Abstract
Mismatch repair-mangel kolorektal kreft (CRC) display utbredt ustabilitet ved DNA mikrosekvenser (MSI). Selv om MSI er blitt rapportert å forekommer vanligvis ved koding gjentas, som fører til endringer i funksjonen av et antall gener som koder for kreft-relaterte proteiner, er ingenting kjent om den antatte effekten av denne fremgangsmåten på ikke-kodende microRNAs. I miRbase V15, identifiserte vi svært få mennesker mikroRNA gener med mono- eller di-nukleotid repetisjoner (
n
= 27). En mutasjonsanalyse av disse sekvenser i en stor serie av MSI CRC-cellelinjer og primære tumorer understreket ustabilitet i 15 av de 24 mikroRNA genene hell undersøkt ved variable frekvenser fra 2,5% til 100%. Etter et maksimum sannsynlighets statistisk metode, ble mikroRNA gener separert i to grupper som var signifikant forskjellig i deres mutasjon frekvenser og i deres tendens til å representere mutasjoner som kan eller ikke kan være under selektive trykk i løpet av MSI tumorprogresjon. Den første gruppen inkluderte 21 gener som viste ingen eller få mutasjoner i CRC. Den andre gruppen inneholdt tre gener, dvs.
HSA-mir-1273c
,
HSA-mir-1303 Hotell og
HSA-mir-567
, med hyppige (≥80 %) og noen ganger bi-allele mutasjoner i MSI-tumorer. For den eneste uttrykt i colonic vev,
HSA-mir-1303
, ingen direkte sammenheng ble funnet mellom tilstedeværelse eller ikke av mono- eller bi-allele endringer og nivået av modne MIR uttrykk i MSI cellelinjer , bestemt ved sekvensering og kvantitativ PCR respektivt. Samlet våre resultater gir bevis for at DNA-gjentakelser som finnes i menneskelige miRNA gener er relativt sjeldne og bevart fra mutasjoner på grunn av MSI i MMR-mangelkreftceller. Funksjonelle studier er nå pålagt å konkludere om mutert mirnas, og spesielt MIR-1303, kan ha en rolle i MSI tumorigenesis
Citation. El-Murr N, Abidi Z, Wanherdrick K, Svrcek M, Gaub MP , Fléjou JF, et al. (2012)
Mirna
Gener Utgjør Nye mål for mikro Ustabilitet i tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (2): e31862. doi: 10,1371 /journal.pone.0031862
Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University School of Medicine, Republikken Korea
mottatt: 18 november 2011; Godkjent: 13 januar 2012; Publisert: 14. februar 2012 |
Copyright: © 2012 EL-Murr et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. N El -Murr er en mottaker av en LNCC (Ligue Nationale Contre le Cancer) fellesskap. Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i løpet av det siste tiåret, mikroRNA (miRNA) gener har blitt grundig identifisert i pattedyr, planter og virus. De koder for korte (~22 nukleotider) enkelt-trådede modne RNA-molekyler (Mirs) som regulerer genekspresjon for det meste ved baseparring med det 3′-UTR av mål-mRNA [1], [2]. Hos mennesker er det anslått at mer enn ett tusen Mirs kontrollere ekspresjonen av ca. 60% av protein-kodende gener. Tallrike funksjonelle studier har rapportert deltakelse av Mirs i ulike cellulære prosesser, og deretter, deres deregulering i en rekke humane sykdommer, inkludert kreft [2], [3]. MiRNA gener kan plasseres innenfor introner og sjeldnere innenfor eksoner, eller intergeniske regioner, blir deres uttrykk regulert av uavhengige eller verts genet arrangører [4]. Excepting miRNA gener som oppstår i sin helhet fra de skjøtede ut introner av vertens mRNA (kalt mirtrons [5]), produserer hver mikroRNA gen tre typer av molekyler som vil gjennomgå suksessive spaltninger av to RNaser, kalt drosha og dicer, for å gi en fullt funksjonell mir: en stor primær transkripsjon (pri-Mir, rundt 500 til 3000 baser), en hårnål-lignende mellomprodukt forløper (pre-Mir, -60 til 80 baser), og en forbigående miRNA dupleks enn to forskjellige modne Mirs er vanligvis produsert ved forskjellige (større MIR /moll Mir *) eller tilsvarende (MIR-5p /MIR-3p) mengder [5], [6]. Hver modning trinn avhengig tungt på viktige strukturelle trekk som dikterer en korrekt og pålitelig biogenesis av modne miRNA. Både størrelse og sekvensvariasjoner i ulike regioner av miRNA hårnål (basal segment, stem, miRNA duplex og loop) kan føre til feilregulering av MIR biogenesis og antas å ha tumorigen konsekvenser [7], [8], [9], [10 ], [11], [12].
Flere genetiske og epigenetiske mekanismer som fører til endring av MIR uttrykk og funksjon er beskrevet i humane tumorer, inkludert tykktarmskreft (CRC) [13], [14 ], [15]. En metylering av
miRNA-34b /c
CpG øyer, for eksempel, har blitt hyppig observert i CRC cellelinjer og primære svulster [16], og en økt uttrykk av MIR-17-92 klyngen har blitt bemerket i sammen med en kromosom ustabilitet (CIN) på kromosom bandet 13q31 inneholder dette
miRNA
locus [17]. Viktigere, CIN kalles også MSS (mikro stabilitet) karakteriserer hoved undergruppe av CRC (som representerer 80-85% av alle CRC). Mikrosatelitt ustabile (MSI), på den annen side, en egenart som følge av en DNA-mismatch reparasjon (MMR) mangel, har blitt rapportert i de resterende 15-20% av CRC [18]. I MSI CRC, som vanligvis ikke vises CIN, er tumorprogresjon tenkt å resultere spesielt fra akkumulering av sekundære mutasjons hendelser (sletting /innsetting) påvirker mikro, gjentatte sekvenser av korte DNA-motiver (1-6 bp), som finnes i kreft relaterte gener [19], [20]. Disse mutasjonene påvirker målgener involvert i ulike biologiske mekanismer som for eksempel regulering av cellesyklus og /eller celleproliferasjon (
TGFBR2, IGF2R, TCF4, AXIN2, PTEN, RIZ
…), regulering av apoptose (
BAX, CASP5, BCL10, APAF1, FAS …
), eller DNA skade signalering og reparasjon av veier (
RAD50, BLM, MSH3, MSH6, MBD4, MLH3, CHK1, ATR …
). I de fleste målgener, ble ramme-skiftmutasjoner observert i exonic gjentar seg, som oftest mononukleotid kanalen, som fører til produksjon av avkortede proteiner. Mer sjelden, somatiske mutasjoner i intronic mononukleotid gjentakelser av MSI målgener (
MRE11 Hotell og
HSP110
) ble vist å føre til avvikende spleising og til generering av endrede proteiner [21], [22 ].
i denne studien undersøkte vi for første gang om miRNA gener, uavhengig av deres genom plassering, kan utgjøre nye mål av MSI i CRC. Alle menneskelige miRNA gener som inneholder mononukleotid (MNR) eller dinukleotidpolyfosfater repetisjoner (DNR) (≥ 7 repetisjoner) i sine hårnål sekvenser ble screenet for mutasjoner (nukleotider tillegg /slettinger) ved hjelp av en stor serie med MMR-mangel CRC cellelinjer og primære svulster, som samt lymfoblastoide cellelinjer (LBLs) og MSS CRC kontroller slik at vurderingen av det polymorfe status for disse sekvensene.
Resultater
Screening for mikro gjentakelser i miRNA hårnåler og fastsettelse av deres polymorfisme i MMR -proficient cellelinjer
Blant de 940 humane miRNA sekvenser som er oppført i miRbase V15, 24 inneholde MNR med minst syv gjentatte enheter (2,5%) (tab 1). DNR (≥ 7 repetisjoner) er mer sjelden funnet i miRNA sekvenser (3/940, 0,3%) (tab 1). Disse miRNA gener er fordelt på flere kromosomer. Flertallet er funnet i proteinkodende gener (22/27, 81,5%), hovedsakelig innenfor intronic sekvenser (21/22, 95,5%). Gjentatte sekvenser varierer i størrelse og kan nå opp til 18 repetisjoner. Mer enn to tredjedeler av MNR (17/24; 71%) er små (7-8 bp) og A /T rik (16/24; 67%). De spenner mange regioner av hårnål forløper (figur 1) som anses viktig for MIR modning og /eller funksjon. Disse regionene består av basal segmenter, stammen, miRNA duplex og terminalen løkke [7], [8], [9], [10]. To mirnas (
HSA Anmeldelser –
mir-511-1 Hotell og
HSA Anmeldelser –
mir-511-2
) er duplikater av det samme genet og vise en unik sekvens utvisket i vår analyse. Bortsett
HSA Anmeldelser –
mir-1234 Hotell og
HSA Anmeldelser –
mir-3166
, alle miRNA gener ble vellykket forsterket ved hjelp av et sett med fluorescerende primere grenser hårnål sekvens. MiRNA gener ble først analysert hos friske individer (LBLs,
n
= 40) for en evaluering av den iboende polymorfisme (tabell 2). Ut av 21 MNR analysert i normale DNA-prøver, ble størstedelen (17 gener) vist seg å være monomorf (tabell 2). Lengde polymorfisme (1 bp skift) i
HSA-mir-1303
ble observert med de mindre allel som har den høyeste allel frekvens (tabell S1, figur S1). Enkeltnukleotidpolymorfi (SNP)
rs33982250 Hotell og
rs34889453
, både som tilsvarer en adenin sletting, rapporteres for
HSA-mir-1303
og er plassert utenfor MNR [ ,,,0],23]. Sjeldne alleler med opp til tre-bp skift ble også identifisert i
HSA-mir-511
,
HSA-mir-543 Hotell og
HSA-mir-1302-7
gener (tabell S1, figur S1). Lignende resultater ble oppnådd i en serie på 25 primære MSS kolorektale tumorer og 13 MSS CRC-cellelinjer (tabell S1).
basal segment (BS, enkelt-trådet RNA), spindelen (S, dobbelt-trådet RNA ) og terminal sløyfe (L) er utpekt. Den duplex (D, som inneholder en eller to potensielle Mirs) regnes som en annen enhet, og derfor skiller seg fra stammen regionen. Regioner av hårnål omfattes av MNRs eller DNRS er kjent for hver miRNAs. Til venstre for ordningen er miRNA gener hvis sekvensen gjentar overlappe to regionene.
Kjøp
miRNA gener med DNR syntes å være svært polymorfe (tabell 2). To av 3 gener vises flere alleler med viktige lengdevariasjoner: 6 og 15 alleler funnet henholdsvis for
HSA-mir-620
og
HSA-mir-558
hos friske individer (Tabell S1, figur S1). Her har lengde polymorfisme blitt rapportert å være lokalisert innenfor mikro gjentar [23].
Mutasjon analyse av miRNA gener med MNR og DNR
Den ustabile alle miRNA gjentar ble undersøkt i en serie av 41 primær MSI CRC og 14 MSI CRC-cellelinjer (tabell 2). Primær MSS CRC (
n
= 25) og MSS CRC cellelinjer (
n
= 13) blir brukt som kontroller. Med svært få unntak, gjorde MSS kontrollene ikke vise størrelse endringer i noen av miRNA repetisjoner (3/557 og 3/304 mutasjons hendelser i primære svulster og cellelinjer, henholdsvis), mens 135/913 og 50/326 mutasjons hendelsene var observert i MSI primære svulster (
p
= 2,2 × 10
-16) og cellelinjer (
p
= 2,28 × 10
-10), henholdsvis. Analyse av DNR viste at 2 mirnas med 7 (
HSA-mir-1277
) og 11 repetisjoner (
HSA-mir-620
) var uendret i MSI prøver.
Hsa-mir-558
med 18 repetisjoner dukket mutert i en tredjedel av MSI cellelinjer (4/13; 30,8%) og MSI CRC. (12/38; 31,6%) (tabell 2)
Statistiske studier ble utført på mirnas med MNR grunn av deres største antall (
n
= 21). Basert på dataene rapportert i tabell 2, viser vi at flertallet av miRNA gener er sjelden (3/21 med mutasjonsfrekvens ≤15%) eller ikke endret (14/21, 66%) i MSI CRC-cellelinjer, mens de færreste gener (4/21; 19%) er funnet å være signifikant mutert. Lignende resultater ble oppnådd i MSI CRC (tabell 2). Imidlertid, endringer ble mindre ofte forekommer i MSI tumorer sammenlignet med cellelinjer, en observasjon i samsvar med det som er rapportert for gener som koder med MNRs [24]. I tillegg noterte vi en signifikant sammenheng mellom størrelsen på miRNA MNRs og mutasjonsfrekvensen i MSI svulster (
p 0,001
, r = 0,76) (figur 2). Denne sammenhengen var allerede observert for mange mikro sekvenser uavhengig av deres genomiske lokaliseringer (intergeniske, koding /exonic, koding /5 «3» uoversatt og intronic MNRs) (figur S2).
Legg merke til den meget signifikant korrelasjon observert.
miRNA gener med MNR skille inn i forskjellige grupper
Ved hjelp av en maksimal sannsynlighet statistisk metode som tidligere beskrevet (se Materialer og Metoder og [24]), identifiserte vi to forskjellige grupper av miRNA gener som inneholder MNR som avvek i deres mutability i MSI primære tumorer (figur 3). Kort fortalt mener testen at alle gener tilhører en gruppe av frekvens og motsetter seg til denne konfigurasjonen den alternative hypotesen om to gjensidig utelukkende grupper av frekvenser. Sannsynligheten ratio beregner sjansene for hver hypotese, og gir den mest «sannsynlig» til å skje. Den første, største gruppen består av miRNA gener ikke funnet eller ikke mye mutert i MSI tumorer (18/21; 86%). Den andre gruppen inneholdt 3 miRNA gener (
HSA-mir-1273c
,
HSA-mir-567 Hotell og
HSA-mir-1303
) ofte mutert i MSI CRC ( ≥75%). Lignende grupper ble definert i MSI CRC cellelinjer (figur S3).
To forskjellige grupper av mirnas med MNR er etablert basert på deres mutasjon frekvenser i MSI primære svulster. Cut-off-verdien blir beregnet ved forholdet mellom sannsynligheten for statistisk metode og er markert med en stiplet vertikal linje. Merk at
HSA-mir-644
er inkludert i gruppen av miRNAs sjelden eller ikke mutert i MSI CRC (
n
= 18, frekvensen av mutasjonen 25%), mens
HSA-mir-1273c
,
HSA-mir-567
og
HSA-mir-1303
utgjør gruppen av miRNAs ofte endret (
n
= 3, frekvensen av mutasjonen 75%)
Karakterisering av endringer og deres innvirkning på modne miRNA uttrykket
Vår analyse tillot identifikasjon av 3 MSI målrettede mirnas.
HSA -mir-1273c, HSA-mir-567 og HSA-mir-1303
. For disse genene, det store flertallet av MSI cellelinjer presenteres opptil 3 bp slettinger (figur 4, tabell S2), og sjelden en nucleotide tillegg (tabell S2). En bi-allel mutasjonen ble også bemerket i 36%, 57% og 83% av endrede MSI CRC cellelinjer for mir-1273c, mir-567 eller mir-1303, henholdsvis (figur 4, tabell S2). Liknende endringer ble funnet i MSI primære tumorer med unntak av
HSA-mir-1273c
, som generelt viste mindre grad av forandringer i tumorer (bare en bp-delesjon) (figur 4, tabell S2). Når det gjelder det polymorfe
HSA-mir-1303
genet, som har stor allelet viser en A-sletting (tabell S1), hårnål forløperen ble sekvensert i hver MSI CRC cellelinjen for å fastslå den virkelige omfanget av slettingen. Som LBL og MSS cellelinjer (tabell S1), MSI cellelinjer syntes å være homozygot (50%; dela /Dela) eller heterozygot (50%, dela /A) for «dela» allel. Relevansen av «Dela» SNP i
HSA-mir-1303
er vist i figur 5A som illustrerer endringer i terminal løkke av de mir-1303 hårnål strukturer. Dimensjonen av loopen inneholder mikro minker når endringene blir større og når hårnål strukturen inneholder A-tillegg SNP (figur 5A).
Alleliske profiler for flere MSI CRC cellelinjer og primære svulster vises. Normale profiler er definert i LBL og MSS cellelinjer og primære svulster. For monomorfe gener, viser en stiplet vertikal linje den unike allelet. Den polymorfe sonen for
HSA-mir-1303
er definert mellom to stiplede vertikale linjer som går langs de 2 lene (se figur S1). Størrelser (bp) er angitt i en boks under hver profil. Ulike allele slettinger som strekker seg 1-4 bp ble observert i MSI CRC cellelinjer og primære svulster og er uthevet. De observerte slettinger var noen ganger bi-allel i MSI CRC cellelinjer. I MSI primære svulster, de allele profilene var også sterkt tyder på bi-allele mutasjoner. På grunn av den iboende polymorfisme som kan modifisere lengden av sekvensen, den hårnål sekvensen av
HSA-mir-1303
ble bestemt for en korrekt og pålitelig evaluering av endringer i MSI CRC-cellelinjer (se tabell S2) .
A: Endringer i gjentatte sekvenser av
HSA-mir-1303 plakater (A) og dets variant (Dela) ikke synes å påvirke den generelle sekundærstrukturen av hårnål men dimensjonen av sløyfen (annoted innvendig) blir noe redusert som bestemt ved mfold programvare (https://mfold.rna.albany.edu/). Moden MIR (fet skrift) og MNR (understreket bokstaver) er vist i begge hårnål sekvenser. Pilene viser de mulige posisjoner av en Adenin delesjon som fører til en utvidelse av løkken. B: Sammenligning av de relative uttrykk for modne MIR-1303 i MSS (uendret MNR) og MSI CRC cellelinjer med ingen, mono- eller bi-allele mutasjoner av
HSA-mir-1303
. MiR uttrykk ble normalisert til uttrykk av RNU48. Midler er vist for hver gruppe (sort horisontal linje). Det ble observert en signifikant økning i ekspresjonen av MIR-1303 mellom MSS cellelinjer og normal colon slimhinner (
p
= 0,012). C: Fravær av korrelasjon mellom størrelsen på mir-1303 sløyfe og nivåene av modne MIR-1303 uttrykk i MSI cellelinjer uten (HCT-8, TC7) eller bi-allel mutasjoner (LS411, RKO, LIM2405, KM12, LoVo , HCT116) i MNR av
HSA-mir-1303
. Merk cellelinjer som produserer hårnål forløpere med samme størrelse av loopen uttrykker moden MIR-1303 på ulike nivåer.
Basert på disse resultatene, vi hypotese at nucleotide strykninger oppstått i miRNA forløpere kan påvirke biogenesis av modne Mirs, endre deres nivåer av uttrykk og /eller deres sekvens som rapportert for noen andre miRNA gener [7], [8], [9], [10]. Ved hjelp av spesifikke kvantitative RT-PCR-teknologi, bestemte vi den relative ekspresjon av hvert modne mir i villtype (WT) og muterte CRC cellelinjer i forhold til uttrykket i sunt colonic slimhinner. Uttrykk av MIR-567 og MIR-1273c var ikke påvises i colonic slimhinner og kolorektal cellelinjer (C
T 36 sykluser) (data ikke vist); mens MIR-1303 ut til å bli ganske uttrykt i både normale og svulst colonic celler (figur 5B). Tatt i betraktning den grad av ustabilitet, ble Mir-1303 uttrykk først analysert i MSI CRC cellelinjer. Med normal colonic slimhinner fungerer som kontroller, ble ingen forskjell i MIR-1303 uttrykk bemerket mellom uforandret
HSA-mir-1303
MSI cellelinjer og heterozygously muterte MSI cellelinjer (figur 5B). En økning i ekspresjon av MIR-1303 ekspresjon ble imidlertid ikke observert i noen av de MSI cellelinjene muterte på begge allelene (figur 5B). Videre cellelinjer skal ha identiske strukturer av miRNA hårnåler (figur 5C), viste ikke sammenlignbare uttrykk nivåer. Det synes derfor, så lenge størrelsen av sløyfen korrelerer ikke til nivåer av ekspresjon, som MSI forandringer ikke har noen ettervirkning på modne MIR uttrykk. En betydelig økning av MIR-1303 observert i MSS CRC cellelinjer i forhold til det normale tykktarmslimhinnen støttet dette resultatet (figur 5B).
Diskusjoner
Til dags dato den eneste etablerte indirekte virkningen av MSI prosessen på miRNA biogenese er målretting og således ødeleggelse av protein-kodende gener involvert i miRNA prosessering og transport [25], [26], [27], [28]. Vår studie er den første som rapporterer somatiske mutasjoner i miRNA gener på grunn av MSI i MMR-mangel CRC. Ved screening kvasi totaliteten av MNR og DNR (≥ 7 gjentatte enheter) som inngår i miRbase-V15-merket miRNA hårnål sekvenser,
HSA-mir-1273c, HSA-mir-1303 og HSA-mir-567
var vist seg å være mutert ved høy frekvens i begge CRC-cellelinjer og primære svulster. Siden høy mutasjonsfrekvens er den første kriterium for tiden tas i betraktning for å identifisere mål gener som spiller en rolle i den MSI-drevet vei til kreft [19], [20], [29], [30], disse miRNA gener kan således utgjøre virkelige målet for MSI. I kontrast til alle andre miRNA forandringer vi identifisert er sannsynlig å være et resultat av bakgrunnen for genetisk ustabilitet å karakterisere disse tumorene. De ble funnet å bli påvirket ved lav frekvens, og kan bare spiller en mindre rolle i tykktarm tumorigenesis, hvis noen. Dessuten ble noen miRNA gener som inneholder mikro funnet å være aldri mutert i CRC cellelinjer og primære svulster. De kan betraktes som «overlevende» miRNA gener hvis mutasjoner er ikke valgt for under tumorprogresjon, siden de kan være svært skadelig for kreftceller [19].
MSI er også påvirket av sekvens kriterier,
f.eks
lengden på repeat. Expectedly, observerte vi en samlet positiv sammenheng mellom lengden på miRNA gjentar og deres mutasjon priser i MSI CRC, bekreftende observasjon gjort for koding og ikke-kodende MNR. Etter behov for proteinkodende gener [29], [30], funksjonelle kriterier er nødvendig for å hevde at MSI målrettede miRNA gener har en rolle i MSI kolon tumorigenesis. Mirnas er dypt involvert i reguleringen av genekspresjon, som er således forbundet med forskjellige biologiske prosesser. Ingen biologiske rolle har ennå blitt tilskrevet
HSA-mir-1303 Hotell som er blant disse, den eneste MIR som ble betydelig uttrykt i colonic slimhinnene. Flere hundre mRNA kan tildeles
i silico
til Mir-1303, avhengig av programvaren som brukes, og videre analyser er nødvendig å definere dem som
in vivo
uttrykk er egentlig avhengig av
HSA -mir-1303
. Videre er det prioritert å bevise at MNR endringer som følge av MSI kan påvirke mir-1303 funksjon. Flere lag har allerede fremhevet stor rolle for terminalen sløyfe innenfor den primære miRNA hårnål i miRNA biogenese og funksjon [8], [9]. I tillegg er en enkel baseendring (dvs. SNP) i det miRNA genet i seg selv (pri-, pre- og modne miRNA sekvenser) er noen ganger tilstrekkelig til å endre miRNA ekspresjon og /eller funksjon i kreftformer, blokkerer behandling av pri-miRNA til pre -miRNA [23], [31], eller omvendt, å øke modne MIR uttrykk [32]. Vi kunne her for å observere noen tydelig korrelasjon mellom ekspresjonsnivå av modent MIR-1303 og mutasjon i DNA gjenta som inneholdes i sin terminal sløyfe i MSI CRC-celler, uavhengig av SNP tilliggende sløyfen. Videre studier ved hjelp av egnede plasmid konstruksjoner vil bli utviklet for å vite om MNR mutasjoner som påvirker denne miRNA genet kan endre behandlingen av modne MIR-1303 generere ulike Mirs [33] eller funksjonen til pri- eller pre-miRNA molekyler som er nylig rapportert av Trujillo
et al.
[34] for å være biologisk aktive.
i konklusjonen, våre funn har to hoved implikasjoner for rollen som miRNA i MSI-drevet kreftutvikling. De gir første bevis på at MSI CRC bare viser noen få av somatiske mutasjoner som påvirker et lite antall miRNA gener som inneholdt DNA-gjentar med ennå uklar konsekvens av behandlingen og funksjonen av disse molekyler. Funksjonelle studier er nå pålagt å håndheve ideen om at Mir-1303 kan ha en rolle i MSI tumorigenesis. For det andre, de viser at DNA-gjentakelser som inneholdes i miRNA gener er forholdsvis sjeldne, og vanligvis bevart fra mutasjoner som følge av MSI i MMR-manglende kreftceller. Denne studien fokuserer på nucleotide gjentar som ligger i de krappe sekvenser som inneholder minst pre-miRNA, og kan bli utvidet til MNR ligger i andre regioner av miRNA gener som er viktige for transkripsjon og behandling av store primær miRNA transkripsjoner (PRI-mirnas ).
Materialer og metoder
DNA-prøver
Normal DNA ble innhentet fra 40 friske individer (lymfoblastoide cellelinjer) som tilbys av CEPH (Centre d’Etude du Polymorphisme Humain, Paris, Frankrike). Primær tumorvev (41 MSI og 25 MSS svulster) fra pasienter som gjennomgår kirurgi for CRC på enten Saint-Antoine sykehus (Paris, Frankrike) eller sykehuset for Hautepierre (Strasbourg, Frankrike) ble samlet på biologiske ressurser Centers for hver institusjon. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Etikk godkjenning er innhentet fra Human forskningsetiske komité (Paris, Frankrike) og fra «Comité pour la Protection des Personnes de Strasbourg» (CPPEST IV, Strasbourg, Frankrike). MSI status ble bestemt ved fluorescerende multipleks PCR, som tidligere beskrevet [35], og tillot evaluering av prosentandelen av epithelial karsinom vev i MSI prøver. Bare svulster med minst 40% av tumormateriale har blitt inkludert i vår studie. DNA ble ekstrahert fra 14 MSI og 13 MSS CRC cellelinjer ved hjelp QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner.
Identifikasjon av mono- og dinukleotidpolyfosfater gjentar
En systematisk screening for sort-hvitt og dinukleotidpolyfosfater gjentar ble utført i miRbase (versjon 15, april 2010 release) (https://www.mirbase.org/) [6]. Denne databasen gir sekvenser av miRNA hårnål forløpere og modne mirnas i ulike arter. Vi valgte menneskelige mirnas ha minst 7 gjentatte enheter. Dette minimumsantall ble valgt fordi mikro sjelden ble funnet å være ustabil under 7 repetisjoner (se SelTarbase, https://www.seltarbase.org/).
Mutasjon analyse
Spesifikke primere flankerer hårnål sekvenser ble utformet med Amplifix programvare for hver miRNA kandidat. PCR-amplifikasjon ble utført i et sluttvolum på 25 ul med 5 ng DNA, høy eller lav MgCl
2-konsentrasjon, med eller uten Q-løsning, og Taq DNA-polymerase (Qiagen). Primer sekvenser er listet opp i tabell S3. De termiske veksling omfattet en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 45 sekunder; 60 ° C i 60 sekunder og 72 ° C i 60 sek. Finnzyme Phusion Høy Fidelity DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) ble også brukt i noen tilfeller i henhold til produsentens protokoll. Tilstrekkelig fortynninger av fluorescerende PCR produktene ble blandet med formamid og Genescan ™ 400HD ROX ™ Størrelse Standard (Life Technologies, Courtaboeuf, Frankrike), varme denaturert og kjøre på en kort kapillær inneholder GS ytelsen optimal Polymer 7 på ABI 3100 Genetic Analyzer. Data ble visualisert og kommentert i GeneMapper 3.7-programvaren (Life Technologies).
Sekvensering av HSA-mir-1303 hårnål forløper
En sekvens inneholder HSA-mir-1303 hårnål forløper ble forsterket av den Finnzyme Phusion Høy Fidelity DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific) ved hjelp av følgende primere: F-GTGAACTAAACGCTGCCTCTGCTA og R-TGCAGGAACCGTACTAAGCACT (Tm = 66 ° C). PCR produktene ble deretter renset på 96-brønners Multiscreen-PCR filtrerings plats (Millipore, Molsheim, Frankrike). Sekvenseringsreaksjon ble utført ved hjelp av Big Dye Terminator Kit V3.1 (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll og bruke separat forover eller bakover primere. Sekvenser produkter ble deretter renset på 96-brønners Multiscreen-DV plater (Millipore) med Sephadex G-50 fine og analysert på en ABI 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies)
Reverse-transkripsjon og Real-Time kvantitativ PCR
Total RNA ble fremstilt fra eksponentielt dyrkede celler (ni MSS og 14 MSI CRC-celler) og normal tarmslimhinnen fra pasienter med CRC (
n
= 7) med TRIzol reagens (Life Technologies) så kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer. cDNA ble samlet inn 10 ng eller 100 ng av total RNA ved hjelp av miRNA-spesifikke stammen løkke RT-primere (Life Technologies) for MIR-1303 eller MIR-1273c, henholdsvis. RT-qPCR analysene ble utført i tre eksemplarer på en ABI 7900 Sequence Detection System bruker TaqMan mikroRNA analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Life Technologies). For påvisning av MIR-567, den miScript PCR system (miScript RT og miScript SYBR Grønn PCR kits) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen). Med begge teknologier, CT, syklusen nummer ved hvilken mengden av amplifisert mål når en fast terskel, ble bestemt. CT over 36 ble ansett som falske positiver. Moden miRNA uttrykket ble normalisert til at av RNU48 (Life Technologies) eller RNU6B (Qiagen) (ΔCT = CT
MIR-CT
RNU). Sammen kvantifisering ble utført ved hjelp av en kalibrator prøve. Relativ miRNA uttrykket ble uttrykt som 2
-ΔΔCT (2
– (ΔCT sample-ΔCTcalibrator)). De termiske veksling omfattet 45 sykluser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 minutt (Life Technologies) eller 45 sykluser ved 94 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s og 70 ° C i 30 s, innledes med en innledende aktiveringstrinn ved 95 ° C i 15 min (Qiagen).
Statistiske analyser
forskjellene mellom variablene ble vurdert med
Chi-2
eller Fishers eksakte test, når det er nødvendig. Student t-test ble anvendt for å evaluere forskjellene i MIR ekspresjonsnivåer.
Som tidligere beskrevet av Duval
et al.
, Et forhold på sannsynlighet ble beregnet til å tilordne hver miRNA til en frekvensgruppe [ ,,,0],24]. Med
N
i
, antall svulster som ble testet på locus
i
og
n
i
, antall svulster ustabile på dette locus, den
H1
alternativ hypotese forutsetter tilstedeværelsen av to typer loci (ie. miRNA gener) som varierer i sine mutasjon frekvenser (en «stabil» gruppe med en lav mutasjonsraten,
p
1
, og en «ustabil» gruppe med høy mutasjonsraten,
p
2
α og 1-α er proporsjonene av nettsteder med
p
1
. og
p ustabilitet henholdsvis
2
). Motsatt antar
H0
nullhypotesen om at alle miRNA gener kan grupperes på en frekvens klasse,
p
0
, hvor ingen signifikante forskjeller mellom hver miRNA locus. Forholdet mellom sannsynligheten er gitt ved:
Dette forholdet følger en khikvadratfordeling med to frihetsgrader
For alle tester, en 95% konfidensintervall ble brukt og
P.
0,05 ble betraktet som signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Alleliske profiler av polymorfe miRNA gener i LBLs. For
HSA-mir-1303 plakater (T
13),
HSA-mir-620 plakater ((TA)
11) og
HSA-mir-558
((GT)
18) gener, den polymorfe sonen er bestemt mellom den minste og den største alleler (som ligger mellom de to stiplede vertikale linjer) observeres i en stor serie av 40 lymfoblastoide cellelinjer fra friske individer. Lengden av de dominerende alleler (bp) er angitt i en boks under hver profil
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031862.s001 plakater (TIF)
Figur S2. Host Sammenligning av mutasjonsfrekvenser av miRNA MNRs til de av exonic, uoversatt, intronic eller intergeniske MNRs. MNRs med størrelser mellom 7 og 13 bp og forskjellige genomiske steder ble tatt med i denne sammenligning. Disse MNRs er hentet fra SelTarbase (https://www.seltarbase.org/, oktober 2010-versjonen), en åpen database av menneskelige mononucleotidic mikro mutasjoner i MSI kreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031862.s002
(TIF)
Figur S3.
Klassifisering av miRNAs med MNR basert på deres mutasjon frekvenser i MSI CRC cellelinjer.
