CSV Last ned CSV
Forholdet mellom NPC2 uttrykk og status for ER, PR og HER-2
Når det gjelder brystkreft, vi videre samlet 33 invasiv brystkreft fag identifisert i Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital og analyseres forholdet mellom NPC2 ekspresjon og clinicopathological egenskaper. Blant 33 pasienter, 18 (54,5%) svulst vevsprøver hadde en mye høyere NPC2 uttrykk enn tilsvarende normal vevsprøve (
p
= 0,002, Tabell 2). Forsøkspersoner med NPC2 oppregulering var mer sannsynlig å ha en senere patologi stadium (
p
= 0,018), ER (-) (
p
= 0,007), PR (-) (
p
= 0,005), HER-2 (+) (
p
= 0,006), ER (-) pluss PR (-) (
p
= 0,011) og ER /PR (-) pluss HER-2 (+) (
p
= 0,011)
Total
T . N n (%)
T = N n (%)
T N n (%)
p
verdi
Total patients3318 (55%) 13 (39%) 2 (6%) 0,002 TNM stageI95 (56%) 4 (44 %) 0 0,043 II166 (38%) 8 (50%) 2 (12%) 0,233 III87 (88%) 1 (12%) 0 0,018 ERPositive209 (45%) 9 (45%) 2 (10%) 0,090 Negative139 ( 69%) 4 (31%) 0 0,007 PRPositive188 (44%) 8 (44%) 2 (11%) 0,092 Negative1510 (67%) 5 (33%) 0 0,005 HER-2 ScorePositive (3) 2012 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 0,006 Negativ (0-2) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 CombinationER (+), PR (+) 167 (44%) 7 (44 %) 2 (12%) 0,171 ER (+), PR (-) 42 (50%) 2 (50%) 0 0,180 ER (-), PR (+) 21 (50%) 1 (50%) 0 0,317 ER (-), PR (-) 118 (73%) 3 (27%) 0 0,011 ER /PR (+), HER-2 (+) 94 (44%) 4 (44%) 1 (11%) 0,076 ER /PR (+), HER-2 (-) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 ER /PR (-), HER-2 (+) 118 (73%) 3 (27 %) 0 0,011 ER /PR (-), HER-2 (-) 000 0 N /Atable 2. NPC2 uttrykk og clinicopathological karakteristikker av brystkreftpasienter
T, tumorvev.; N, normalt vev; ER, østrogen reseptor; PR, progesteron reseptor; HER-2, human epidermal vekstfaktor-reseptor 2; (+) Positiv; (-) Negativ. CSV Last ned CSV
feilregulering av NPC2 uttrykk i menneskelig skrumplever og HCC
Siden leveren er den viktigste kilden til plasma og galle NPC2 [13], neste undersøkte vi om serum NPC2 nivå kan brukes som en roman biomarkør for leversykdommer. Vi målte mengden av serum NPC2 nivå fra 42 friske kontroller, 20 pasienter med HBV kronisk infeksjon, 2 pasienter med HCV kronisk infeksjon, 27 pasienter med fettlever, 28 pasienter med skrumplever og 46 HCC ved hjelp av en ELISA (Figur 4A). Nivåene av NPC2 i grupper med frisk kontroll, kronisk HBV-infeksjon, kronisk HCV-infeksjon, fettlever, skrumplever og HCC var 3,29 ± 1,43 ng /ml 4,51 ± 1,88 ng /ml, 9.66 ng /ml (maksimumsverdi, 15,81 og minimum verdi, 3,504), 7,49 ± 2,30 ng /ml, 15,30 ± 2,02 ng /ml og 7,26 ± 2,11 ng /ml. Som vist i figur 4A, er nivået av NPC2 var ingen forskjell mellom frisk kontroll, kronisk hepatitt (HBV og HCV) infeksjon og pasienter med fettleversykdom. Viktigere, pasienter med skrumplever og HCC hadde signifikant høyere nivåer av NPC2 enn friske kontroller. På den annen side, IHC-farging viste at NPC2 var signifikant nedregulert i cirrhose vev, mens det ikke var noen forskjell mellom normale og hepatitt vev (figurene 4B og 4C).
(A) ELISA-analyse av serum NPC2 nivåer i 42 friske kontroller, 20 pasienter med kronisk HBV-infeksjon, 2 pasienter med kronisk HCV-infeksjon, 27 pasienter med fettlever, 28 skrumplever og 46 HCC pasienter. (B) IHC-farging av NPC2 protein ekspresjon i normale, kroniske hepatitt og cirrhose vev. (C) IHC analyse av lever NPC2 ekspresjon i 44 normal, 21 kronisk hepatitt og cirrhose prøvene 60 vev (*,
p
0,05, Mann-Whitney U-test). (D) Humant sera (60 ug) ble inkubert med peptid N-glykosidase F (PNGase F) og underkastet Western blot-analyse. (E) Western blot-analyse av serum NPC2 ekspresjon i 14 friske kontroller, 7 fettlever, 4 cirrhose og 4 HCC pasienter. Hver linje ble lastet 100 mikrogram protein.
Siden N-glykosylering er viktig for riktig målgruppe og funksjon av NPC2 [14], vi neste brukte PNGase F fordøyelsen å bekrefte om serum NPC2 protein heterogenitet skyldes til post-translasjonell glykosylering modifikasjon. Etter PNGase F behandling, ble NPC2 visualisert som et enkelt immunoreaktivt bånd (figur 4D). For å ytterligere undersøkt om glykosylert form av NPC2 er assosiert med leverkreft progresjon ble serumprøver underkastet Western blotting-analyse. Glykosylert og begynnende NPC2 ble uttrykt ved et forhold på 1: 1 i normalt humant serum (figur 4E). Interessant, selv om vi ikke fant noen forskjell i serum NPC2 uttrykk mellom sunt og fettlever pasienter, glykosylert NPC2 uttrykk var den viktigste formen i både skrumplever og HCC pasienter (Figur 4E). Disse data antydet at beløpene og endringer av glykosylert mønster av NPC2 er forbundet med skrumplever og HCC utvikling.
Effekter av NPC2 på MAPK signaliserer
For å identifisere NPC2 avhengige mekanismen, vi vektlagt om status for MAPK signalering. Som vist i figur 5, vedvarende fosforylering av ERK1 /2 er blitt observert i NPC2 knockdown-celler. Men p38 og JNK ikke aktivere i NPC2 knockdown celler.
Total og fosforylert ERK1 /2, p38, JNK ble oppdaget av Western blotting fra SK-hep1 celler. Knockdown av NPC2 resultater i aktivering av ERK1 /2.
Diskusjoner
NPC2 protein binder med fritt kolesterol og kontrollerer intracellulær kolesterol homeostase [2]. Mutasjon av NPC2 genet resulterer i akkumulering kolesterol i sen endosomale /lysosomale rom av cellen [6]. Imidlertid er rollene til NPC2 ekspresjon i humane kreftformer ikke fullt ut forstått til tross for dets kjente rolle i kolesterol-binding. I denne studien vi generert og karakterisert en rekke NPC2 mAb og deretter vurderes deres immunreaktivitet ved hjelp av flere tumorvev matriser. Fra epitop kartdata, fant vi at NPC2 mAbs målrettet aminosyreenheter 31-40 av menneske NPC2 protein (figur 2B). Siden aminosyreresidier 31-40 er høyt konservert blant forskjellige pattedyr ortologer [2], bør disse NPC2 mAbs være hjelpsomt når du utfører forskning på rollen NPC2 i et bredt spekter av pattedyrarter i fremtiden. Sensitiviteten og spesifisiteten NPC2 mAbs ble evaluert av knock-down av NPC2 protein i SK-Hep1 celler (Figur 2C).
IHC farging viste at NPC2 uttrykk ble økt i bryst, tykktarm og lungekreft (figur 3A). Siden sterkt uttrykk for NPC2 er observert i menneskelige intraductal bryst papilloma, kolon polypper, lunge papillær carcinoma og eggstokkreft fimbria [8,15], kan NPC2 protein bidra til papiller formasjon. Epidemiologiske studier har vist at HER-2 subtype [HER-2 (+), ER (-), og PR (-)] og tre negative [HER-2 (-), ER (-), og PR (-)] hadde det verste overlevelse, dårlig prognose og høyere lokoregionalt gjentakelse [16-19]. Vår studie fant at NPC2 over-uttrykk er assosiert med HER-2 subtype (tabell 2), noe som antyder at NPC2 oppregulering kan være en gunstig prognose prediktor for brystkreft.
Kolesterol homeostase er viktig å lamellegemer av lunge alveolar type II celler som tjener til å fremstille overflateaktivt middel. NPC2 protein er til stede i den alveolære typen lunge II celler og alveolære makrofager, og regulerer overflateaktivt middel kolesterolinnholdet [9,20]. Våre funn viste at NPC2 er forbedret i lunge adenokarsinom vev (figur 3A). Proteomikk analyser har også vist at uttrykk for NPC2 økes i lunge adenom og pleuravæske [21,22]. Selv om det ikke er klart om ennå NPC2 spiller en rolle i lunge adenokarsinom, tilstedeværelse av NPC2 protein i pleural effusjon av pasienter med lunge adenokarsinom antyder at det kan ha en anvendelse som en diagnostisk markør for lungekreft.
redusert uttrykk for NPC2 ble spesielt observert i nyre og lever tumorvev, sammenlignet med sine normale kolleger. Siden NPC2 knockdown fibroblast-celler er blitt vist en vedvarende fosforylering av ERK1 /2 MAPK [10], kan NPC2 negativt regulere ERK1 /2 MAPK-aktivering. Faktisk ble aktivering av ERK1 /2 observert i NPC2 knockdown SK-hep1-celler (Figur 5). Når det gjelder virkningen av NPC2 erstatningsterapi hos NPC2 – /- mus, ble det funnet at levermakrofaginfiltrering og antall fettfylte celler ble signifikant forbedret [23]. Siden lipid akkumulering og senere betennelse fremskynde utviklingen av skrumplever og leverkreft [24,25], kan NPC2 administrasjon bøte leveren kreftutvikling. Siden leveren er den viktigste kilden til plasma og galle NPC2 [13], kan økningen av sera NPC2 i skrumplever og HCC pasienter knyttet til alvorlig skade av hepatocytter. I den foreliggende undersøkelse har vi også observerte endringer i glykosylerte NPC2 ekspresjonsmønstre i sera hos både cirrhose og HCC pasienter, noe som tyder på at slike endringer kan tjene som en indikator på levercirrhose og kreft. N-glykosylering er viktig for riktig funksjon og målretting av NPC2 [14]. Videre studier er nødvendig for å klargjøre rollene til glykosylert NPC2 bruke mer skrumplever og HCC tilfeller.
I nyrene, er NPC2 rikelig express i distal og proksimale nyretubuli (figur 3B). Siden NPC2 er oppregulert i nyre vev fra Dahl salt-sensitive rotte gitt en høy-salt diett [26], har det vært antydet at NPC2 kan regulere natrium reabsorpsjon i nevronet. Likevel er den funksjonelle relevansen av NPC2 i nyrecellekarsinom uklart og videre studier er nødvendig for å belyse hvilken rolle NPC2 i nyre, både fysiologisk og patologisk.
Våre funn indikerer at vår NPC2 monoklonalt antistoff har potensielt nyttige programmer innen klinisk diagnose og kreft progresjon på tvers av flere vev.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
#, HBV eller HCV indikerer saker ble smittet av HBV og HCV-virus, henholdsvis
Non-B non-C indikerer pasienter ble ikke smittet av HBV og HCV-viruset. *, Klassifiseringen av patologi etapper ble ifølge AJCC, UICC, og Cupi
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077586.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
#, HBV eller HCV indikerer saker ble smittet av HBV og HCV-virus, henholdsvis.
doi: 10,1371 /journal.pone.0077586.s002 plakater (DOC)
Takk
Vi takker TLCN for å gi de vevsprøver og relaterte kliniske data HCC. Dette nettverket omfatter i dag fem store medisinske sentre (National Taiwan University Hospital, Chang-Gung Memorial Hospital-linko, Veteran General Hospital-Taichung, Chang-Gung Memorial Hospital, Kaohsiung og Veteran General Hospital, Kaohsiung).
