Abstract
DNA metylering er en epigenetisk fenomen kjent for å spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker. Enzym som er ansvarlig for denne prosessen er DNA metyltransferase 1 (DNMT1) som opprettholder et endret metylering mønster ved å kopiere den fra foreldre til datteren DNA-trådene etter replikering. Avvikende metylering av promotorområdene av gener kritiske for normale cellulære funksjoner er potensielt reversible. Derfor virker inaktivering av DNMT1 å være et verdifullt mål for utvikling av kreft terapi. For tiden er de mest populære DNMT inhibitorer (DNMTi) er cytidinanaloger som 5-azacytidin, 5-aza-2′-deoksycytidin (decitabine) og pyrimidin-2-on ribonukleosid (zebularine). I tykktarmskreft, epigenetiske modifikasjoner spille en viktig rolle på hvert trinn i kreftutvikling. Vi har derfor adressert den hypotese at DNA-metyltransferase-hemmere kan potensere hemmende effekter av klassiske kjemoterapeutiske midler, så som oksaliplatin og 5-fluorouracil (5-FU), som vanligvis brukes i kolorektal cancer terapi. Her viser rapporten at DNMTi kan ha positive interaksjoner med standard kjemoterapeutika i kolorektal kreft behandling. Ved hjelp av farmakologiske modeller for den legemiddelinteraksjon analyse, har vi vist at kombinasjonen av decitabine med 5-FU eller oksaliplatin viser den mest attraktive interaksjon (synergisme), mens effekten av zebularine i kombinasjon med kjemoterapeutiske midler er moderat, og kan være avhengig genetisk /epigenetisk bakgrunn av en cellelinje eller sekundær stoff som brukes i kombinasjon. Våre resultater tyder på at DNMTi administrert i kombinasjon med standard kjemoterapeutika kan forbedre behandlingen av pasienter med kolorektal kreft
Citation. Flis S, Gnyszka A, Flis K (2014) DNA metyltransferase hemmere forbedre effekten av kjemoterapeutika i SW48 og HT-29 tykktarmskreftceller. PLoS ONE 9 (3): e92305. doi: 10,1371 /journal.pone.0092305
Redaktør: Caterina Cinti, Institutt for klinisk fysiologi, c /o Toscana biovitenskap Foundation, Italia
mottatt: 18 oktober 2013; Godkjent: 20 februar 2014; Publisert: 27 mars 2014
Copyright: © 2014 Flis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskudds no. N405 139139 fra National Science Center of Poland (https://www.ncn.gov.pl/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest vanligste kreftformen i den røykfrie befolkningen over hele verden. Det er anslått at over 600 000 mennesker dør av det globalt hvert år [1]. Det betyr at kolorektal kreft er en ledende årsak til kreft dødsfall. Dessverre, CRC utvikler for en lang tid uten noen symptomer; derfor sykdommen er bokført med avanserte stadier. Generelt er risikoen for CRC øker med alderen og er forårsaket ikke bare av genetiske endringer som involverer onkogener og tumorsuppressorgener, men er også drevet av epigenetiske forandringer som involverer endringer i genekspresjon mønstre, som ikke er avhengig av endringer i DNA-sekvensen. En av de epigenetiske hendelsene er forårsaket av DNA-metyltransferaser (DNMTs), som katalyserer den kovalente tilsetning av metylgruppen til 5′-posisjonen av cytosin i CpG dinukleotidet fra donor
S-adenosylmetionin
. Cytosin metylering oppstår i genomiske regioner kalt CpG øyer og det er kjent for å endre kromatinstruktur fører til genet demping. Under kolorektal kreft progresjon, er en global genom demetylering kombinert med selektiv hypermethylation av tumordempere, cellesyklus regulatorer og proapoptotiske gener observert [2]. Fordi epigenetiske modifikasjoner er potensielt reversible, utgjør de en interessant terapeutisk strategi med bruk av DNMT hemmere (DNMTi).
Decitabine og zebularine er DNMT hemmere, som potensielt kan reversere epigenetiske forandringer resulterer i reaktivering av forstummet gener, blokkerer kreft celleproliferasjon og /eller indusere apoptose [3], [4]. Begge agentene ser ut til å være svært interessant og verdifull for behandling av solide svulster. Decitabine, en cytidine analog, har blitt godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for behandling av hematologiske maligniteter [5], mens zebularine i forhold til andre cytidin analoger er mer stabil, mindre giftig og kan administreres oralt [6 ].
Det synes å være rimelig å benytte demethylating midler i kombinasjon med kjemoterapeutiske midler. Interessant, ble oppmuntrende resultater oppnådd med kombinasjon av decitabine og karboplatin hos pasienter med solide tumorer [7]. Forfatterne konkluderte med at decitabine kombinerer trygt med karboplatin og at diett forårsaker epigenetiske endringer. I en annen fase I-studie, en kombinasjon av cisplatin med decitabine resulterte i en delvis respons hos pasienter med kreft i livmorhalsen og to mindre reaksjoner: en i pasient med ikke-småcellet lungekreft, og den andre i pasienter med kreft i livmorhalsen [8]. Men til tross for bevislinjer som indikerer at demethylating agenter kan forbedre anticancer aktivitet av klassiske kjemoterapeutika, er kunnskapen for å bruke dem for solide svulster fortsatt utilstrekkelig og må vurderes nærmere.
Derfor, for å teste denne hypotesen, CRC cellelinje overlevelse modellen ble valgt å studere disse interaksjonene. Ved hjelp av denne modellen, og farmakologiske analyser har vi designet studie for å finne ut resultatet av samspillet mellom DNMT hemmere, decitabine eller zebularine, og klassiske kreft kjemoterapeutika brukes i behandling av CRC som oksaliplatin, et internasjonalt og intra- DNA-kryss-bindingsmiddel, og 5-fluorouracil, en thymidylat syntase inhibitor. Studiene av interaksjoner mellom kjemoterapeutika og DNMTi midler synes å være fornuftig, fordi alle disse forbindelsene har blitt testet for sine cytotoksiske egenskaper mot normale celler [5], [9], [10] og alle av dem unntatt zebularine er godkjent av amerikanske FDA for medisinsk bruk.
Materialer og metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
Som en modell av tykktarmskreftceller, HT-29 og SW48 menneskelige tykktarmskreftcelle linjer, oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), ble anvendt. Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Paisley, UK) supplert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS, Gibco), 2 mM Glutamax (Gibco), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 250 ng /ml amphoterycin (Gibco) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inkludert 5% CO
2. Cellene ble inkubert med legemidler for 24, 48 og 72 timer, men bare resultater observert etter 72 timer behandling presenteres som deres positive bli mer uttalt.
Drugs
Følgende legemidler ble studert : 5-fluorouracil (5-FU), oksaliplatin, zebularine og decitabine (Sigma, St. Louis, MI, USA). Konsentrasjonene av medikamentene var i området opp til 100 uM. Alle midler ble oppløst i dimetylsulfoksyd Hybri-Max (DMSO, Sigma) og deretter fortynnet i media for eksperimenter. Den endelige konsentrasjonen av DMSO, uten å påvirke celleoverlevelse, ble opprettholdt på 0,2%. I alle eksperimenter ble kontrollcellene inkubert med DMSO.
MTT-analysen
analysen er avhengig av evnen til levedyktige celler til metabolsk redusere et gult tetrazoliumsalt til et purpurfarvet formazan produkt. Denne reaksjonen krever aktive mitokondrielle reduktaseenzymer.
Celler ble dyrket i 96-brønners plater (1 x 10
4 celler /200 ul /brønn). Etter inkubasjon med reagensene, ble mediet fjernet og cellene ble behandlet med 50 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid løsning (MTT, Sigma) i 4 timer ved 37 ° C. Deretter ble 150 ul av solubilisering-løsning (10% natriumdodecylsulfat, SDS) tilsatt og blandingen ble inkubert ved 37 ° C over natten. Den oppløste formazanprodukt ble spektrofotometrisk kvantifisert ved hjelp av en mikrotiterplate leser, Strøm Wave XS (Bio-Tek, Winooski, VT, USA), ved 570 nm bølgelengde.
Analyse av legemiddelinteraksjoner
Celler av SW48 og HT-29 cellelinjer ble samtidig inkubert i 72 timer med kjemoterapeutika og DNMT hemmere eller med hvert middel alene. Naturen av interaksjoner mellom legemidler studert ble analysert ved hjelp av izobologram [11] og kombinasjon-indeks (CI) metoder, avledet fra median-effekt prinsippet om Chou og Talalay [12], [13]. De hentet fra cytotoksisitetstester eksperimenter data ble brukt for matematiske og kvantitativ evaluering av legemiddelinteraksjoner.
Isoboles ble definert av effekter av sammenkoblede narkotika studert. Virkningene som oppnås ved halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) av hvert av legemidlene i paret dannet grunnlaget for additivitet linje; synergisme eller antagonisme var til stede, da den samme virkning ble oppnådd ved en kombinasjon av legemidler i lavere eller høyere doser, henholdsvis.
En kommersiell programvarepakke, CalcuSyn ver. 2.0 (Biosoft, Cambridge, Storbritannia), ble brukt for median-effekt analyse. Vi beregnet CI verdier basert på formelen: CI = (D)
1 /(D
x)
1 + (D)
2 /(D
x)
2 for gjensidig utelukkende narkotika. I nevneren, (D
x) er for D
1 «alene» som hemmer et system
x
%, og (D
x)
2 er for D
2 «alene» som hemmer et system
x
%. I numerators, (D)
1 + (D)
2 «i kombinasjon» også hemme
x
%. CI-verdier ble samlet ved forskjellige effektnivåer (Fa, den påvirkes av D fraksjonen, det vil si prosentvis hemming /100) fra 0,05 til 0,95 (5-95% celledrap). Synergi er indikert med CI-verdier mindre enn 1, additivitet av CI-verdier = 1 og antagonisme av CI verdier . 1
Strømningscytometri-analyse
For cellesyklusanalyse cellene (~ 1 x 10
6) ble suspendert i 4 ml av 80% etanol (-20 ° C) og inkuberes ved -20 ° C i 24 timer, vasket to ganger i fosfat-bufret saltvann (PBS), og farget med 50 ug /ml propidiumjodid (PI) og 100 ug /ml RNase i 0,1% oppløsning PBST (PBS supplert med 0,1% Triton X-100) i 30 min i mørke ved 4 ° C. Prøvene ble deretter målt ved anvendelse av en BD FACSCalibure strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). DNA-histogrammer ble analysert ved hjelp ModFit programvare (BD Biosciences).
Apoptose av cellene ble målt i henhold til produsentens instruksjoner, ved hjelp av et annexin V-FITC kit (BD Biosciences). Cellene ble samlet opp etter behandling, ble vasket to ganger med PBS og sentrifugert. Cellepelleten ble resuspendert i iskald bindingsbuffer. De annexin V-FITC og PI-løsningene ble tilsatt til cellesuspensjonen og blandet forsiktig. Prøvene ble så inkubert i 15 minutter i mørke omgivelser før strømningscytometri-analyse.
For immunofluorescerende farging ble cellene fiksert i 1,5% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur (RT) og permeabilisert med kald metanol i 20 min ved 4 ° C. Etter vasking ble cellene inkubert med ønske primært antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) mot fosfo-ATR [(P) -Ser428, Cat. No. 2853] og fosfor-ATM [(P) -Ser1981, Cat. No. 5883] ved 1: 100 fortynning i 0,5% BSA /PBS i 1 time ved RT. Etter vasking med PBS, ble passende sekundært antistoff konjugert med FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) tilsatt ved 1: 500 fortynning i 0,5% BSA /PBS og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vask, ble cellene analysert ved flowcytometri.
For alle applikasjoner 10.000 hendelser per prøve ble analysert ved fluorescens-aktivert celle sortering (FACS).
Semi-kvantitativ RT-PCR
de mRNA nivåer av
CCNE1
,
ATM Hotell og
GAPDH
ble analysert ved RT-PCR ved hjelp av total RNA fra HT-29 og SW48 celler isolert ved hjelp av GenElute ™ pattedyr Total RNA Miniprep Kit (Sigma) som beskrevet av produsenten. Ett hundre ng av total RNA ble anvendt i revers transkripsjonsreaksjon med Omniscript revers transkriptase (Qiagen, Hilden, Tyskland) og oligo (dT)
18 primer (Fermentas, Vilnius). PCR presiseringer ble utført i en 50 pl totalvolum i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 3 pl av cDNA som en mal og følgende primere par:
CCNE1 plakater (5′-AACTCAACGTGCAAGCCTCG-3 «, 5′-CATCTCCTGAACAAGCTCCA-3»),
ATM plakater (5′-GCCTTGAGTCTGTGTATTCG-3 «, 5′-CCACTCAGAGACTCCACAGC-3») og
GAPDH plakater (5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3- «, 5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3»).
GAPDH
mRNA nivåer ble brukt som intern kontroll. De amplifiserte fragmentene ble separert på 2% agarosegeler, farget med etidiumbromid og fotografert under UV-lys.
Fremstilling av protein-lysater og Western blotting
Cellene ble vasket med kald PBS-buffer og deretter proteiner fra fem cellulære avdelinger ble isolert ved hjelp av subcellulære Protein og fraksjonering Kit for dyrkede celler (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinkonsentrasjonen i prøvene ble målt ved anvendelse av BCA proteinanalysesett (Pierce). Prøver inneholdende 60 ug protein ble denaturert og fraksjonert med 7, 12 eller 15% SDS-PAGE. Etter elektroforese ble proteinene overført på en nitrocellulosemembran og probet med anti-humane antistoffer som er spesifikke til: cyclin A1 og D1, PARP, caspase-3 og -8 (Santa Cruz Biotechnology); (. Cat No. 610982, BD Biosciences) p21 (. Cat No. 554228), p53 (. Cat No. 610183), Bax; β-aktin (. Cat No. A1978, Sigma); og DNA Damage Antistoff Sampler Kit (fosfor-Chk1 [(P) -Ser296], fosfor-Chk2 [(P) -Thr68], fosfor-histon H2A.X [γH2A.X, (P) -Ser139], fosfo p53 [(P) -Ser15], og fosfor-BRCA1 [(P) -Ser1524];. Cat No. 9947, Cell Signaling Technology). Alle antistoffer i DNA Damage Antistoff Sampler Kit gjenkjenne sine mål proteiner bare når endret på de angitte områder. Derfor antistoffer mot umodifiserte proteinene ble ikke brukt.
Anti-Bax antistoffet gjenkjenner menneskelige Bax-α form. En alternativ spleising av pre-mRNA Bax produserer integral membranform Bax-α og de to cytosoliske formene ß og γ. Dette antistoffet er anbefalt av BD selskap for påvisning av apoptose. Anti-p53 antistoffet gjenkjenner den C-terminale område av proteinet (den 195-393 A.A. ble brukt som et antigen) og er i stand til å gjenkjenne både villtype og R273H former av p53. Dette antistoffet er også anbefalt av BD selskap for deteksjon av apoptose.
Signalet på blotter ble oppdaget av en kolorimetrisk metode med CN /DAB Substrat Kit (Pierce) og SignalBoost immunoreaksjon Enhancer Kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA).
Mitokondriell membranpotensialet (ΔΨ
m) måling
Δ
Ψ
m
ble målt ved flowcytometri å bruke 10 mg /ml 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolo- carbocyanine jodid (JC-1 fargestoff, Sigma), som flekker mitokondrier i levende celler. I friske celler, akkumulerer fargestoff i mitokondriene og danner aggregater som avgir rød fluorescens, mens i apoptotiske celler fargestoffet forblir i monomer form i cytoplasma og avgir grønn fluorescens. Cellene ble behandlet med kjemoterapeutika, DNMT hemmere eller deres kombinasjoner for 72 timer og farget som beskrevet av Mahyar-Roemer
et al.
[14] og deretter undersøkt av FACSCalibure strømningscytometer. Mitokondrier inneholder røde JC-1 aggregater i friske celler kunne påvises i FL2 kanal, mens grønne JC-1 monomere i apoptotiske celler påvises i FL1 kanal.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt verdier ± SD. Statistiske sammenligninger mellom grupper ble utført ved t-test eller enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey
post hoc
test. Betydning ble antatt på
P
0.05 (merket med stjerne på grafer).
Resultater
Vekst studier og effekter av kombinasjonsbehandlinger kjemoterapeutika med DNMTi
Som første skritt, undersøkte vi effekten av agenter brukes alene på SW48 og HT-29 celle levedyktighet. Cellene ble behandlet med 10 til 100 uM av de evaluerte midler. Resultatene av MTT-cellelevedyktighet analyse indikerte at CRC-celler inkubert med oksaliplatin og 5-FU viste den mest potente inhibering av cellevekst etter 72 timers inkubasjonstid (figur 1). De inhiberende virkninger av kjemoterapeutika var doseavhengig og korrelasjonskoeffisientene (estimert fra de inhiberende dose-respons-kurver) var over 0,9. Demethylating agenter, decitabine og zebularine, har demonstrert forskjellige moduser av hemming. Decitabine var allerede hemmende på startkonsentrasjon (20 mm) og zebularine viste hemmende effekt fra 80 og 40 mikrometer for SW48 og HT-29 celler, henholdsvis
cellene ble behandlet enkeltvis eller i kombinasjoner med de som er oppført doser av midlene for 72; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabine; og ZEB, zebularine. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 5), stjerner indikerer en betydning på
P
. 0,05 for sammenligning med oksaliplatin eller 5-FU alene
Vi testet også behandling av kjemoterapeutiske midler i kombinasjon med DNMTi på CRC-celler overlevelse (figur 1). Decitabine forsterkes de inhiberende virkninger av oksaliplatin i en konsentrasjon fra 20 uM til 100 uM, mens dens effekt på 5-FU aktiviteten starter ved 80 pM. Zebularine testet ved konsentrasjoner opp til 100 mikrometer litt forsterkes de hemmende effektene av enten kjemoterapeutika (figur 1).
Den type interaksjoner av to evaluert sammensatte grupper ble analysert ved hjelp av isobolographic og median effekt metoder. De isobologrammer viser resultater for enkelt 50% effektnivå og indikerer at interaksjonen mellom decitabine med kjemoterapeutika resultater i synergistisk effekt, mens administrasjon av zebularine med oksaliplatin eller 5-FU medfører synergi eller litt additive effekter (figur 2A).
A. Isobologrammer på en 50% effektnivå. Konsentrasjoner av bestemte legemidler er angitt på x-og y-aksen. De isobologrammer ble konstruert ved å koble IC
50 verdier av demethylating agenter (på ordinaten) med IC
50 av oksaliplatin eller 5-FU plottet på abscissen. Når doser av to midler i kombinasjon er lavere eller høyere enn de additive doser ble synergi eller antagonisme er tilstede, henholdsvis. B. Kombinasjon indeksverdier (CI) med 95% konfidensintervall på alle effektnivåer som er beregnet av CalcuSyn programvare. En CI-verdi betydelig mindre enn 1 indikerer synergi, en CI-verdi ubetydelig forskjellig fra 1 indikerer tilsetning, og en CI betydelig høyere enn 1 indikerer antagonisme.
Analyse utført ved hjelp av median-effekt metode bekreftet at den kombinasjonen av decitabine og kjemoterapeutika i begge cellelinjene produsert synergieffekter på 50% celleavlivingen nivå (Fa = 0,5), oppnå CI (kombinasjon Index) verdier 0.9 (figur 2B).
Kombinasjon av zebularine og kjemoterapeutika for Fa = 0,5 indikerte små synergi eller additive effekter.
Analyse av DNA-skader
For å belyse mekanismen av apoptose vi analyserte fosforylering status av proteiner som er av store signalsjekkpunkter som svar på DNA-skade.
Ved å registrere DNA-skade, rekke cellulære signal hendelser for å bevare integriteten og riktig funksjon av celler og biologiske trasé er involvert. Proteinene valgt for testing ved Western blotting initiere kaskader av hendelser som blokkerer cellesyklusprogresjon enten for å gi tid til å reparere skadet DNA eller aktivere celledødsveier hvis for mye skade har blitt påført. Fosforylert histone H2A.X lokaliserer til områder av DNA-skader og aktiverer ATM /ATR kinaser, de sentrale formidlere av DNA skade respons. I sin tur, ATM /ATR kinaser initiere kaskader, som hemmer progresjon i mitose gjennom aktivering av Chk kinaser (Chk1 for ATR og Chk2 for ATM) eller tumor suppressor protein p53, som fører til enten cellesyklus arrest og DNA-reparasjon eller apoptose gjennom regulering av p53 nedstrøms effektorer. BRCA1, som vokteren av genomisk stabilitet, er også fosforylert av ATM, ATR, og Chk2 som svar på DNA-skade og kan co-lokalisere med andre proteiner ved DNA skadesteder [15].
Vi har observert en betydelig fosforylering av histon H2A.X ved Ser139 i respons til kjemoterapeutiske midler og deres kombinasjoner med DNMTi, særlig i HT-29 celler. Lavere nivåer av γH2A.X (fosfo-H2A.X) ble observert i celler behandlet med DNMTi midler bare. Vi observerte også forhøyede nivåer av fosforylering av proteiner som ATR ved Ser428, ATM ved Ser1981, p53 ved Ser15, BRCA1 ved Ser1524 samt kinaser Chk1 og Chk2 på Ser345 og Thr68, henholdsvis (figur 3A og B). Fosforylering status av kinaser Chk1 og Chk2 var mer uttalt hos HT-29 da i SW48 celler. I SW48-celler, fosforylering nivåer av Chk1 og Chk2 kinaser var høyere etter den kombinerte behandling med oxaliplain og decitabine sammenlignet med behandling med både kjemoterapeutika og DNMTi anvendt alene (figur 3B).
A. Kvantifisering av ATR og ATM-fosforylering nivå etter 72 (MFI) ble anvendt. Data representert gjennomsnitt ± SD (n = 3). Signifikant forskjell på
P
≤0.05 er merket med en stjerne (*). B. Analyse av proteinfosforylering nivåer med Western blotting metode. Påvisningen av β-aktin ble benyttet som en gel lastekontroll. OXA, oksaliplatin; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabine; ZEB, zebularine; au, vilkårlige enheter.
Kombinasjoner av kjemoterapeutika med DNMTi påvirke cellesyklusprogresjon og indusere apoptose
I kontrollkulturen, prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen var stabile, mens de testede forbindelser hadde forskjellige virkninger på cellesyklusprogresjon og apoptose. Behandling med kjemoterapeutika resulterte i en konsekvent økning i antallet av celler i S-fasen på bekostning av G1 fase. Decitabine arrestert cellesyklus i G2 /M eller S-fasen i SW48 og HT-29-celler, respektivt. Zebularine ikke utøve statistisk signifikante endringer i begge cellelinjer, sammenlignet med kontrollene.
Kombinasjonen av decitabine med oksaliplatin eller 5-FU-indusert cellesyklus-stans i S /G2 /M fasegrensen og i S-fasen, henholdsvis i begge cellelinjer (figur 4). Kombinasjonen av zebularine med oksaliplatin økt prosentandel av HT-29-celler ved S /G2 /M fase grense, mens kombinasjonen av zebularine med 5-FU økt prosentandel av disse celler i S-fasen fra 12% til 36% sammenlignet med kontroll. I tilfelle av de SW48 celler, kombinasjoner av zebularine med kjemoterapeutika forårsaket arrest av celler i G2 /M eller S-fasen (Figur 4A).
A. Endringer i cellesyklusfordelingen av SW48 og HT-29-celler etter 72 timers behandling med de evaluerte midler. Cellene ble farget med propidiumjodid (PI) og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved anvendelse ModFit LT ™ (versjon 3.0). Hver søyle representerer middelverdien ± S.D. (N≥4). Signifikant forskjell i
P
0,05 er angitt med stjerne (*). B. Analyse av
CCNE1 Hotell og
ATM
mRNA nivåer av semi-kvantitativ RT-PCR-metoden etter 72 timers inkubering av CRC celler med kjemoterapeutika, DNMTi og deres kombinasjoner ved konsentrasjoner som angitt. M, men da [bp];
GAPDH
, transkript som koder glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, et konstitutivt uttrykt gen, anvendt som en intern kontroll. C. Western blotting-analyse av cellesyklusregulerende proteiner. Den β-aktin ble benyttet som en gel lastekontroll. OXA, oksaliplatin; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabine; ZEB, zebularine.
analyse av genuttrykk viste at kombinasjonen av decitabine med oksaliplatin, sammenlignet med oksaliplatin alene, økt mRNA nivå av
ATM
i begge cellelinjer så vel som
CCNE1
i SW48 cellelinje (figur 4B). Kombinasjoner av demethylating midler med 5-FU viste en lignende tendens, men på et lavere nivå enn de kombinasjoner med oxaliplatin. Analysen av proteiner som er spesifikke for cellesyklusprogresjon viste at kombinasjonen av DNMTi med kjemoterapeutika, sammenlignet med oksaliplatin /5-FU alene, økt nivå av cyclin A1 og protein p53 og redusert nivå av Cyclin D1 (men ikke i SW48 -celler) (figur 4C og 5B). Kombinasjonen av zebularine med kjemoterapeutika økt nivå av p21 i SW48-celler (figur 4C).
A. Påvisning av apoptose med annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) /porpidium jodid (PI) analyse. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. (N≥4). En stjerne (*) indikerer at induksjon av apoptose av de evaluerte midler var signifikant sammenliknet med kombinasjonen av kjemoterapeutiske midler og DNMT inhibitorer
versus
kjemoterapeutiske midler anvendt alene (
P
0,05 ). B. Western blotting-analyse av pro-apoptotiske proteinnivåer. Den β-aktin ble benyttet som en gel lastekontroll. C. Representative cytogrammene av flowcytometri eksperimenter som viser endringer i Δ
Ψ
m
i CRC cellelinjer etter 72 timers inkubasjon med kjemoterapeutika, DNMT hemmere og kombinasjoner. Cellene ble farget med JC-1. Cellene i R2 kvadranten ble regnet som celler fratatt mitokondriemembranen potensial. En stjerne (*) viser en signifikant forskjell mellom forsøksgruppene og kontrollgruppen på
P
0,05. OXA, oksaliplatin; 5-FU, 5-fluorouracil; DAC, decitabine; ZEB, zebularine.
Siden langvarig behandling med kjemoterapeutika eller DNMTi kan indusere celledød, tidlig apoptotisk markør ble derfor analysert. For dette formål brukte vi annexin V, som gjenkjenner fosfatidylserin (PS). I løpet av induksjon av apoptose, blir membranen asymmetri tapt og translokasjon av PS fra intracellulær til ytre paknings av plasmamembranen finner sted. Som vi forventet, behandling av CRC-celler med oksaliplatin eller 5-FU alene induserte apoptose i ~ 30% av cellene, mens en kombinasjon av de evaluerte midler generelt økt antall av apoptotiske celler fra ~45% til 60% (figur 5A ) med unntak av HT-29 celler inkubert med demethylating midler og oksaliplatin sammen. I dette tilfelle induksjon av apoptose var ved et lavere nivå enn for andre kombinasjoner, men fremdeles statistisk signifikant sammenlignet med oksaliplatin anvendt alene. I tillegg ble induksjon av apoptose i CRC-cellene ved kombinasjon av kjemoterapeutiske midler med demethylating bekreftet av endringer på proteinnivået av pro-kaspase-3 og -8. Den proteolytisk spalting av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) ble utvidet etter inkubasjon av celler med kjemoterapeutika og demethylating midler (figur 5B).
Endringene i mitokondriemembranen potensial (ΔΨ
m)
i løpet av tidlig apoptose avbrudd av mitokondriemembranen potensial Δ
Ψ
m
kan oppstå som resulterer i rask kollaps av den elektrokjemiske gradient. I dette arbeidet, vi utforsket effekten av DNMTi, kjemoterapeutika eller kombinasjoner på Δ
Ψ
m
ved farging av cellene med JC-1 fargestoff. Analysen av cytogrammene viste at kontrollceller slippes den røde fluorescens på grunn av høy Δ
Ψ
m
, mens cellene behandlet med kjemoterapeutika og DNMTi agenter utstilt økt membran depolarisering, oppdaget av grønn fluorescens, og effekten ble opprettholdt (oksaliplatin + DNMTi i HT-29 cellelinje) eller sterkere når cellene ble inkubert sammen med disse stoffene (figur 5C).
Diskusjoner
på 90-tallet har det blitt bekreftet at CRC ikke bare resulterer fra akkumuleringen av genetiske mutasjoner, men også som følge av epigenetiske forandringer av den cellulære genomet som transformerer en normal kjertel epitel til adenocarcinoma. Det er vel etablert at den mest omfattende karakterisert epigenetisk endring i CRC er genpromoter hypermethylation, som forekommer i CpG øyer som ofte er tilstede ved 5 «region på omtrent 60% av genene. Dette fenomenet resultat av den økte aktiviteten av DNMT enzym hvis overekspresjon er et kjennetegn på nesten alle de transformerte celler [16]. Et økende antall gener som er uttrykt i tykktarmen har nå vist seg å være hypermethylated og brakt til taushet i tykk- og endetarmskreft. Disse inkluderer gener som er involvert i cellesykluskontroll, vekst, differensiering, angiogenese, adhesjon, metastase eller DNA-reparasjon [17]. Siden epigenetiske modifikasjoner er potensielt reversible, ble ideen oppstått at ansettelse av DNMT hemmere kan forbedre behandlingen av CRC, spesielt siden de klassiske kjemoterapeutika er av begrenset effektivitet i kolorektal kreft behandling. Derfor er utvikling av noen nye strategier for behandling av slike tumorer er en utfordring å onkologi [18]. Det er derfor vi har presentert resultatene av
in vitro
studie vedrørende interaksjoner av standard cytotoksiske medikamenter, 5-FU og oxaliplatin [19], med DNA metyltransferase hemmere (DNMTi) som decitabine og zebularine.
DNMTis har nylig fått mye oppmerksomhet som medikamenter som hemmer kreft vekst og endetarmskreft [20]. Imidlertid kan rollen deres terapeutiske potensialet være skikkelig evaluert bare i kombinasjon med klassiske midler som brukes i CRC behandling, fordi alle nye terapeutiske midler er innført som add-on opsjoner. Siden 5-fluorouracil og oksaliplatin utgjøre ryggraden behandling av CRC [19] undersøkte vi effekten på CRC celler overlevelse legge decitabine eller zebularine – DNA metyltransferase hemmere – til disse kjemoterapeutika
Vi har fått bekreftet under
in vitro
forhold som de studerte midler gitt alene er i stand til å indusere vekst inhibering av kreftceller med tilsvarende størrelsesorden potens beregnet på basis av prosentandelen av celleoverlevelse (figur 1). Videre har vi funnet en økt hemming av CRC-celler vekst etter behandling med anticancermidler anvendes i kombinasjon (figur 1). De isobologrammer, bygget på basis av IC
50-verdier, er angitt synergistiske eller additive interaksjoner mellom kjemoterapeutika og DNMTi midler. Decitabine hadde de mest fordelaktige interaksjoner (synergi) i kombinasjon med kjemoterapeutika i begge cellelinjer;
