Abstract
Gastric kreft er en av de viktigste årsakene til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Tidlig oppdagelse og behandling fører til en utmerket prognose hos pasienter med tidlig magekreft (EGC), mens prognosen for pasienter med avansert magekreft (AGC) forblir fattige. Det er uklart om EGCS og AGCS er atskilte enheter, eller om EGCS er begynnelsen stadier av AGCS. Vi utførte hele exome sekvensering av fire prøver fra pasienter med EGC og sammenlignet resultatene med de fra AGCS. I begge EGCS og AGCS, ble totalt 268 gener ofte mutert og uavhengige mutasjoner ble i tillegg funnet i EGCS (516 gener) og AGCS (3104 gener). En høyere frekvens av C G overganger ble observert i intestinal-type i forhold til diffuse-type karsinom (
P
= 0.010).
DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 Hotell og
UNC5C
gener recurrently mutert i EGCS og kan være involvert i tidlig kreft
Citation. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J et al. (2013) Exome Sekvense Identifiserer Tidlig magekarsinom som et tidlig stadium av avansert ventrikkelcancer. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770
Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore
mottatt: 17 juli 2013; Godkjent: 27 oktober 2013; Publisert: 23.12.2013
Copyright: © 2013 Kang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av et stipend fra National Research Foundation of Korea (2012-P4KR 003) og en Samsung Biomedical Research Institute stipend (# SBRI-SP1B20111). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. KW er ansatt av Pfizer Inc. Men dette betyr ikke endre forfatterens tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har erklært at ingen andre konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Gastric karsinom (GC) er en heterogen sykdom med flere miljø årsaker, alternative veier av kreftutvikling og ingen kjente høyfrekvente onkogene forstyrrelse [1], [2], [3]. Den Lauren klassifiseringen har vist seg nyttig i å vurdere den naturlige historien til GC, spesielt med hensyn til forekomst trender, clinicopathologic sammenhenger og årsaks forløpere [4]. Lauren klassifisert gastrisk adenokarsinom inn i tarm og diffundere i henhold til morfologiske trekk ved tumor [4], [5], [6]. Intestinal-type karsinom antas å oppstå sekundært til kronisk atrofisk gastritt assosiert med
H. pylori Hotell og tarm metaplasi [7]. Diffuse-type GCer ikke er assosiert med tarm metaplasi og kan oppstå fra encellede mutasjoner innenfor normale mage kjertler [4], [8], [9].
GC er en av de viktigste årsakene til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Tidlig oppdagelse og behandling resulterer i en utmerket prognose for pasienter med tidlig magekreft (EGC), mens prognosen for pasienter med avansert magekreft (AGC) fortsatt dårlig. Det er imidlertid uklart om EGCS og AGCS er atskilte enheter, eller er det samme tumor progresjon fra tidlig til avanserte stadier [10]. De molekylære signaturer skille EGC fra AGC er viktig for å hjelpe identifisering av nye prognostiske markører og potensielle terapeutiske mål.
Nylig exome sekvensering i 22 [11] og 15 [12] AGC prøvene viste hyppige inaktive mutasjoner i celle adhesjon og kromatin-remodeling gener, og de genetiske forandringer skilte mellom undergrupper stratifisert etter Epstein-Barr virus (EBV) eller
H. pylori
infeksjon og mikro ustabilitet (MSI) status. For ytterligere å utforske de genetiske forandringer underliggende GCer, utførte vi hele exome sekvensering i fire matchet par av EGC og normalt vev, og sammenlignet resultatene med de fra AGCS.
Materialer og metoder
Prøvepreparering
Tumor og ikke-neoplastiske mage vev ble samlet inn fra gastrektomi prøver. Denne studien ble gjennomført etter godkjennelse fra Institutional Review Board of Samsung Medical Center, og alle pasienter ga skriftlig informert samtykke før operasjonen. For tumorprøver, massene var 4 cm på brutto inspeksjon, og overflaten slimhinnen fra hver svulst ble anskaffet. Etter innebygging i oktober media, ble vevet kuttet og H E farget. Prøver av 90% svulst innhold ble valgt for DNA-ekstraksjon med en Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) og behandlet med RNase A for å fjerne gjenværende RNA. DNA ble også ekstrahert fra paret upåvirket gastrisk vev, som ble erholdt fjernt fra tumorstedet og bekreftet å være tumor-fri. MSI ble analysert med fem NCI markører som tidligere beskrevet [13]. Tilstedeværelsen av EBV ble påvist ved EBV-kodet RNA
in situ hybridisering
som tidligere beskrevet, og kun tilfeller med sterkt signal i løpet av nesten alle tumorcellekjerner ble betraktet som positive [14]. Ytterligere detaljer for EGC prøvene er gitt i tabell 1.
Exome berikelse og sekvense
Exome berikelse (atVelg Menneskelig All Exon Kit, Agilent Technologies) og Illumina sekvense bibliotekene ble utarbeidet etter til produsentens instruksjoner. I korthet ble 3 pg av genomisk DNA ble skåret med den Covaris S2 system; DNA-fragmentene ble slutt reparert, utvidet med en «A» base på 3 «enden, ligert med parvise end adaptere og forsterket (fire sykluser). Exome holdige adapter-ligert bibliotekene ble hybridisert i 24 timer med biotinylerte oligo-RNA agn og beriket med streptavidin-konjugert magnetiske kuler. De endelige bibliotekene ble ytterligere forsterket gjennom 11 PCR-sykluser og utsatt for Illumina sekvensering på ett kjørefelt av HiSeq 2000 sequencer med en målrettet innsatsen størrelse ~180 bp. All sekvensering ble kjørt med parvise end 65-bp leser og ble utført i henhold til Ilumina standard protokoll. I gjennomsnitt, ~136.3 million renhet filtrert leser ble samlet for hver prøve. Den midlere prosentandel av duplikat leser på grunn av PCR og optiske gjenstander var 0% i vår datasettet, og ~123.7 millioner entydig tilordnet lesninger ble oppnådd for hver prøve. I gjennomsnitt 69,1% av lyder i hver prøve hadde minst 50% overlapping med noen målrettet region ± 100 bp i atVelg hele exome agn bibliotek. De målrettede regioner i hver prøve ble sekvensert til en gjennomsnittlig dybde på 113,7 ×, med ~98.8% av målrettede regioner dekket ≥1 ×, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × og ~50.8% ≥100 ×. Detaljerte sammendrag av rå datakvalitet er beskrevet i tabell S1. Til sammenligning, det samme algoritme (SMART), anvendt i den foregående datasettet for AGC-prøvene [11], ble påført på disse data for å identifisere somatiske enkelt-nukleotid-variasjoner og insersjoner /delesjoner (indels) forandringer på grunn av kort- lesesekvenseringsdata. Datasettet er deponert i Europa nukleotid Arkiv og kan nås på https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.
Mutasjoner oppdages av exome sekvensering ble ytterligere validert av PCR og Sanger-sekvensering. I korthet, blir primere utformet ved hjelp av Primer3 programvare (https://frodo.wi.mit.edu), og sekvensene er oppført i Tabell S3. De PCR-amplifiserte produkter ble deretter sekvensert ved hjelp av en BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit og en ABI 3700 automatisert sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Resultater
somatisk endringer i EGCS
i alt ble 2,389 somatiske mutasjoner identifisert i de fire EGC prøvene, hvorav 1117 skjedde i koding regioner eller essensielle spleiseseter (627 missense, 32 tull, 10 essensielle spleisesete, 169 indels og 279 synonymt) (figur 1, og tabell 2 og S2). En GC med MSI-høy hadde 727 ikke-tause mutasjoner inkludert mismatch-reparasjonsgener (
MSH6 Hotell og
MSH3
), mens de tre mikro stabil (MSS) prøver hadde et gjennomsnitt på 37, en forskjell på omtrent 20 ganger. De nonsynonymous-til-synonyme prosenter i MSS kreft hadde en tendens til å være høyere enn den for MSI-høy kreft, men forskjellen var ikke statistisk signifikant. C T og G A overganger var de mest vanlige mutasjoner (61%) i EGCS, og det var ingen signifikant forskjell i enkelt basepar-endring mellom MSI-høy og MSS kreft (figur 2A og Tabell S4). Av 784 gener som bærer ikke-tause mutasjoner, 13 ble mutert i to eller flere prøver. Disse inkluderte gener som er kjent for å være involvert i magekreftutvikling (
TP53
) og rapportert i Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) som skal mutert i GCer (
DYRK3, MCM10, PCDH17 Hotell og
UNC5C
) (tabell 3). Av de som er valgt for validering gener,
PCDH17
mutasjonen ble mest sannsynlig ikke validert av Sanger metoden på grunn av lave frekvenser av mutant allel (tabell S3). Interessant, i en diffus-type EGC med MSI-high, en
EGFR plakater (c.2224G A, p.V742I). Mutasjon ble identifisert
Stjernen (*) indikerer resultatene som produseres på samme plattform.
Stjernen (*) indikerer signifikant forskjell mellom intestinal- og diffuse-type i alle mikro stabile kreft (
P
= 0,010).
sammenligning mellom EGC og AGC
for sammenligning av våre resultater på EGC med de av AGCS, to nylig publiserte hele exome sekvense data ble brukt [11], [12] . Wang
et al
. oppdaget 164 ikke-stille og 48 synonyme mutasjoner i gjennomsnitt i 22 AGC prøver med 116 × gjennomsnittlig dekning dybde [11]. Zang
et al
. oppdaget i gjennomsnitt 50 ikke taus og 16 synonymt somatiske mutasjoner i 15 AGC prøver med 96 × gjennomsnittlig dekning dybde [12]. I direkte sammenligning mellom de fire EGCS og 37 AGCS, var det ingen signifikant forskjell i antallet mutasjonstype (figur 1). De enkle basepar endringer i EGCS var lik en tidligere rapport fra Wang
et al
. [11], som viser et klart høyere antall C T og G A overganger i både MSS og MSI-høye tumorer (figur 2A og tabell S4). Interessant, C G overganger var mer vanlig i tarm-type enn i diffuse-type GCer tvers av alle MSS prøver, som inkluderte tre EGCS og 18 AGCS (Wilcoxon rank sum test,
P
= 0,010) (figur 2B og tabell S4).
i 37 AGC og 4 EGC prøver, ikke-tause mutasjoner (missense, tull, avgjørende spleisesete og indels) ble påvist i 3,372 og 784 gener, henholdsvis. I begge EGCS og AGCS, ble 268 gener ofte mutert;
BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI Hotell og
TP53
gener ble mutert i minst to EGC prøver, og
ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22 Hotell og
TTN
gener, så vel som andre, var signifikant assosiert med AGCS med en falsk funnrate på 0,2 [11], [12] (figur 3). Funksjonell merknad analyse ved hjelp DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov) for å undersøke genene som finnes overlapp mellom de to prøvesettene viste at betydelig beriket vilkårene inkludert aktinbindende, cytoskjelettet, celle projeksjon og celle-celle krysset (tabell . S5)
Understreket og fet skrift indikerer gener med proteinrende mutasjoner i minst to tidlige kreftprøver og de utvalgte gener med høyere-enn-forventet mutasjon priser i avansert magekreft (falske funnraten 0,2 ), henholdsvis.
Diskusjoner
Selv om hele exome sekvensering har blitt rapportert for 37 AGC prøver [11], [12], det har vært noen slik studie for å evaluere tidlig kreftutvikling hos genetisk nivå. For å utforske hele repertoaret av somatiske mutasjoner i EGCS, utførte vi hele exome sekvensering av fire sammenkoblede EGC prøver, og fant tydelige og felles genetiske signaturer mellom EGCS og AGCS som kan identifisere gener som er involvert i tidlig kreftutvikling og påfølgende progresjon.
Epithelial kreftformer har ofte variable mutasjon spektra som peker til bestemte mutagene stimuli [15], [16]. For eksempel, høy forekomst av A T overganger ble observert i esophageal adenokarsinomer og soleksponerte melanomer, henholdsvis som tyder på at disse mutasjonene skyldes gastroøsofageal refluks og ultrafiolett eksponering [15], [17], C og C A og T Et endringer i forhold til normal genomer [18]. Her fant vi hyppig C G overganger i intestinal-type karsinom sammenlignet med diffuse-type GCer etter utelukkelse av MSI-høye GCer. Våre unike observasjons warrants fremtidige studier for å definere spesifikke etiologi som potensielt bidrar til forståelse av komplekse og dårlig forstått molekylære stier av intestinal-type GCer.
Gjennom komparative analysen identifiserte vi 268 overlappende gener med ikke-tause mutasjoner delte av både EGCS og AGCS (figur 3). Om lag en tredjedel av de ikke-tause mutasjoner i EGCS deles med AGCS og 8% av de ikke-tause mutasjoner funnet i AGCS deles med EGCS. En tidligere studie med genekspresjon analyse viste at de fleste forandringer assosiert med EGCS beholdes i AGCS og ytterligere uttrykk endringer markerer overgangen fra EGC til AGC [10]. Samlet er disse resultatene indikerer at EGC representerer en tidlig molekylær stadium av AGC, og ofte muterte gener spiller en viktig rolle i utviklingen fra EGC til AGC. Vi har bekreftet at
TP53
er den hyppigst muterte genet i GCer, med
TP53
mutasjoner funnet i halvparten av EGC og to tredjedeler av AGC prøver. Blant de overlappende gener,
AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A Hotell og
RPL22
ble kommentert som onkogener, mens
ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
og
TP53
var tumorsuppressorgener ved Sanger Gene Census (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census). Av kreft Census gener, vi først identifisert en
EGFR
mutasjon (c.2224G A, p.V742I) i en diffus-type EGC med MSI-high. I en fersk studie på 63 MSI-høy GCer,
EGFR
mutasjon ble ikke oppdaget ved direkte sekvensering av kinase domene (eksoner 18, 19, 20 og 21) [19]. Den samme V742I mutasjon er blitt rapportert hos en pasient med endometrial cancer og i en glioma cellelinje [20], [21]. Den kliniske betydningen av denne sjeldne mutasjonen må valideres i nær fremtid.
Selv om forekomsten av tilbakevendende mutasjoner i EGCS var relativt lav, 13 gener ble mutert i minst to prøver, og hadde svært få synonymt, intronic og /eller uoversatt mutasjoner. Blant disse 13 genene, kan
DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 Hotell og
UNC5C
være spesifikke for tidlig GC, noe som tyder på en mulig rolle i den tidlige kreftutvikling. I vår serie,
PCDH17
mutasjoner skjedde i intestinal-type GCer med MSS, inkludert en EBV-positive prøven. Tidligere globale genomiske analyser av kolorektal og bukspyttkjertel kreft også avdekket missense mutasjoner i noen medlemmer av
PCDH
(protocadherin) underfamilier [22], [23]. Men mutasjoner påvist i våre EGCS av Illumina sekvensering ble ikke bekreftet av Sanger-sekvensering, sannsynligvis fordi de muterte allelfrekvenser var svært lav.
tilhører UNC5C
til den funksjonelle avhengighet reseptorfamilien, medlemmer av hvilke deler evnen til å indusere apoptose i fravær av deres ligander [24], [25]. Avvikende metylering av dette genet har blitt rapportert i løpet av magekreftutvikling, og dette metylering forsvant i svært avanserte GCer [26]. For de resterende gener, forblir deres funksjonelle relevans i GC uklart.
Tap av funksjon i celleadhesjonsmolekyler øker muligheten for kreftceller å invadere omkringliggende vev, og dysfunksjon i kromatin-remodeling kompleks fremmer kromosomal instabilitet som driver tumorigenesis [27]. Ingen av våre EGC prøver hadde protein rende mutasjoner av kromatin-remodeling gener som finnes i AGCS, for eksempel
ARID1A, MLL3, PBRM1 Hotell og
MBD2 product: [11], [12], noe som tyder kromatin modifikasjon skjer sent i utviklingen av GC.
Totalt antyder vår studie som EGC og AGC har felles somatiske mutasjoner, og AGC er assosiert med flere kumulative genetiske endringer i celle adhesjon og kromatin-remodeling gener. De molekylære signaturer skille EGC fra AGC er viktig å bidra til å identifisere nye prognostiske markører og potensielle terapeutiske mål. Større studier er nødvendig for å fastslå biologisk betydningen av recurrently muterte gener i EGCS.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Oppsummering av hele exome sekvense statistikk for fire par mageprøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001 product: (PDF)
Tabell S2.
Liste over alle somatiske mutasjoner i tidlig mage kreft identifisert av exome sekvense
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002 plakater (XLS)
tabell S3.
Primere for Sanger-sekvensering, allelfrekvenser og valideringsresultater
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s003 product: (PDF)
Tabell S4. Host Sammenligning av somatisk punktmutasjon spektra i mage kreft ved svulst staten og histologisk typen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004 product: (PDF)
Tabell S5.
DAVID pathway analyse av 268 overlappende gener mellom tidlige og avanserte mage kreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005 plakater (XLS)
