Abstract
Bakgrunn
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) presenterer som en progressiv sykdom som spenner forstadier, preinvasive, lokalt invasive og metastatiske lesjoner. Identifisering av biologiske pathways reflekterende av disse progressive stadier, og abnormt uttrykte gener assosiert med disse banene, kunne tenkes å forbedre terapeutiske tilnærminger til denne ødeleggende sykdommen.
Metodikk /hovedfunnene
Gjennom bygging og analyse av SAGE bibliotekene, har vi bestemt transkriptom profiler for preinvasive carcinoma in situ (CIS) og invasiv plateepitelkarsinom (SCC) av lunge, og sammenlignet disse med uttrykk profiler generert fra både bronkialepitelet, og forstadier metaplastiske og dysplastiske lesjoner ved hjelp av
Oppfinnsomhet Pathway Analysis
. Uttrykket av gener assosiert med epidermal utvikling, og tap av uttrykket av gener assosiert med mucociliary biologi, er dominerende trekk ved CIS, i stor grad delt med forstadier til kreft. I tillegg er uttrykket av gener assosiert med xenobiotisk stoffskifte /avgiftning en viktig egenskap ved SUS, og er i stor grad opprettholdt i invasiv kreft. Gener relatert til vev fibrose og akutt faseimmunrespons er karakteristisk for invasiv SCC fenotype. Videre data presentert her antyder at vev-omforming /fibrose initieres ved de tidlige stadiene av CIS. I tillegg gir denne studien indikerer at endring i kopitall status representerer en plausibel mekanisme for differensial genuttrykk i CIS og invasiv SCC.
Konklusjon /Betydning
Denne studien er den første rapporten fra stor- skalere ekspresjon profilering av CIS i lungen. Objektivt uttrykk profilering av disse preinvasive og invasive lesjoner gir en plattform for videre etterforskning av molekylærgenetiske hendelser som er relevante for tidlige stadier av plateepitel NSCLC utvikling. I tillegg oppregulert gener som oppdages ved ekstreme forskjeller mellom SUS og invasiv kreft kan ha potensial til å tjene som biomarkører for tidlig deteksjon
Citation. Lonergan KM, Chari R, Coe BP, Wilson IM, Tsao MS, Ng RT, et al. (2010) transkriptomet Profiler av carcinoma in situ og invasiv ikke-småcellet lungekreft som avslørt av SAGE. PLoS ONE 5 (2): e9162. doi: 10,1371 /journal.pone.0009162
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 04.10.2009; Godkjent: 07.01.2010; Publisert: 11 februar 2010
Copyright: © 2010 Lonergan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Genome Canada /Genome British Columbia, Canada Cancer Society Research Institute (CCS # 20485) og den kanadiske Institutes of Health Canada (MOP200113 og MOP 86731). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er estimert til å påføre den høyeste kreftdødeligheten i USA i 2009 [1]. Molekylære målrettede terapier er rettet mot signaloverføringsveier som er aktive i cellulær proliferasjon, differensiering, apoptose, og angiogenese, er blitt anvendt i behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), men med varierende og ofte skuffende resultater [2], [ ,,,0],3], [4], [5], [6]. Som samtidig målretting av flere signalveier har vist forbedringer i klinisk respons [6], ytterligere kunnskap om biologiske mekanismer som er involvert i lungekreft utvikling, sammen med identifikasjon av abnorme uttrykte gener i disse banene, kan forventes å tilrettelegge for utvikling av nye terapeutisk intervensjon [7], [8].
carcinoma in situ (CIS) i lungen, er preinvasive lesjoner av skvamøs NSCLC, ofte forbundet med histologisk, cytologisk, og genetiske avvik, og progresjon til invasiv kreft typisk oppstår [9], [10], [11], [12]. Som disse minutt lesjoner er optimalt synlig i de sentrale luftveier ved fluorescerende bronkoskopi eller LIFE (lunge-imaging fluorescerende endoskopi) [13], [14], eksperimentelle og kliniske studier er sjeldne (figur 1). Selv om mange uttrykk profilering studier har blitt rapportert for avanserte stadium lungesvulster [15], [16], tidlig stadium (CIS og lokalt invasiv) lesjoner forblir stort sett uutforsket. Molekylær genetisk analyse av preinvasive lesjoner, gratis fra bakgrunnsstøy i forbindelse med vanlig studert avanserte svulster, er avgjørende for identifisering av viktige gener og tilsvarende molekylære stier underliggende tidlige hendelser i neoplastisk transformasjon og kreftutvikling. En forståelse av disse tidlige avvik er avgjørende for rask terapeutisk intervensjon av denne ødeleggende sykdommen.
Bronkoskopi hjelp A. hvitt lys for påvisning av CIS lesjoner (indikert med pil), eller B. LIFE (lunge-tenk fluorescerende endoskopi ) for påvisning av lesjoner CIS (angitt med pil). C. Histologisk seksjon identifisere en CIS lesjon innenfor bronkialepitelet, preget av omfattende plateepitel lagdeling.
Store genuttrykkstudier ofte benytter microarray teknologi. Nyere studier vektlegger verdien av skreddersydde matriser, med mål utvalg basert på tidligere kunnskap om genuttrykk, til mer nøyaktig gjenspeile transkriptomet av vevet av interesse; spesielt anvendes i studiet av NSCLC [17]. SAGE (serie analyse av genuttrykk) tilbyr en sekvens-basert, non-partisk tilnærming til omfattende transkriptomet analyse, med noen tidligere kjennskap til uttrykk nødvendig [18]. Videre informasjonen han fikk fra SAGE analyse potensielt bidrar til utforming av mer hensiktsmessige mikromatriser for fokusert forskning og diagnostiske formål.
I en tidligere studie, beskrev vi transcriptomes røykskadet bronkialepitelet og lungeparenkym ved hjelp av SAGE [19]. Her utvider vi vår analyse til uutforsket preinvasive scenen i lungekreft utvikling, og presentere den første rapporten i stor skala uttrykk profilering av carcinoma in situ av lungene. I tillegg beskriver vi transcriptomes for invasiv plateepitelkarsinom (SCC), og forstadier metaplastiske og dysplastiske (PC) lesjoner, avledet fra bygging og analyse av flere SAGE biblioteker, som kulminerte i mer enn 22 megabases av sekvensinformasjon. Gjennom utnyttelse av
Oppfinnsomhet Pathway Analysis
, har vi identifisert gener assosiert med epidermal utvikling og xenobiotisk stoffskifte /avgiftning som komponenter i CIS lesjoner, og gener assosiert med immunrespons og vev ombygging /fibrose som komponenter i invasiv SCC. I tillegg har vi funnet gener assosiert med mucociliary differensiering skal nedregulert i både SUS og PC-lesjoner. Vi diskuterer potensialet relevansen av disse transkripsjons avvik til de tidlige stadier av lungekreft utvikling, og presentere en visning av CIS transkriptomet tidligere ukjent.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av University of British Columbia-British Columbia Cancer Agency forskningsetikk Board (UBC-BCCA REB). Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle fag.
Prøver
Bronkial epitel (BE) børsting prøvene ble tidligere beskrevet [19]. Biopsiprøver inkludert forstadier (PC) lesjoner (metaplasi, dysplasi), karsinom in situ (CIS) lesjoner, og invasiv plateepitelkarsinom (SCC) svulstvev. PC og CIS-prøvene ble oppnådd ved autofluorescent bronkoskopi (figur 1). Alle biopsier (med unntak av de som brukes i bygging av biblioteker CIS-3, SCC-5, og SCC-6) ble samlet i RNA
senere
® [Applied Biosystems (Ambion Inc., Canada)] og lagret ved – 85 ° C. Den biopsi brukes i bygging av bibliotek CIS-3 ble innebygd i oktober media, og lagret ved -85 ° C. For bygging av biblioteker SCC-5 og SCC-6, ble RNA isolert fra svulstvev fra åtte personer etter guanidium isothiocyanate og fenol /kloroform ekstraksjon. Alle fag som bidrar til denne studien var enten tidligere eller nåværende røykere (tabell 1).
SAGE bibliotek konstruksjon og sekvens behandling
Med unntak av bygging av biblioteker SCC-5 og SCC -6, hver prøve (biopsi eller bronkial pusse som tidligere beskrevet [19]) ble hentet fra RNA
senere
® (eller oktober for bibliotek CIS-3), og homogenisert i lyserings /bindende løsning. For bibliotekene SCC-5 og SCC-6, ble RNA samlet fra fire prøver i lik mengde, og ~19 mikrogram total RNA ble nedsenket i lyse /bindende løsning og brukes til bygging av hvert bibliotek. De resulterende Lysatene ble brukt direkte for SAGE bibliotek konstruksjon i henhold til MicroSAGE protokollen, ved hjelp av
NLA
III som forankringen enzymet og
BSM
FI som tagging enzym (www.ncbi.gov/SAGE ). Denne fremgangsmåten har vist seg å gi meget reproduserbare SAGE biblioteker [19]. I gjennomsnitt, 10
5 SAGE-koder, unntatt linker og duplisere ditags, ble sekvensert per bibliotek; alle rå SAGE data har blitt deponert hos GEO (tabell 1). For normalisering ble tag teller skalert til 10
6 koder for hvert bibliotek, dvs. som koder per million (TPM).
Cluster analyse
For å vurdere graden av likhet mellom lungen SAGE biblioteker generert i denne studien (to PC-biblioteker, fem CIS biblioteker og seks invasive SCC biblioteker) og de som genereres i en tidligere studie (14 BE biblioteker og to lungeparenkym biblioteker), ble klyngeanalyse brukt. For denne analysen, ble de 300 mest tallrike tags beholdt fra hvert bibliotek, noe som gir en sammenslått liste over 1128 unike koder. Dataene ble deretter logge
10 transformert og gruppert ved hjelp av
Genesis
, ved hjelp av en gjennomsnittlig kobling algoritme og en euklidsk avstand metrisk [20]. For tagger med tellinger av null, ble dataene ikke forvandlet, og ble beholdt som null.
Differensial uttrykk analyse
Med mindre annet er angitt, ble differensial genuttrykk definert av en minimal tre ganger forskjell (avrundet til en desimal) i gjennomsnittlig norm tag tellinger (TPM) mellom to datasett som sammenlignes. I tillegg ble et minimalt gjennomsnittlig normalisert merkelappen telling av 40 TPM som kreves i den overuttrykkende datasettet. Tag-til-genet kartlegging var i henhold til SAGE Genie databasen, 17. september, 2009-versjonen [21] (cgap.nci.nih.gov/SAGE). Som den nyeste utgivelsen av SAGE Genie ikke automatisk justeres til mitokondrielle transkripsjoner, benyttet vi en manuell kartlegging tilnærming til å identifisere disse transkripsjoner.
Dataanalyse
datasett av forskjellig uttrykt gener ble analysert primært gjennom bruk av
Oppfinnsomhet Pathway Analysis plakater (IPA), versjon 8.0 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
Funksjonell analyse av hele datasett
identifiserte de biologiske funksjoner og /eller sykdommer som var mest betydnings til datasettet. Gener fra datasettet som var knyttet til biologiske funksjoner og /eller sykdommer i oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base ble ansett for analyse (IPA kvalifisert kartlagt IDer).
Canonical pathway analyse av hele datasett
identifisert trasé fra IPA bibliotek av kanoniske trasé som var mest betydnings til datasettet, basert på gener innenfor datasettet som ble assosiert med en kanonisk sti i oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base.
Toxicity liste analyse av hele datasett
identifiserte de Tox lister fra IPA bibliotek av Tox Lister som var mest betydnings til datasettet. Gener fra datasettet som ble assosiert med en liste ble ansett for analysen. For hver av disse analysene, betydningen av sammenhengen mellom genene i datasettet og den tilordnede biologisk funksjon og /eller sykdom /kanonisk sti /toksisitet liste, ble målt ved Fischers eksakte test for å beregne en p-verdi for å bestemme sannsynligheten for at foreningen ble forklart ved en tilfeldighet alene.
Min Pathways
er en grafisk fremstilling av de biologiske relasjoner mellom genprodukter, som støttes av minst en referanse fra litteraturen, fra en lærebok, eller fra kanoniske informasjon som er lagret i oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base. Gener er vist ved hjelp av ulike former som representerer den funksjonelle klasse av genproduktet som angitt i tegnforklaringen i de konkrete tall.
RNA isolert fra kliniske prøver
For kvantitativ RT-PCR-analyse, RNA fra matchet tumor og normal lungeparenkym ble samlet inn fra resected vev. Kort beskrevet ble flere deler av hver tumor snitt, med den første og siste av en serie farget med H E for inspeksjon av en lunge patolog. Etter å ha bekreftet diagnose og vurdere svulst heterogenitet med patologi gjennomgang, fanget vi de deler av svulsten ha minimum 70% kreftceller. RNA ble ekstrahert fra både microdissected svulstvev og fra tilknyttede normalt vev med
RNeasy
kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). I alt ble RNA fra ni paret tumor- og normale parenchyma prøver anvendt for RT-PCR-analyse. I tillegg ble RNA ekstrahert som beskrevet tidligere [19], fra seks bronkial brushings representerer tre nåværende og tre tidligere røykere, for kvantitativ RT-PCR-analyse.
RT-PCR-analyse
For kvantitativ RT-PCR (qPCR), ca 1 mikrogram total RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit (kat # 4322171, Applied Biosystems) og gen-spesifikk kvantitativ PCR ble utført ved bruk av TaqMan Universal PCR Master Mix og TaqMan primere (katt # 4326708, Applied Biosystems), i henhold til produsentens anbefaling. Beta-aktin ble brukt som en endogen kontroll (primer produktkode 4352935E). Primer produktkoder for test gener var som følger: ECE2 (Hs00981189_g1), MAGEA9 (Hs00245619_s1), MAGEA11 (Hs00377815_m1), CLDN1 (Hs00221623_m1), CKS1B (Hs01029137_g1), POSTN (Hs00170815_m1), ARTN (Hs00754699_s1), SFRP2 (Hs00293258_m1), UBE2S (Hs00819350_m1), C19orf48 (Hs00364147_m1), FBXO27 (Hs00381091_m1), MCM2 (Hs00170472_m1), NTS (Hs00175048_m1), SLC6A8 (Hs00373917_g1), og SLC2A1 (Hs00197884_m1, Hs00892681_m1). Reaksjonene ble kjørt på en iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd., Mississauga, ON, Canada). Differensial ble bestemt ved hjelp av delta-deltaet CT-metoden. For tumor /normal-parenchyma parene, ble brett endringer beregnet for hvert par. Ved sammenligning av tumorene til tannbørsting, ble folde endringer beregnet å sammenligne hver tumor med den gjennomsnittlige ekspresjon av de seks BE prøvene. Den gjennomsnittlige svulst i løpet av normal parenchyma ganger endring og gjennomsnittlig svulst i løpet av BE ganger endring rapporteres for hvert gen.
Gene dosering besluttsomhet
carcinoma in situ prøver som brukes for kopitall profilering var oppsamlet i 10% bufret formalin. Mikrodisseksjon ble utført på parafinsnitt for å oppnå kreftceller. Typisk større enn 20 seriesnitt var nødvendige for å gi tilstrekkelig materiale. DNA ble isolert fra oppsamlede celler med proteinase K fenol /kloroform-ekstraksjon, som tidligere beskrevet [22]. Hele genomet flislegging banen rekke CGH analyse ble utført ved hjelp av SMRT rekke versjon 2 som tidligere beskrevet [23], [24]. Denne plattformen er egnet for profilering av formalinfiksert parafin innleiret materiale [22], [23], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. Genome segmentering og kopi nummer status ble utført ved hjelp aCGH-Glatt på rekke bildedata og visualisert ved hjelp av SIGMA programvare [31], [32], [33], [34]. Taps array elementer ble tildelt en verdi på -1, beholdt elementer verdien 0, og fikk elementer en verdi på 1. Twenty CIS prøvene ble profilert totalt, og en terskel for gen-spesifikke kopiantall gevinst /tap ble satt til 20 %. Den 20% grensen ble innført i et forsøk på å redusere påvisning av falske eller tilfeldige hendelser på grunn av bakgrunn genomisk ustabilitet iboende til prøvene, og dermed velge for disse hendelsene som inntreffer med en viss grad av regularitet.
Offentlig microarray data sammenligninger
Microarray uttrykk data for 53 primær plateepitel svulster ble hentet fra Lung Cancer datasett på NCBI, GEO tiltredelse antall GSE3141 [35]. Microarray expression data for 67 bronkial brushings hentet fra en blandet befolkning av nåværende og tidligere røykere, ble profilert internt. All microarray data var RMA normalisert [36].
Diskusjon
SAGE tilbyr en objektiv og helhetlig tilnærming til uttrykk profilering, bare begrenset av dybden av sekvense valgt av forskeren Resultater og og tilbud en enestående mulighet for transkripsjon oppdagelse. Dette står i skarp kontrast til mikromatriseanalyse, hvor ekspresjon profilen og virkeområde analyse er forhåndsbestemt av target utforming typisk ved anvendelse av et begrenset antall av de mest karakterisert gener [17]. I en tidligere studie, beskrev vi transcriptomes røykskadet bronkialepitelet og lungeparenkym ved hjelp av SAGE [19]. Her utvider vi vår analyse til stort sett uutforsket område av tidlig stadium lungekreft utvikling, og presentere den første rapporten i stor skala genuttrykk profilering av carcinoma in situ (CIS) av lungene. En forståelse av molekylærgenetikk styrer preinvasive stadier er kritisk til rette for tidlig oppdagelse og umiddelbar terapeutisk intervensjon før progresjon til invasiv kreft oppstår. I denne studien presenterer vi en sammenlignende analyser, med vekt på gener over-uttrykt i CIS og invasive kreft transcriptomes, i forhold til ikke-kreft transcriptomes i lungene inkludert bronkialepitelet (BE), og forstadier til kreft (PC: plateepitel metaplasi og dysplasi).
Twenty-seven lunge SAGE bibliotek består av 3,997,729 totale sekvens tags (~40 megabases av høy kvalitet DNA-sekvensen) ble analysert i denne studien. Normal lunge er representert ved 14 bronkial epitel biblioteker (BE-en gjennom BE-14) [19], [37]. Forstadier til kreft stadium er representert med to bibliotekene som stammer fra plateepitel metaplasi (Met) og squamous dysplasi (Dys). Squamous cell carcinoma i lungene er representert ved fem carcinoma in situ (CIS-biblioteker 1 til cis-5), og seks invasivt karsinom bibliotek (SCC-1 til SCC-6) (beskrevet i tabell 1 og tabell 2). (Det bemerkes at prøvene som inngår i BE, PC, CIS, og SCC datasett var fra en blandet befolkning av nåværende og tidligere røykere.) Denne informasjonen har identifisert mer enn 129.000 unike sekvens koder /potensielle transkripsjoner i CIS lesjoner, og nesten 140 000 unike sekvens koder /potensielle transkripsjoner i invasive plateepitel NSCLC.
analyse av de 300 mest tallrike tags i BE, CIS og SCC SAGE datasett
Cluster analyse.
Cluster analyse ga forventet gruppering av SAGE biblioteker, attesterer til å smake kvalitet. For denne analysen, ble de 300 mest tallrike tags beholdt fra hvert bibliotek, noe som gir en sammenslått liste over 1128 unike koder. Gjennomsnittlig linkage clustering analyse basert på 1128 mest tallrike SAGE koder, avslører at alle kreft biblioteker (både CIS og invasiv SCC) klynge sammen, og separat fra BE bibliotekene (figur 2A). Vi noterer noen gruppering av de invasive SCC bibliotekene (fire av seks). Ligner clustering er observert ved bruk av topp 500 eller de 1000 unike koder per bibliotek (data ikke vist).
A. Cluster analyse av lunge SAGE biblioteker. Alle SAGE biblioteker fra denne studien, inkludert fem carcinoma in-situ biblioteker (CIS-en gjennom CIS-5), seks invasiv plateepitelkarsinom bibliotek (SCC-1 til SCC-6), en plateepitel metaplasi bibliotek (Met), og en squamous dysplasi bibliotek (Dys), samt 14 bronkial epitel biblioteker (BE-en gjennom BE-14), og to normale lungeparenkym SAGE biblioteker (LP-1, LP-2; tiltredelse GSE3708) som genereres i en tidligere studie [19 ], [37], ble analysert ved klynge analyse ved hjelp av et gjennomsnitt-algoritme binding. De 300 mest tallrike tags ble beholdt fra hvert bibliotek og analyse ble basert på 1128 unike koder totalt. I dendrogram representerer gren lengde avstand. B-D. IPA funksjonell analyse av de mest tallrike gener i BE, CIS, og invasive kreft datasett. Tag-til-genet kartlegginger for de 300 mest tallrike koder fra BE, CIS og SCC datasett, ble brukt for IPA kjerneanalyse, som består av 220, 231, og 233 IPA kvalifisert kartlagt IDer, henholdsvis. De tre datasettene ble vist sammen ved hjelp av IPA kjerne sammenligninger, og de fem mest betydningsfulle funksjoner i
Fysiologisk Systemutvikling og funksjon
er vist for hver av de tre datasettene. Dataene i B er sortert etter høyeste betydning i BE, dataene i C er sortert etter høyeste betydning i CIS, og dataene i D er sortert i henhold til høyeste betydning i invasiv SCC. Den oransje linjen viser grenseverdi av betydning, forhåndsinnstilt på en p-verdi på 0,05. For en komplett liste over kodene /kartlagt IDer som brukes for denne analysen, se tabell S1.
Oppfinnsomhet pathway analyse.
For å karakterisere og sammenligne bronkial epitel og kreft transcriptomes, vi computated gjennomsnittlig norm tag teller BE (14 biblioteker), CIS (5 biblioteker), og invasiv SCC (6 biblioteker) datasett, og deretter valgte de mest tallrike 300 unike koder fra hvert datasett for analyse (tabell S1). Tags kartlegging til mitokondrie-kodede gener og ribosomale protein gener, ble funnet på lignende frekvenser innenfor topp 300 mest tallrike tags, på tvers av alle tre datasett av BE, CIS, og SCC, på ~8% og ~18%, henholdsvis. Vi brukte kjerneanalyse komponent av
Oppfinnsomhet Pathway Analysis plakater (IPA) for å kategorisere disse genene i henhold til biologiske funksjoner. Bare de molekyler som har minst en funksjonell anmerkning i IPA kunnskapsbase kvalifisere for analyse, og inkludert 220 (BE), 231 (CIS), og 233 (SCC) IPA kvalifisert gener. Disse analysene viser at gener innen gruppen av
hår og hud utvikling og funksjon
er høyt uttrykt i CIS transkriptomet forhold til både være og SCC, og gener innenfor kategoriene
Hematologisk Systemutvikling og funksjon
og
Immune Cell Trafficking
er høyt uttrykt i SCC transkriptomet forhold til både BE og CIS. Derfor er høy ekspresjon av gener assosiert med epidermal utvikling her identifisert som et karakteristisk trekk ved CIS transcriptome, og høy ekspresjon av gener assosiert med cellulær bevegelse som et karakteristisk trekk ved SCC transcriptome. Se figur 2B-D for en oppsummering av disse analysene.
Et bemerkelsesverdig trekk ved både SUS og SCC datasett er overflod av koder kartlegging til den konstante regionen av immunoglobulin tunge kjeder. Faktisk er SAGE tag for IGHG1 den mest tallrike tag både SUS og invasive kreft datasett (Tabell S1). Selv om det er mulig at ekspresjonen av disse immunglobulinkjeder stammer fra den infiltrerende lymfoid vev og omkringliggende stroma har tidligere undersøkelser vist ekspresjon av tungkjede konstante og variable regioner av immunoglobuliner i brystkreft epitelceller [38], [39], [40], og ekspresjon av IgG tunge og lette kjeder i ulike epiteliale kreftceller, inkludert lunge- SCC [41]. Disse immunoglobulinkjedene kan representere kreft celle autoantistoffer, og stimulere til vekst i en autokrint /parakrint mote [40]. Forbløffende nok til overflod av tags kartlegging immunoglobulin tungkjede transkripsjoner i CIS preinvasive lesjoner i lungene, i kontrast til den relativt lave deteksjons både BE og forstadier metaplastiske og dysplastiske lesjoner (detaljert i senere tabeller), antyder at oppregulering av disse utskrifter kan ha relevans for initiering av NSCLC.
endrer Gene uttrykk vanlig å carcinoma in situ og forstadier til kreft
Overgang fra en sunn bronkialepitelet til invasiv kreft er antatt å fortsette via progresjon av histologiske og genetiske avvik: BE til PC til CIS til SCC, hvor PC representerer forstadier til kreft (plateepitel metaplasi og dysplasi). Plateepitel metaplasi er en forbigående komponent i normal sårtilheling av bronkialepitelet, og vanligvis løser til en re-differensiert epitel sammensatt av pseudostratified ciliated og sekretoriske celler, gjenopprette bronkial funksjon [42]. (Bruk av begrepet PC her ikke innebærer en obligatorisk progresjon til kreft, men snarere refererer til lesjoner /unormalt at til tross for sjelden progresjon til kreft, anses som forløpere til kreft.) Motsatt CIS lesjoner demonstrere en lav regresjon frekvens med en høy forekomsten av progresjon til invasiv kreft [43], [44] og er karakterisert ved en mer omfattende lagdeling av squamous celletyper i forhold til PC [9], [11], [12]. Ved å identifisere genuttrykk endringer felles for både PC og CIS forhold til BE, fokuserer vi på de genetiske hendelser som oppstår tidlig og vedvarer gjennom til CIS. I henhold til våre utvelgelseskriterier (minimal tre ganger forskjell i gjennomsnittlig normalisert tag overflod; minimal gjennomsnittlig normalisert tag overflod av 40 TPM i over-uttrykker datasettet), 868 SAGE koder ble funnet å være like forskjellig uttrykt i PC og CIS i forhold til BE, bestående av 190 oppregulert koder, og 678 nedregulert tags (figur 3A).
Kriterier for differensial genuttrykk ble definert som en minimal tre ganger forskjell i normaliserte gjennomsnitts tag teller, og med en minimal middel tag overflod av 40 TPM i over-uttrykke datasett. Up-piler indikerer oppregulert genuttrykk endringer; ned-piler indikerer nedregulert genuttrykk endringer; numeriske verdier refererer til antall forskjellig uttrykt koder. Områder i avskjæring reflektere genuttrykk endringer i felles mellom de to datasettene. A. Expression endringer i carcinoma in situ og forstadier til kreft i forhold til BE. B. Expression endringer i kreft datasett i forhold til både bronkialepitelet og forstadier datasett. BE: bronkial epitelial; PC: forstadier til kreft; CIS: karsinom in situ; SCC:.. Invasiv plateepitelkarsinom
Up-regulert uttrykk endringer
Om lag 35% av kodene oppregulert i CIS forhold til BE (190 av 529 tags) var funnet å være vanligvis oppregulert i PC-lesjoner, og omtrent 25% av koder oppregulert i PC-lesjoner i forhold til BE (190 av 754 lapper) ble funnet å være like oppregulert i CIS (figur 3A). Se tabell S2 for en beskrivelse av disse kodene oppregulert i både PC og CIS. IPA funksjonell analyse (basert på 143 kvalifisert tilordnede ID-er) indikerer at omtrent 35% av disse vanligvis oppregulert gener er forbundet med epidermal utvikling og assosierte tilstander, som beskrevet i tabell 3. I tillegg til de gener som er beskrevet i tabell 3, en gjennomgang av litteraturen identifisert andre gener innenfor PC /CIS oppregulert datasett for å være assosiert med epidermal utvikling, inkludert SBSN, CNFN, CRCT1, flere medlemmer av den lille prolin-rik familie av proteiner (SPRR2E og SPRR3), og flere medlemmer av den S100A familien av kalsiumbindende proteiner. Mange av disse gener er kodet enten innenfor epidermal differensiering kompleks (EDC) locus på 1q21 [45], [46], eller innenfor et konservert locus på 19q13 [47], og angir komponentene av forhomede celle konvolutt, en struktur som gir barriere beskyttelse til epidermis og intern epitel svar å fornærme eller skade [48], [49].
IPA pathway grafisk representasjon av genene vanligvis oppregulert i CIS og PC i forhold til å være, er presentert i figur 4. Vurderer molekylære interaksjoner identifisert av IPA, funksjonelle foreninger blant desmosomale cadherins og catenins er fremtredende innenfor PC /CIS oppregulert datasett. Desmosomes er inter vedheft veikryss som gir mekanisk integritet til epitel, og studier viser at desmosomale cadherins modulere keratinocyte differensiering og epidermal morphogenesis [50]. Denne analysen tyder også på at en signalkaskade mediert av medlemmer av 14-3-3 familien av proteiner, kan være aktiv her. 14-3-3 sigma (SFN) formidler keratinocyte differensiering og lagdeling av epidermis [51]. Den veien Diagrammet viser også at spesifikke aspekter av keratinocyte terminal differensiering kan være mediert av AP-en transkripsjonsfaktor FOSL2, som kan ha en ekstra rolle i ekstracellulære matrise ombygging. Faktisk FOSL2 har blitt identifisert som en formidler av lungefibrose [52]. En vurdering av gener knyttet til transkripsjonsfaktor HIF1A i PC /CIS lesjoner, antyder en ombygging /profibrotic svar på hypoksiske vekstforhold [53], [54], [55]. Faktisk er en funksjonell sammenheng mellom hypoksi og fibrose dokumentert i litteraturen [56], [57], [58]. Uttrykk av andre gener identifisert her, for eksempel NCF1 (regulatorisk subenhet av NADPH oksidase), og heme katabolsk enzymet HMOX1, er også et tegn på en oksygen relatert stress respons og vev ombygging /fibrose [59], [60], [ ,,,0],61], [62]. Det bemerkes at ytterligere IPA analyse identifisert
hepatisk fibrose /Leverstel Cell Aktivering Hotell og
14-3-3-mediert Signa
som viktige kategorier innenfor
Canonical Pathways
, og identifisert
lever~~POS=TRUNC fibrose
som den viktigste kategorien innenfor
Toxicity Lister
(data ikke vist).
155 gener (IPA kartlagt IDer) er representert av 190 SAGE tags opp -regulated både SUS og PC i forhold til BE. (Se tabell S2 for tag data.) Genprodukter er plassert i henhold til subcellulære lokalisering. Bare direkte forbindelser (dvs. direkte fysisk kontakt mellom to molekyler) blant de enkelte genprodukter er vist for klarhets skyld; linjene indikerer protein-protein binding interaksjoner, og pilene se «handlinger på» interaksjoner som proteolyse, uttrykk og protein-DNA /RNA interaksjoner. Gener assosiert med epidermal utvikling (se tabell 3) er uthevet.
Tilleggs analyse av Gene ontologi med
GATHER
merknad verktøyet [63], på samme måte identifisert epidermal utvikling som en fremtredende komponent av transkriptomet av vanlige oppregulert gener i CIS og PC-lesjoner, i forhold til BE (figur S1 A, tabell S3).
nedregulert uttrykk endringer.
de fleste av kodene ned- regulert i CIS forhold til BE, ble funnet å være ofte nedregulert i PC-lesjoner (678 koder ut av 904 tags), og vice versa (678 koder ut av 912 koder nedregulert i PC forhold til BE) (figur 3A) .
