Abstract
Kreft initiere celler (CIC) representerer en unik cellepopulasjon viktig for vedlikehold og vekst av svulster. Mest
in vivo
studier av CIC utnytte menneskelige tumorxenotransplantater i immunsvikt mus. Disse modellene gir begrenset informasjon på samspillet mellom CIC med vertens immunsystemet og er av begrenset verdi i å vurdere behandlingsformer rettet mot CIC, spesielt immun-basert terapi. For å vurdere dette, er en syngene kreft modell nødvendig. Vi undersøkte sfæren dannende kapasitet på tretten muse-lungecancer cellelinjer og identifisert TC-1 og et metastatisk subklon av Lewis lungekarsinom (HM-LLC) som cellelinjer som lett dannes og opprettholdes sfærer over flere passasjer. TC-1 tumorspheres ble ikke beriket for uttrykk av CD133 eller CD44, antatte CIC markører, heller ikke de demonstrere Hoechst 33342 side befolkningen flekker eller Aldefluor aktivitet sammenlignet med heft TC-1 celler. Men i tumorsphere kultur, disse cellene oppviste selvfornyelse og langsiktig symmetrisk fordeling kapasitet og uttrykt mer oktober-4 sammenlignet med adherente celler. HM-LLC sfære-deriverte celler utstilt økt oktober-4, CD133, og CD44 uttrykk, viste en Hoechst 33342 side befolkning og Aldefluor aktivitet sammenlignet med heftende celler eller en lav metastatisk subklon av LLC (LM-LLC). I syngene mus, HM-LLC sfære-deriverte celler kreves færre celler for å initiere tumorigenesis sammenlignet med tilhenger eller LM-LLC celler. Tilsvar TC-1 sfæren-deriverte celler var mer tumorigent enn heftende celler i syngene mus. I motsetning til dette, i immunkompromitterte mus, mindre enn 500 sfære eller heftende TC-1-celler og mindre enn 1000 sfære eller adherente LLC celler som var nødvendig for å initiere en svulst. Vi foreslår at ingen enkelt fenotypisk markør kan identifisere CIC i murine lunge kreft cellelinjer. Tumorsphere kultur kan gi en alternativ tilnærming til å identifisere og berike for murine lunge CIC. Videre foreslår vi at vurderingen tumorigenicity av murine lunge CIC i syngene mus bedre modeller samspillet mellom CIC med vertens immunsystemet
Citation. Morrison BJ, Steel JC, Morris JC (2012) Sphere kultur av Murine Lung Kreftcellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP er beriket med kreft Starte Cells. PLoS ONE 7 (11): e49752. doi: 10,1371 /journal.pone.0049752
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 12 juli 2012; Godkjent: 15 oktober 2012; Publisert: 13.11.2012
Copyright: © 2012 Morrison et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Divisjon for hematologi-onkologi, University of Cincinnati. BJM ble støttet av en University of Cincinnati, University Research Council, Postdoktor Research Program stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er årsaken til nesten 20% av alle kreftdødsfall i USA [1]. Det står for flere dødsfall enn de neste fire vanligste kreftformer til sammen. Til tross for forbedringer i diagnostikk og behandling, den samlede fem års overlevelse for alle pasienter med lungekreft er en sturen 15%, og dette synker til mindre enn 2% hos pasienter med metastatisk sykdom [2]. Derfor er lungekreft et stort folkehelseproblem, og en bedre forståelse av sykdommen biologi og forbedringer i behandlingen er sterkt nødvendig.
Økende bevis støtter ideen om en spesialisert populasjon av celler i svulster kalles kreft initiere celler (CIC), alternativt «kreftstamceller» eller tumor-initiering celler. Disse cellene er antatt å være ansvarlig for svulst opprinnelse, vedlikehold, progresjon, og motstand mot terapi. CIC viser funksjonelle egenskaper stamceller slik som evne til selvfornyelse og evnen til å gi opphav til differensierte avkom. Putative CIC er blitt identifisert i myeloid leukemi [3], og tumorer i hjernen [5], [6] og bryst [7]. Mer nylig har lunge CIC blitt isolert fra humane cellelinjer og pasientprøver [8] – [15]. Gransker lunge CIC kan øke forståelsen av opprinnelsen til lungekreft og kan føre til nye terapeutiske tilnærminger rettet mot disse cellene.
CIC har vist seg å danne flercellede tredimensjonale kuler
in vitro
når dyrket i ikke-adherente serumfrie betingelser [6], [16]. Under disse betingelser er de fleste tumorceller gjennomgå anoikis, en form for programmert celledød, mens de sjeldne CIC dividere å generere tumor kuler. Sfæren-analyse og en nylig foreslått matematisk tolkning tillate for vurdering av den symmetriske fordeling ekspansjonsrate av ondartet stamcelle-lignende celler, og evaluering av effekten av behandling på den selvfornyelse og proliferativ aktivitet av disse celler [17]. Denne analysen er et kraftig verktøy for å vurdere de funksjonelle og fenotypiske egenskaper knyttet til CIC. I en studie med pasient lungekreft prøver, ble sfære dannelsen funnet i syv av 19 svulster undersøkt [10]. Disse cellene ble funnet å ha
in vitro
og
in vivo
egenskaper av CIC inkludert selvfornyelse, proliferative og differensiering kapasitet, ekspresjon av CD133, berikelse for side populasjon (SP) celler, ekspresjon av embryonale «stemness» gener okt-4 og Nanog, kjemoterapi motstand, og tumorgenisiteten. Sfære kultur har vært brukt for å anrike for lungekreft CIC populasjoner [8], [9], [13], [14].
Mikrofotografier (10x) av passasjen 2. dag 7 sfære kulturer av (A) TC -1 kuler, (B) HM-LLC kuler og (C) LM-LLC sfære mediekultur. Bar = 100 mikrometer. (D) Totalt fold ekspansjon og (E) symmetrisk divisjon frekvens over åtte passasjer for TC-1 sfærer (rød) og HM-LLC sfærer (svarte), og to passeringer for LM-LLC sfære mediekultur (grå) viser signifikante forskjeller; * P 0,001. (F-G) Brett utvidelse i løpet av sju passasjer for TC-1 sfærer (rød) og HM-LLC sfærer (svart). (H) Passage 2 sfærer ble dyrket og tellet for totale antall celler på de dager som er vist. Eksperimenter gjentatt to ganger, representative resultater vist. På dag 1 det totale antall celler i kulturen reduseres. De overlevende mitogen-responsive kreft initiere cellene er ansvarlige for celledeling og generering av ferske flercellede kuler som kan høstes på dag 7. Barer: ± Standardfeil for gjennomsnittet (SEM)
Murine lungekreft er ikke blitt godt karakterisert for tilstedeværelse og hyppigheten av CIC. Flertallet av studier av lunge CIC har brukt menneskelige cellelinjer eller primær tumorprøver, med tumorgenisiteten undersøkt utelukkende hos immunsupprimerte musemodeller. Viktigere, interaksjoner mellom immunsystemet og tumormikromiljøet er blitt demonstrert å spille en rolle i respons på behandlingen. Faktisk, lungekreft og mange andre tumorer som opptrer i immunkompromittert vert oppfører seg mer aggressivt, responderer dårlig på behandling, og har dårligere resultater [18], [19]. Derfor, for å mer nøyaktig modell immun interaksjoner involvert i etableringen av tumorer ved CIC, undersøkte vi muse-lungetumorceller anriket for CIC i en immunkompetente syngene dyr. Den aktuelle studien rapporterer identifisering og karakterisering av murine lunge CIC bruker sfære kultur metoder og sammenlignende vurdering av disse cellene i syngene og immunsupprimerte musemodeller.
Materialer og metoder
Cells
Murine TC-1 og foreldre Lewis lungekarsinom (LLC) celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). Den høye metastatisk (HM-LLC) og lav metastatisk (LM-LLC) subkloner av LLC [20], [21] var gaver fra Dr. Zhongyun Dong (University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio), og ble dyrket som adherente celler i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (media~~POS=TRUNC, Inc., Manassas, VA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1% penicillin G-streptomycin (Invitrogen). Cellelinjer 18948, 18955-tilhenger, 18955-Floating (en ikke-klebende klone av 18955 celler), og 18959 celler er
de novo
murine småcellet lungekreft (SCLC) cellelinjer og var en gave fra Dr . Kathryn Wikenheiser-Brokamp (Cincinnati Medisinsk senter for barn, Cincinnati, OH). Disse cellelinjene ble studert under The University of Cincinnati Institutional Animal Care og bruk Committee godkjenning (Protokoll nr 11-03-21-01). Murine lungetumorcellelinjer MLE12 og MLE15 [22], som stammer fra transgene mus som bærer den simian virus 40 (SV40) stort tumorantigen under transkripsjonen kontroll av den humane overflateaktivt protein C (SP-C) promotoren, var gaver fra Dr. Jeffrey Whitsett (Cincinnati Medisinsk senter for barn). SCLC-cellelinjer og MLE12 og MLE15 celler ble dyrket i Hites medier [23]. Murine adenokarsinom lungekreft cellelinjer 393P, 344P, og 344SQ [24] avledet fra Kras
La1 /+ p53
R172HΔG mus var en gave av Jonathan M. Kurie (The University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston , TX) og ble dyrket i DMEM med 10% FCS.
Dyr og etikk erklæringen
C57Bl /6 mus ble oppnådd fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og NOD-SCIDγ (NSG , NOD.Cg-
Prkdc
SCID Il2rg
tm1Wjl Twitter /SzJ) mus fra en etablert kolonien ved Cincinnati Children «s Medical Center. The University of Cincinnati Institutional Animal Care og bruk komité gitt godkjenning for dette arbeidet (Protokoll nr 11-03-21-01). Alle prosedyrer var i samsvar med institusjonelle dyrevelferd retningslinjer, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Real time PCR kvantifisering ble gjort for oktober-4, et gen assosiert med stamcelleselvfornyelse, mRNA uttrykk. TC-1 sfærer (A) og HM-LLC sfærer (b) vise økt Oct-fire uttrykk sammenlignet med matchede heftende celler; * P≤0.001. HM-LLC celler uttrykt betydelig mer Oct-4 enn LM-LLC heftende celler; ** P = 0.005. Tomter representerer kombinert data fra 2-4 biologiske replikater, hver med tre tekniske replikater. TC-1 celler (røde); LM-LLC tilhenger (grå); HM-LLC celler (svart). Barer:. ± SEM
(A-B) Representative tomter viser Aldefluor farging (blå) og DEAB kontroll farging (rød) for HM-LLC, LM-LLC og TC-1 heftende celler i forhold til passasje 2, dag 1 og dag 7 kule-avledede celler. Aldefluor høyt uttrykkende celler (rektangulær boks) er betydelig større i (C) frekvens og (D) midlere fluorescensintensitet (MFI) av Aldefluor innenfor HM-LLC kuler i forhold til LM-LLC eller HM-LLC adherente celler, og HM-LLC adherent celler uttrykker mer Aldefluor enn LM-LLC heftende celler; frekvens (C) * P≤0.001; MFI (D) * P≤0.002. Sammenlignet med DEAB flekker, ble Aldefluor positivitet (ikke-rektangulær boks) funnet å være betydelig høyere i TC-1 heftende celler i forhold til kuler (E); * P≤0.004. MFI av Aldefluor innenfor TC-1-grupper (F) ble ikke funnet å være vesentlig annerledes. Ingen Aldefluor høy befolknings var kjent for TC-1 kuler eller heftende celler. Tomter representerer kombinert data fra to biologiske rapporter med tre tekniske replikater hver. Barer:. ± SEM
Representative SP tomter for (A) LLC celler og (B) TC-1 celler sammenligne matchet heftende celler til passasjen 2, dag 1 og dag 7 kule-deriverte celler. Hoechst 33342 farging ble bekreftet med verapamil blokade. (C) SP frekvens var signifikant økt i HM-LLC kuler i forhold til adherente celler; * P 0,001; ** P≤0.012. HM-LLC og LM-LLC adherente celler var ikke signifikant forskjellige for SP frekvens. (D) SP ble ikke funnet å være oppregulert i sfæren-avledet TC-1 celler sammenlignet med matchede heftende celler. Dag 1 kule-deriverte celler hadde signifikant lavere frekvens av SP celler sammenlignet med heftende celler og dag 7 kule-deriverte celler; * P = 0,03. Tomter representerer kombinert data fra tre biologiske replikater med tre tekniske replikater hver. Barer:. ± SEM
(A) Representant flowcytometri tomter for CD133 (Y-aksen) og CD44 (X-aksen) co-farging. (B og D) Den midlere fluorescensintensitet (MFI) av CD44 er vist korrigert for intensiteten av isotype farging for LLC og TC-1-celler. (B) HM-LLC kuler og adherente celler samt LLC (ATCC) celler uttrykker høyere mengder CD44 sammenlignet med LM-LLC celler. Kule-avledede celler ble funnet å ha en lavere MFI for CD44 sammenlignet med HM-LLC adherente celler. D7 kule-avledede celler hadde et lavere MFI for CD44 sammenlignet med D1-celler; * P 0,001. (D) Dag 1 TC-1 sfæren-deriverte celler uttrykker mindre CD44 enn dag 7 eller heftende celler; * P≤0.002. (C) CD133 hyppighet av positive celler er høyere i HM-LLC kuler i forhold til LM-LLC adherente celler; * P≤0.043. CD133 ekspresjon var ikke signifikant forskjellig mellom HM-LLC adherente celler og kuler eller blant de tre forskjellige LLC adherente celler. (E) Ingen signifikant forskjell i CD133 uttrykk blant kulturbetingelsene til TC-1. Eksperiment gjort i triplikat, representative resultater er vist. Barer:. ± SEM
Konfidensintervall tomt på begrensende fortynning analysen er vist med y-aksen viser estimert hyppighet av kreft initiere celler (CIC). (A) En begrensende fortynning av TC-1-celler (120 000, 80 000, 40 000, 10 000, 5000, og 1000) ble injisert subkutant i syngene C57BL /6 mus (n = 4 til 8). Sphere avledede celler ble funnet å være mer enn tumorigen adherente celler; * P≤0.001; ** P 0,02. Dag 1 kule-deriverte celler var mer tumorigent enn dag 7; *** P = 0,04. En begrensende fortynning (10000, 1000, og 500-celler) (n = 6 til 8) av de samme tre grupper ble injisert i mus og NSG CIC frekvens ble funnet å være under 1/500 for alle grupper. (B) Analyse av LLC begrensende fortynning svulst eksperiment for syngene (80.000, 40.000, 20.000 og 10.000 celler) og redusert immunforsvar (NSG) mus (80000, 40000, 10000 og 1000 celler) (n = 4-9). Ingen signifikante forskjeller bemerket; imidlertid, kule-avledede celler trend mot å bli mer tumorigen enn HM eller LM-adherente celler i C57BL /6 mus. Lavere antall implanterte cellene var nødvendig å sette i gang svulster i immunsupprimerte dyr enn i syngene dyr med den estimerte CIC frekvens under 1/1000 for alle LLC grupper.
Tumorsphere Analyser
Celler ble kultivert som tumorspheres i DMEM /F12 (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) som inneholder 20 ng /ml rhEGF (R STEMCELL Technologies, Inc., Vancouver, BC). I korthet ble cellene inkubert i 60 minutter ved 37 ° C i nærvær av Aldefluor reagens, alene eller med tilsetning av en diethylaminobenzaldehyde (DEAB) -inneholdende oppløsning som blokkerer ALDH1 aktivitet. Data ble samlet inn ved hjelp av en Epics XL-MCL strømningscytometer (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Ikke-levedyktige celler ble ekskludert fra analyse ved hjelp av propidiumjodid (Sigma) farging. Aktivitet ble vurdert ved hjelp av matchende DEAB kontrollprøver. Data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (Tre Star, Inc., Ashland, Oregon).
Hoechst 33342 side Befolkning (SP)
Hoechst 33342 fargestoff flekker SP-analyse ble utført ved bruk av metoder tilpasset fra Goodell et al. [26]. Kort sagt ble en million celler ble inkubert med 10 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma) i 90 minutter ved 37 ° C. Bekreftelse av SP-celler ble utført ved anvendelse av 50 uM verapamil (Sigma) for å blokkere utstrømning av fargestoffet. Data ble samlet inn ved hjelp av en LSRII flowcytometer (BD Biosciences). Ikke-levedyktige celler ble ekskludert fra analysen.
Sanntids Reverse Transcription-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp PureLink ™ RNA mini-kit (Invitrogen). RNA ble revers transkribert i 20 ul ved å bruke Verso cDNA kit (Thermo Fisher Scientific, Surrey, UK) og GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA). Analyse av Oct-4-ekspresjon ble utført ved anvendelse av Plexor® qPCR System (Promega, Madison, WI) reagenser og StemElite ™ Mus-Pou5f1 /ACTB primerpar (Promega) inneholdende primere for både Okt-4 og β-aktin-genet. Data ble samlet inn ved hjelp av Bio-Rad CFX96 ™ RT-System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og analysert ved hjelp av Plexor® analyse programvare. Alle real-time RT-PCR resultater ble utarbeidet etter tre til seks tekniske rapporter for hver biologisk replikere og to til fire biologiske gjentar ble gjort for hver prøve – matchet heftende celler og passasje 2 (P2) dag 1 (D1) og dag 7 ( D7) sfære-deriverte celler. Data ble normalisert til endogen β-aktin for hver prøve. Prøvene ble standardisert til enten TC-1 eller HM-LLC heftende celler for å sammenligne uttrykket nivåer mellom prøvene.
In vivo startfasen
En begrensende fortynning av TC-1 (120 000, 80 000, 40 000 , 10 000, 5000, eller 1000) celler fra avstemt adherent og P2 sfære-avledet D1 D7 eller kulturer ble injisert subkutant inn i flankene av C57Bl /6-mus (n = 4 til 8). En annen begrensende fortynning av celler (10000, 1000, og 500-celler) for de samme tre betingelser ble også injisert i NSG mus (n = 6 til 8). Tilsvarende for LLC celler en begrensende fortynning eksperiment på 80.000, 40.000, 20.000 eller 10.000 celler for C57Bl /6 og 80 000, 40 000, 10 000, eller 1000 celler for NSG mus ble foretatt (n = 4 til 9). Musene ble overvåket to ganger ukentlig for tid-til-tumordannelse. Tumor overlevelse opp til dag 65 ble vurdert.
Statistical Analysis
Sigmaplot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL) ble brukt for statistisk analyse. Elevens
t
-test ble brukt til å sammenligne grupper. For
in vivo
tumordannelse, begrensende fortynning analyse estimere forskjeller i stamcelle /kreft initiere cellefrekvens blant prøvene ble utført ved hjelp av Extreme begrenset fortynning Analysis (ELDA) programvare som tidligere beskrevet [27]. Nivået av statistisk signifikans ble satt til 0,05.
Resultater
Sphere Forming Kapasitet
SFC ble undersøkt i 13 murine lungekreftcellelinjer eller subkloner av cellelinjer avledet fra ulike murine genetiske bakgrunn (tabell 1). SFC var kjent for ni av disse cellelinjene. Imidlertid SFC ikke alltid korrelerer med evnen til kulturen som kuler enn seriepassasjer. Av de ni cellelinjer som dannet kuler og ble testet for langsiktig kultur kapasitet, bare to, TC-1 og HM-LLC viste vedvarende vekst over serie passasjer. TC-1 og HM-LLC celler var i stand til å danne tredimensjonale sfæroidene i kultur (Figurene 1A og 1B). LM-LLC celler (figur 1C) og foreldre LLC cellene ikke danner kuler og var ute av stand til langvarig passasje i sfære kultur. TC-1 og HM-LLC kuler viste en FE potensiell 1 over flere passasjer (figur 1D). Sphere kulturer av TC-1 og HM-LLC viste en positiv kreftstamcelle /CIC symmetrisk divisjon frekvens, mens LM-LLC celler ikke (figur 1E). Dette indikerer at sfære mediedyrkningsbetingelser kan identifisere mulige CIC for disse to cellelinjer. FE var relativt stabil over passasje nummer for TC-en (figur 1F) og HM-LLC (figur 1G) kuler. Innen 24 timer etter passering ca 30% (HM-LLC) eller 54% (TC-1) celler gjennomgå anoikis /celledød (figur 1 H). De resterende mitogen-responsive celler ved D1 gikk på å danne kuler av D7. Vi antok at D1 cellene ble beriket for CIC forhold til D7 celler, som D7 cellene var mer sannsynlig å være sammensatt av noen CIC og større antall differensierte kreftceller.
Oct-4 mRNA uttrykk forsterkes i Sphere avledede Cells
uttrykk for oktober-4, et gen som er involvert i stamcelleselvfornyelse og en viktig regulator av pluripotency som kan alene omprogrammere celler til pluripotency [28], ble vurdert i matchet tilhenger og passage to, D1 og D7 sfære celler for TC 1-og HM-LLC, og tilhenger LM-LLC celler. Data ble normalisert til ekspresjon av β-actin og standardisert til uttrykk nivåer av enten TC-1 (figur 2A) eller HM-LLC adherente celler (figur 2B). Sphere-deriverte celler uttrykt betydelig større oktober-4 mRNA enn matchet heftende celler; P≤0.001. TC-en sfære dyrkede celler fra enten D1 eller D7 uttrykt omtrent seks ganger mer Oct-4 sammenlignet med heftende celler. HM-LLC kuler fra enten D1 eller D7 uttrykt over 1,7 ganger mer Oct-4 enn heftende celler. LM-LLC heftende celler uttrykte oktober-4 på ca 60% nivåene av heft HM-LLC celler. Uttrykk for SOX2 og Nanog som er knyttet til selvfornyelse og stemness, ikke ble funnet å være signifikant forskjellig uttrykt mellom kuler og heftende celler (data ikke vist).
Aldefluor Aktiviteten er forbedret i HM-LLC, men ikke i TC-1 Spheres
ALDH1 uttrykk og aktivitet har blitt korrelert med CIC aktivitet og økt aggressivitet av lungesvulster [12]. Vi undersøkte ALDH1 aktivitet i matchet tilhenger og sfære kulturer. Representative tomter er vist for tilhenger HM-LLC og LM-Advisor forhold til P2, D1 og D7 sfære dyrkede celler (figur 3A) og for tilhenger TC-1 celler i forhold til P2, D1 og D7 sfære dyrkede celler (Figur 3B). For HM-LLC kuler, ble et delsett av høy-Aldefluor uttrykkende celler funnet å være signifikant øket i sfæren dyrkede celler i forhold til HM-LLC eller LM-LLC adherente celler (figur 3A); P≤0.001 for frekvens, og P≤0.002 for midlere fluorescensintensitet (MFI) (figur 3C og 3D). TC-1-adherente og kule-avledede celler uttrykte lave nivåer av Aldefluor aktivitet (figur 3B). Adherente TC-1-celler demonstrerte flere Aldefluor-positive celler i forhold til kule-avledede celler (figur 3E); P≤0.004. Disse nivåene var ikke signifikant forskjellig når analysert for MFI (figur 3F).
SP er forbedret i HM-LLC, men ikke i TC-1 Spheres
Vi undersøkte matchet heft celler, og P2, D1 og D7 sfære kulturer med Hoechst 33342 for SP. Som en kontroll, ble verapamil anvendt til å forstyrre aktiviteten av Hoechst 33342 transportør. SP ble definert som den reduserte populasjon av celler i nærvær av verapamil. Eksempler på profiler for LLC celler (figur 4A) og TC-1-celler (figur 4B) er vist. SP frekvens ble funnet å være økt i løpet av kuler av HM-LLC forhold til adherente celler fra enten HM-LLC eller LM-LLC; P≤0.012 for D1 kuler og P 0,001 for D7 sfærer (Figur 4C). Den gjennomsnittlige brøkdel av SP celler i tre biologiske gjentakelser for HM-LLC P2, D1 sfærer var en ± 0,5%, for P2, D7 kuler 2 ± 0,7%, for HM-LLC heftende celler 0,4 ± 0,4% og for LM-LLC tilhenger cellene 0,4 ± 0,3%. TC-1 tilhenger og sfære-kulturer uttrykkes lave frekvenser av SP celler. SP frekvens ble ikke funnet å være forbedret for sfære kultivert i forhold til tilhenger TC-1 (figur 4D). Dag 1 kule-avledede celler ble funnet å ha en redusert hyppighet av SP-celler sammenlignet med adherente celler eller D7 kule-avledede celler; P = 0,03.
CD133 Expression økes i HM-LLC Spheres og CD44 uttrykk forsterkes i HM-LLC celler Sammenlignet med LM-LLC celler
I tillegg til å vurdere funksjonelle egenskaper CIC slik som ALDH1 aktivitet og Hoechst fargestoff 33342 effluks, vi også søkt å karakterisere TC-1 og LLC celler for ekspresjon av CD44 og CD133, antatte CIC celleoverflatemarkører. Representative tomter til CD44 og CD133 er vist (figur 5A). Blant TC-1-celler og LLC, alle cellene uttrykte CD44. CD44 uttrykk for HM-LLC kuler i forhold til HM-LLC heftende celler viste en nedgang for kuler i samlet uttrykk (5A og 5B). CD44 ekspresjon var variabel mellom LLC cellelinjer og dyrkningsbetingelser (figurene 5A og 5B). Heftcellelinjer vises en mer homogen uttrykk for CD44, mens kule-dyrkede celler viste en mer heterogen uttrykk med noen celler uttrykker redusert mengder av CD44, mens de fleste forble CD44 lyse. CD44 MFI ekspresjon ble funnet å redusere mellom D1 og D7-celler; P 0,001 (figur 5B). LM-LLC celler vises det minste intens farging for CD44 sammenlignet med alle andre LLC celletyper og dyrkningsbetingelser; P 0,001 (figur 5A). Ingen forskjell ble påvist for uttrykk av CD133 blant HM-LLC heftende celler og P2, D1 og D7 sfære kultur celler; imidlertid var det en betydelig økning i hyppigheten av CD133 positivitet blant HM-LLC kuler, både D1 D7 og dyrkede celler sammenlignet med LM-LLC celler (figur 5C).
CD44-ekspresjon ble redusert i P2, D1 sfære-deriverte celler for TC-1 celler sammenlignet med heftende celler og P2, D7 celler (figur 5D). Ingen forskjell i CD44-ekspresjon ble notert for P2, D7 TC-1-celler i forhold til heftende TC-1-celler. Ingen signifikante forskjeller ble bemerket i uttrykk av CD133 mellom TC-en celledyrkningsforhold (figur 5E) de.
Sphere-deriverte celler viser større tumorigenicity i syngene mus Sammenlignet med heftende celler
Vi vurderte den tumorigenitet av D1 og D7 kuler i forhold til heftende celler. Vi har også undersøkt den tumorigenisitet av disse cellene i immunkompetente syngeniske mus, sammenlignet med immunkompromitterte mus NSG for bedre å kunne ta opp den CIC-modellen i disse to forskjellige muse miljøer [29]. Ved hjelp av en begrensende fortynning analyse, ble TC-1 sfærer syntes å være betydelig mer tumorigene i syngeniske mus sammenlignet med TC-1 adherente celler; P≤0.001 for P2, D1-celler og P = 0,0158 for P2, D7-celler (figur 6A). D1 TC-1 sfærer var mer tumorigent enn D7 sfærer; P = 0,04. TC-1-P2, D1 sfærer ble anslått å ha en CIC frekvens på 1 celle pr 9,533 celler. P2, D7 sfærer var det neste mest tumorigen med en estimert CIC frekvens på 1 celle pr 21,918 celler, og adherente celler ble funnet å være den minst tumorigen med en estimert frekvens på 1 celle pr 62,129 celler. For LLC celler implantert i syngene mus, var det en trend for lavere CIC frekvens blant sfærer (D1 celler, en per 29 694 celler og D7 celle 1 per 35 949 celler) sammenlignet med heftende celler (HM-original 1 per 46 989 celler og LM-LLC 1 per 49 686 celler), men denne trenden nådde ikke signifikans (figur 6B). I NSG mus alle fortynninger av hver cellelinje og dyrkingsbetingelser testet var istand til å danne svulster i 100% av musene. Når testet, mindre enn 500 celler for TC 1-og mindre enn 1000 celler for LLC celler var tilstrekkelig til å etablere svulst i NSG mus (Figur 6A og 6B).
Diskusjoner
De fleste av studier av CIC har brukt pasient-avledet materiale eller etablerte humane tumorcellelinjer inokulert inn i immunkompromitterte mus. Selv om disse xenograft studier tillate identifisering av en sub-populasjon av celler i stand til å rekapitulere en svulst i en immunsupprimerte mus, kan de ikke gi et riktig bilde av hva som kjennetegner sanne CIC. For å danne en tumor i et menneske, må potensielle CIC samvirke med immunsystemet for å forhindre tumor gjenkjennelse og eliminering. Som bevis for dette, viste vi at syngene immunkompetente mus krever betydelig flere celler til å sette i gang en svulst enn immunsupprimerte mus. Fra dette kan det bli postulert at det er en større populasjon av celler i stand til å vokse tumorer hos immunkompromitterte mus som ikke kan sette i gang tumorer i sine syngeniske motstykker, og at de sanne CIC kan representere en langt sjeldnere befolkning enn bestemt i xenograph modeller.
anvendelsen av kulen kulturen for å detektere mulige CIC har vært brukt i forskjellige tumorer [10], [16], [17], [30]. Så vidt vi vet er dette første gang at et panel av murine lungekreftcellelinjer har blitt systematisk undersøkt for sfære dannende evne og berikelse av CIC (tabell 1). I særdeleshet, TC-1 og HM-LLC sfærer var i stand til vedvarende vekst i kultur. Ved passering, et betydelig antall celler dør i løpet av de første 24 timene. Dette tyder på at det innenfor kule kulturer der eksisterer en sub-populasjon av celler som er i stand til selvfornyelse og proliferasjon, antatte CIC. Men ikke alle cellelinjer var i stand til vedvarende vekst som kuler. Syv av de ni cellelinjer som ble dannet kuler og ble testet for langtidskultur kapasitet hadde en FE under eller innenfor et standardavvik på 1 (tabell 1). En FE under ett viser at andre celler med begrenset spredning kapasitet foruten sanne CIC kan danne kuler, eller at de sanne CIC kanskje asymmetrisk dele over tid i differensierte celler ikke er i stand til kultur i sfære forhold. Derfor er sfære formasjon i løpet av en eller to passeringer ikke så nyttig for å identifisere CIC som er forlenget sfære kultur over flere passasjer og anvendelse av en matematisk modell for vurdering av CIC symmetrisk fordeling frekvens [17].
I motsetning til foreldre LLC og LM-celler LLC, HM-LLC celler som er i stand til å danne kuler som kan bli passert mer enn åtte ganger, og oppviste en robust gangers ekspansjon og symmetrisk divisjon frekvens. I tillegg ble sfære formasjon kjent for de metastatiske murine lunge adenokarsinom linjer 344P og 344SQ, men ikke for den ikke-metastatisk cellelinje 393P. Disse tre cellelinjene er tidligere blitt rapportert å danne tredimensjonale kuler i matrigel kultur og metastase utsatt linjer er blitt karakterisert som er i stand til å gjennomgå en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) [24]. Det har vært antydet at det kan være en direkte kobling mellom EMT av celler og kjøpet av en stamcelleliknende /CIC fenotype [31]. Våre resultater tyder på at metastatiske celler har en beriket evne til kultur som ikke-heftende kuler, og at metastatiske celler er beriket for CIC. Fremtidige studier er nødvendig for å løse dette.
Vi viste at hyppigheten av CIC endringene i løpet av en passasje for muse-lungekreft tumorspheres.
