Abstract
bortezomib /PS-341 /VELCADE, en proteasominhibitor, er mye brukt til behandle myelomatose. Mens flere mekanismer av cytotoksisitet av stoffet ble foreslått, forblir selve mekanismen unnvikende. Vi forsøkte å identifisere gener som påvirker cytotoksisitet av bortezomib i fisjons gjær
S.pombe
som stoffet hemmer denne organismen celledeling syklus som proteasomer mutanter. Blant de 2815 gener skjermede (som dekker 56% av totale ORF), 19 gener, hvis strykninger indusere sterk syntetisk dødelighet med bortezomib, ble identifisert. Produktene av de 19 gener inkludert fire ubiquitin enzymer og en nukleær proteasom-faktor, og 13 av dem er konservert hos mennesker. Resultatene vil gi nyttig informasjon for å forstå handlingene til bortezomib i cellene
Citation. Takeda K, Mori A, Yanagida M (2011) Identifisering av gener som påvirker Toxicity of Anti-Cancer Drug bortezomib av Genome-Wide screening i
S. pombe
. PLoS ONE 6 (7): e22021. doi: 10,1371 /journal.pone.0022021
Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA
mottatt: 16 mars 2011; Godkjent: 12 juni 2011; Publisert: 08.07.2011
Copyright: © 2011 Takeda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. KT var finansielt støttet av forskningsstipend fra Astellas Fondet for forsknings på metabolske forstyrrelser (https://www.astellas.com/jp/byoutai/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ubiquitin /proteasome veien er en stor proteolytisk maskiner i celler og har sentrale roller i celledeling syklus, apoptose, etc [1]. Derfor er denne veien anses for å være en sterk potensielt mål for klinisk behandling av sykdommer så som kreft, og kjemikalier som modulerer aktiviteten til ubiquitin /proteasom-reaksjonsveien er blitt intensivt undersøkt [2], [3]. Bortezomib /PS-341 /VELCADE er et peptid borsyre som hemmer chymotypsinlignende aktiviteten i beta 5 subenhet av proteasome
in vitro
. Bortezomib har sterke potensielle anti-svulst effekter i
in vitro Kjøpe og dyrestudier og har blitt utviklet som en anti-kreft stoffet til å behandle multippel myelom og andre kreftformer [3], [4]. Hemme proteasome fører pleiotrope effekter. Derfor har flere mekanismer for cytotoksisiteten av bortezomib blitt foreslått, for eksempel inhibering av anti-apoptotiske proteiner, stabilisering av p53, forstyrrelse av cellesyklusprogresjon, etc [5]. For å øke kunnskapen om mekanismene for anti-tumor og bivirkninger av bortezomib, vil det være gunstig å identifisere gener som involverer i cytotoksisitet av dette stoffet. En pioner innsats for å identifisere slike gener ble rapportert av Lightcap gruppen i 2010 [6].
fisjons gjær
Schizosaccharomyces pombe
er en enkel encellede eukaryote og har vært brukt som modellorganisme av grunnleggende cellebiologi, på grunn av dens genetiske tractability og dets likhet til høyere eukaryoter. Et bibliotek av 2815 gen-slettet stammer er tilgjengelig for genom-wide studier av narkotika følsomhet [7], [8], [9].
Her har vi forsøkt å identifisere evolutionally konserverte gener som påvirker cytotoksisitet av bortezomib ved å dra nytte av biblioteket gen-sletting i
S. pombe Hotell og etablert en metode for å utføre genom-wide syntetisk dødelig screening med bortezomib. Blant de 2815 gener skjermede, sletting stammer av 19 gener hadde sterk syntetisk dødelighet med bortezomib (slike gener ble heretter betegnet som syntetisk dødelig med bortezomib, SLB). Av de 19 SLB gener, er 13 konservert fra gjær til mennesker og inkludere faktorer involvert i ubiquitin /proteasome avhengig proteolyse, kromatin stanse atom /cytoplasma transport, aminosyre og vitamin metabolismen, vesikulær menneskehandel, RNA metabolisme, etc.
Resultater
Mitotisk arrest og fiasko i kromosom segregering indusert av bortezomib
Vi fant at bortezomib (LC Laboratories) effektivt hemmet spredning av
S. pombe
, mens MG132, en autentisk proteasominhibitor i pattedyrceller hemmet ikke spredning (figur S1). Vi deretter undersøkt nivået av poly-ubiquitinmolekyler i nærvær eller fravær av bortezomib (figur S1). Log-fasekulturer ble høstet ved 0, 4 og 9 timer etter tilsetning av 1 mM bortezomib, og de totale proteinene ble ekstrahert for immunoblot-analyse. I nærvær av bortezomib, poly-ubiquitinmolekyler akkumulert i en tidsavhengig måte. Derfor konkluderte vi med at bortezomib hemmer effektivt cellulær proliferasjon og proteolytisk aktivitet av proteasome i
S. pombe
.
temperatursensitive mutanter proteasominhiberingens komponenter (
mts3-1
for Rpn12 av 19S regulatoriske partikkel og
mts2-1
for Rpt2 av 19S regulatoriske partikkel ) blir arrestert i M fase på grunn av hemmingen av degradering av mitotiske regulatorer som CDC13 (cyclin) [10], [11]. Dette funnet førte oss til å undersøke i detalj hvordan bortezomib påvirker cellesyklusen. Etter tilsetning bortezomib til mid log-fasekulturer, ble cellekonsentrasjon og levedyktighet målt over tid (figur 1A). Celleproliferasjon til slutt stanset og levedyktighet ble redusert til 21, 10, og 4,7% ved 4, 6 og 9 timer etter tilsetning av bortezomib. Uten bortezomib, cellene fortsatte å dele seg og vedvarende levedyktighet. For å undersøke hvordan cellesyklus ble påvirket av bortezomib, kromatin DNA, mikrotubuli, og spindel pol organer (SPB: homolog sentrosomen) ble visualisert ved grønn eller rød fluorescerende protein tagging til histon H2A (for kromatin), alfa-tubulin (microtuble) og Sid4 protein (SPB, gjær tilsvarende sentrosomen, vist som en prikk i figur 1C) respektivt. Forholdet mellom celler med over-kondenserte kromosomer og metafase spindlene var størst (30%) ved 1 time etter bortezomib tilsetning og deretter redusert (figur 1B og 1C-a). Som forholdet av metafase-celler redusert, forholdet mellom celler med en forskjøvet kjerne øket (figur 1C-b), hvori søsterkromatider ikke ble separert, og kjernen ble forskjøvet fra sentrum. Som forholdet mellom «ford kjerner «var høyest ved 4 timer og deretter redusert, anucleated celler og celler med en gigantisk kjerne øket (figur 1 B og C-c). Dette var sannsynligvis et resultat av cytokinese ferdigstillelse i celler med en forskjøvet kjerne. Derfor, i nærvær av bortezomib, celler ble raskt arrestert ved meta, ute av stand til å skille søster kromatider, og levedyktighet ble tapt. Disse fenotyper indusert av bortezomib er tilnærmet identisk med mitotiske feil forårsaket av
mts2-1
, den temperaturfølsom mutasjon i Rpt2 subenheten 19S partikkel [10]. I tilfelle av
mts3-1
mutasjon (Rpn12 av 19S), er meta arrest fenotype strengere; 75% av cellene er kort arrestert i metafase [11]. I begge tilfeller er metafase-hemning temporale og kjernen er forskjøvet i ettertid, som vist i tilfellet med behandling med bortezomib. Gitt at defekten i metafase /anaphase overgang skyldes inhibering av proteolyse, bør ubiquitinmolekyler substrater av proteasomet som CDC13 (cyclin) akkumulere [12]. For å undersøke dette, celler som uttrykte ectopically heksa-histidin (His6) -tagged ubiquitin ble fremstilt og dyrket i nærvær eller fravær av bortezomib i 4 timer ved 26 ° C. Proteinene ble deretter ekstrahert fra begge kulturer i henhold denaturerende betingelser med 6 M guanidin-HCl, og de resulterende ekstrakter ble anvendt til Talon kuler (Clontech) som absorberer His6-koden, for å rense de ubiquitinmolekyler-proteiner. TALON-rensede proteiner ble analysert ved immunblot hjelp av et antistoff mot CDC13 (figur 1D). I nærvær av bortezomib, ble fler ubiquitinated CDC13 observert, som rapportert i temperatursensitive mutanter av proteasomet [12]. Disse resultatene viste at en kjemisk inhibitor for proteasomet kan brukes til å erstatte de ts proteasomer mutanter. Dette stoffet kan være nyttig for å analysere fenotypene av proteasom-defekt ved en lav temperatur, for eksempel i meiose eller i de forsøk hvor varmesjokkresponser bør unngås. Derfor vedtok vi bortezomib for videre genetisk screening for å identifisere gener som påvirker proteasomal dysfunksjon fenotype.
(A) bortezomib (1 mm) hemmet celledeling. Konsentrasjoner av celler og viabilities er presentert. BZ: bortezomib (B) bortezomib (1 mm) hemmet normal progresjon av M fase. Grafen viser forholdet mellom celler med meta spindler og over-kondenserte kromosomer (blå, celler er vist i figur 1C-
en
), celler med en fortrenges kjerne (rød, figur 1C-
b
), celler uten en kjerne og med en gigantisk kjerne (oransje, figur 1C-
c
), og celler med kromosom revet av septum (grønn, figur 1C-
d
, og
e
). (C) Kromosomer, mikrotubuli, og SPB ble observert i nærvær av bortezomib. Celler som viser mitotiske abnormiteter korrespondent figur 2B er vist i a-e (øvre panel + BZ). Bilder fra normale progresjon av celledeling er vist i nedre panel (-BZ). Bar = 10 um (D) Poly-ubiquitinmolekyler cyclin /CDC13 akkumulert i nærvær av bortezomib. Se teksten for detaljer.
Proteasome relaterte mutanter er overfølsom mot bortezomib
I forkant av omfattende screening, undersøkte vi hvordan bortezomib cytotoksisitet påvirkes av mutasjoner knyttet til ubiquitin /proteasome system. Sammenlignet med villtype var fem proteasomer relatert mutanter som følger:
mts2-1
,
mts3-1
,
pts1-727 plakater (mutert i beta 5 underenhet av 20S komplekse [13]),
ump1-620 plakater (mutert i 20S modning faktor Ump1 [13]), og
Δcut8 plakater (gen-sletting mutant av
cut8
+
som kreves for riktig nukleær lokalisering av proteosomet [14], [15]). Hver stamme ble inkubert på en rik JA agar plate for å danne en koloni og deretter prikket inn agarskåler som inneholdt 0, 100, 250, eller 500 mikrometer bortezomib, assistert av en robot system (rotor, Singer, UK). Etter 3 dagers inkubering ved 26 ° C, ble kolonidannelse evne til hver flekk evaluert (figur 2A og B). Villtype dannet kolonier på alle platene, mens proteasomer relaterte mutanter var defekt i koloni-formasjon på bortezomib plater (
Δcut8
100 mikrometer og andre på 500 mikrometer). Den klare overfølsomhet for
Δcut8
til bortezomib ledet oss til å ta i bruk den ovenfor beskrevne metode for videre genome-wide screening av syntetiske dødelige mutanter med bortezomib.
(A) Strategi for syntetisk dødelig screening ( B) Mutanter av komponenter av ubiquitin /proteasome veien er overfølsomme for bortezomib. Åtte kolonier av hver stamme ble replika-platet på agarplater med forskjellige konsentrasjoner av bortezomib, og ble inkubert i 3 dager ved 26 ° C. (C) Sammendrag av syntetisk dødelig screening med bortezomib. Se teksten for detaljer. (D) Validering av isolerte mutanter som hadde vekst defekter i 100 mikrometer bortezomib ved å fange opp fem ganger serielle fortynninger av vegetative celler i vekst.
Genome-wide syntetisk-dødelig screening med bortezomib
for å identifisere gener som påvirker cytotoksisitet av bortezomib i
S. pombe
, skjermet vi 2815 gen-delesjonsmutanter for syntetisk veksthemming på YES agar plater med bortezomib bruker Robot-assistert kopiplate. Fra den primære screening, 59, 62, og 135 stammer ble isolert som hadde vekstdefekter i media med 100, 250, og 500 uM bortezomib, respektivt. Det var ingen entydig bortezomib-resistent mutant som vokste hurtigere enn villtypestammen på 500 pM bortezomib medium. En oppsummering av screening er vist i figur 2C (eksempler på rå Resultatene av den primære screening og listen av gener er vist i figur S2 og tabell S1). De 59 stammer som hadde vekst defekter med 100 mikrometer bortezomib ble testet på nytt ved å fange opp fem ganger serielle fortynninger av log-fase kulturer av hver stamme (fra 10 celler til 6250 celler) på YES plater med og uten bortezomib (figur 2D). Vi utførte disse retests i duplikat. Som et resultat av 19 gen-delesjonsmutanter viste reproduserbart vekstfeil på YES plater med 100 pM bortezomib. Sytten og 12 stammer viste vekst defekter med 250 og 500 mikrometer bortezomib, henholdsvis. Resten av mutantene viste ikke klare vekst defekter med bortezomib i spotting test. Ingen av mutanter testet på lavere doser (1 nM-10 mm) av bortezomib viste betydelige vekstforstyrrelser (Figur S3). Derfor vedtok vi en 100 mikrometer konsentrasjon av bortezomib for overfølsomhet screening av
S.pombe
mutanter i vår nåværende studie, men i den forrige og lignende studie på humane celler, en 4-7-nM konsentrasjon av bortezomib brukes til screening [6]
de 19 gener som viste klare vekstfeil på 100 mikrometer bortezomib plater i spotting test ble kategorisert etter funksjon. fem tilhørte ubiquitin /proteasome sti, fire til kjernefysiske /kromatin proteiner og kjernefysiske transport, tre til vesikulært trafikk, tre til aminosyrer og vitaminer metabolisme, tre til RNA metabolisme, og protein kinase A (tabell 1). Tabell 1 viser de systematiske navn, primærnavn (hvis aktuelt), spirende gjær
Saccharomyces cerevisiae Hotell og menneskelige ortologer, og en kort beskrivelse av hver SLB genet. Blant de 19 SLB gener, er 13 gener rapportert å ha potensielle ortologer hos mennesker.
Diskusjoner
I denne studien har vi demonstrert at bortezomib, en hemmer av proteasome mye brukt som en anti-kreft narkotika, hemmer effektivt spredning av
S.pombe Hotell og induserer mitotisk arrest samt temperaturfølsomme mutasjoner av proteasomal subenheter. Nitten genet delesjonsmutanter ble identifisert ved genomet-bred screening for å være syntetisk dødelig med bortezomib.
Til tross for den sterke virkning av bortezomib å stanse cellesyklus, en proteasominhibitor, MG132, hadde en svakere inhiberende virkninger på proliferasjon i den foreliggende undersøkelsen. MG132 er imidlertid rapportert å hemme protesome-avhengig proteolyse i cellelysatet av
S.pombe
, noe som indikerer at proteosomet av
S.pombe
er følsom for denne inhibitor [16]. I
S.cerevisiae
er MG132 brukes til å hemme proteolyse
in vivo
under genet sletting av PDR5, de store legemiddel efflukspumpen, som kan effektivt skille ut MG132 fra cellen [17].
S.pombe
besitter to PDR5 ortologer, Pdr1 og Bfr1. Forskjellen i virkningen av bortezomib og MG132 kan være på grunn av deres forskjeller i celle permeabilitet eller effekten av utskillelse av medikament efflux pumper. Bortezomib kan tjene som et nyttig verktøy for å studere ubiquitin /proteasome veien i
S.pombe
.
Vi utførte syntetisk-dødelige skjermen for å identifisere gener som påvirker følsomheten for bortezomib, ved hjelp av 2815 gen-sletting mutanter av
S. pombe
. Nitten delesjonsmutanter ble identifisert med alvorlige vekst defekter forårsaket av 100 mikrometer bortezomib (oppført i tabell 1 og figur 3). Fem av de ansvarlige genene (betegnet SLB) var ubiquitin /proteasome relaterte: pof3, cul3, mug30, ubp16 og cut8. Deres syntetisk dødelighet med bortezomib kan forklares gjennom stoffets hemmende virkning mot proteasome. For eksempel ubiquitin ligaser gi underlag for proteasome slik at avtagende både kan føre til alvorlige syntetiske effekter. Andre har ikke blitt rapportert å være relatert til proteasome funksjon. Men noen av SLB gener kan fortsatt forklares gjennom proteasomer funksjoner. For tre vesikulær menneskehandel SLB gener (sec28, ftp105, og ryh1), defekter i sekretoriske vei påberope ER (endoplasmatiske retikulum) stress som kan øke kravet til proteasome aktivitet [18]. En av vesikulær menneskehandel SLB gener, ftp105, koder Golgi lokalisering protein som ble rapportert til å samhandle med deubiquitinase Usp5 og være nødvendig for Golgi lokalisering av Usp5 [19]. Den menneskelige ortolog av Ftp105 er C17orf28 /DMC1 (nedregulert i flere kreftformer), en potensiell tumor suppressor [20]. Derfor vil den syntetiske dødelighet av ftp105 sletting med bortezomib studeres videre i fremtiden. Ryh1 ble nylig rapportert å regulere TORC 2 (target of rapamycin kompleks 2) i
S.pombe product: [21]. Når det gjelder atom SLB-proteiner, kan mer proteasomet være nødvendig når kromatin dynamikk er kompromittert i delesjonsmutanter av kromatin regulatorer, som den kjernefysiske proteasomet er kjent for å bidra til kromatin forskrifter som DNA-skade reparasjon, DNA-replikasjon og transkripsjon [15], [22 ], [23], [24]. En av kjernefysiske SLB genprodukter er Rik1, en komponent av CLRK ubiquitin ligase kompleks nødvendig for kromatin stanse [25], [26]. Selv substrater av CLRK ubiquitin ligase ikke er kjent, kan det være en nysgjerrig eksperiment for å undersøke om bortezomib påvirker DNA kromatin lyddemping. PKA ble rapportert å være involvert i metafase /anaphase regelverk i fisjons gjær og i Xenopus-egg systemer
in vitro product: [12], [27], [28]. Selv om noen av de andre SLB gener, slik som vitamin metabolske faktorer, er vanskelige å bli forklart, kan de blir innblandet i en av svært forskjellige cellulære funksjoner av proteasomet. Bortezomib kan muligens ha andre enn proteasome innenfor cellene i
S mål. pombe
. Dermed evaluering av SLB gener tilsynelatende ikke er relatert til ubiquitin /proteasome kan være verdt for å vurdere andre mål. Kombinasjonen av SLB-genet delesjon og proteasomal temperaturfølsomme mutasjoner vil være nyttig for å bedømme hvorvidt det syntetiske letalitet er grunnet hemming av proteasomet eller til andre forstyrrelser forårsaket av bortezomib. Hvis den syntetiske letalitet er grunnet hemming av proteosomet, blir den doble mutant av de SLB-genet og proteasomet forventes å vise en mye strengere fenotype enn en enkelt proteasomal mutant. Egentlig en mutant av
cut8
, en SLB genet, viser syntetisk dødelighet til proteasomal mutasjoner
mts2-1 Hotell og
mts3-1 product: [14]. Selv om det bør holdes i bakhodet at bortezomib har et annet mål, de foreliggende resultatene har potensielt viktige implikasjoner for grunnleggende proteasome biologi ved å åpne veier for å oppdage nye og uventede sammenhenger mellom proteasome og andre cellulære veier. En tilsvarende genom-widescreen i humane celler foreslått at protein oversettelser, ER /Golgi reaksjonsvei, DNA-skade reparasjon reaksjonsveien, og regulering av Myc og polyaminer er involvert i bortezomib-indusert celledød [6]. Funnene i denne studien nylig tyder på at gener involvert i vitamin og aminosyre metabolske veier, kromatin lyddemping, kjerne /cytoplasma skytteltrafikk, og leiren veien er knyttet til proteasome i fisjon gjær
S.pombe
. Derfor må videre gjøres en innsats for å forstå mekanismene for den syntetiske dødelighet av disse uventede SLB gendelesjoner med bortezomib.
Tretten konservert SLB genene er vist i rødt.
Vi identifiserte 13 konserverte SLB gener potensielt interessante for videre studier. Som nevnt i resultatene, 4 til 7 nM av bortezomib ble brukt til skjerm gener som påvirker cytotoksisitet av bortezomib i kreftcellelinjer, og 100 mikrometer av bortezomib ble brukt for
S.pombe
mutant screening i denne studien . Forskjellen i bortezomib følsomhet kan gjenspeiler forskjellen i biologien av disse organismene, slik som medikament og medikament permeabilitet utskillelse. Generelt, gjærceller er mer resistente overfor perturbasjoner av kjemiske inhibitorer. Derfor bør menneskerettighets ortologer av konserverte SLB gener bli undersøkt av små forstyrrelser RNA for å se om deres knockdown påvirker overlevelsesevnen til menneskeceller ved lavere doser av bortezomib. Hvis de samme syntetiske virkning oppstår i humane celler, slike SLB gener har potensial for innovasjon av nye behandlingsformer eller diagnoser. For eksempel, hvis kjemiske inhibitorer for disse konserverte SLB produkter er utviklet, vil slike kjemikalier være kandidater som brukes for cocktail behandling med bortezomib. På den annen side, kan pasienter med genetisk svak bakgrunn som skyldes disse SLB ortologer har alvorlige bivirkninger med hensyn til bortezomib administrasjon. Dermed forventes ytterligere undersøkelser på de SLB ortologer i menneskelig i fremtiden.
Materialer og metoder
Strain, middels, kultur, og medikamentell behandling
S. pombe
heterothallic haploids 972
h
– Hotell og 975
h
+ Hotell og deres derivater ble brukt. Fullfør rik YE, YES og minimal EMM2 media ble brukt [29]. Stamløsninger av bortezomib (LC Laboratories, Woburn, MA) ble utarbeidet i DMSO og narkotika ble lagt til flytende kultur eller agar medium ved den angitte konsentrasjon.
Syntetisk dødelig screening
For genom-wide screening, vedtok vi slettingen bibliotek av
S. pombe
haploid kjøpt fra Bioneer Corp (Korea). Kontrollvilltype stammer er ED666 (
h
+ ade6-M210 ura4-D18 leu1-32
) og ED668 (
h
+ ade6-m216 ura4-D18 leu1-32
), som også ble kjøpt fra Bioneer Corp haploid bibliotek gen-sletting ble gitt som glyserol aksjer i 96-brønners plater. Først ble 5 ul av hver aksje belastning sletting prikket inn JA plater fra en 96-brønns plate ved hjelp av laboratorieautomasjonssystem Biomek FX (Beckman Coulter, Brea, California). Etter 3 dagers inkubering ved 26 ° C, ble en koloni fra hver stamme plukket opp og flekket over på et annet JA plate (betraktet moderplater) ved hjelp av rotoren robot (Sanger Instruments, UK). En koloni ble quadruplicated å sjekke reproduserbarhet. Fra mor plater, flekket kolonier ble igjen plukket opp og fikk øye på JA plater som inneholder 0, 100, 250, og 500 mikrometer bortezomib, henholdsvis. Flekket plater med forskjellige konsentrasjoner av medikamentet ble inkubert i 3 dager ved 26 ° C og den kolonidannelse av hver stamme ble evaluert. For validering av primærscreening, ble bortezomib sensitiviteter av utvalgte stammer fra primærscreening testes ved hjelp fange tester.
Immun og protein rensing
For immunoblot analyse, totalt proteiner ble hentet med trikloreddiksyre (TCA) -metoden. Identiske mengder av proteiner ble separert ved SDS-PAGE-gel og blottet på nitrocellulosemembraner. Anti-poly-Ubiquitin (FK-2, mus monoklonalt, MBL, Japan), anti-alfa-tubulin (TAT1, mus monoklonalt, en gave fra Dr. Gull) og anti CDC13 (kanin polyklonale) ble anvendt som primære antistoffer. Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff og et ECL-kjemiluminescens-system (GE Healthcare) ble brukt for å forsterke signalet uttrykk. Å rense ubiquitinmolekyler ble tidligere beskrevet metode brukes med mindre endring [15].
Fluorescent mikros
Alle bildene ble anskaffet ved hjelp av en fluorescerende mikroskop innstilling Axioplan 2 (Zeiss, Tyskland). Metoder for bygging av GFP eller RFP smeltet genet ble tidligere beskrevet [30].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
bortezomib hemmer spredning av
S.pombe
. (A) bortezomib og MG-132 ble tilsatt til en log-fase-kultur av
S. pombe
ved de angitte konsentrasjoner og cellulær proliferasjon ble undersøkt i 8 timer. Fold-økning på 8 timer etter narkotika tillegg presenteres på Y-aksen. (B) Nivåer av poly-ubiquitinmolekyler ble undersøkt i nærvær (+) eller fravær (-) på 1 mM bortezomib. Poly-ubiquitinmolekyler akkumulert i en tidsavhengig måte etter tilsetning av bortezomib
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022021.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Et eksempel på den primære screening er vist. Som beskrevet i teksten, ble hver koloni fra hver stamme gen-delesjon flekket til hver posisjon (A1, A2 …) av JA-agarplater med 0, 100, 250, og 500 uM bortezomib. Å screene 2815 stammer, ble 31 sett av disse platene forberedt. Etter inkubering ved 26 ° C i 3 dager, ble kolonidannelse evaluert. Vill-type-stammer ble prikket til posisjoner H2 og H3 (hvit stiplet linje). Stammer oppdaget på A3, B8, B10, og C10 ble valgt som kandidater som viser alvorlige vekstdefekter med 100 mikrometer bortezomib og ble testet på nytt etter serie fortynning spotting
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022021.s002 plakater (TIF )
Figur S3.
Følsomhet for lavere doser av bortezomib. -Kolonidannelse evne til fem SLB mutanter ble undersøkt på YES agar medium inneholdende 0, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM, 10 uM og 100 uM bortezomib som beskrevet i figur 2 (D). Under 10 mikrometer bortezomib, ble betydelig vekst mangelen ikke observert
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022021.s003 plakater (TIF)
Tabell S1.
Liste av gener som ble identifisert til å vise vekst defekt i nærvær av 100, 250 og 500 uM bortezomib fra den primære screening.
doi: 10,1371 /journal.pone.0022021.s004 plakater (XLS)
Takk
Vi er i stor gjeld til Dr. Colin Gordon for å levere
S. pombe
stammer og Dr. Keith Gull for å levere antistoffer.
