Abstract
stress har blitt foreslått å være en tumor-fremmende faktor ved sekresjon av bestemte neuromediators, slik som Urocortin2 og 3 (Ucn2 /3), men dens rolle i kolorektal cancer (CRC) fortsatt ukjent. Vi observerte at Ucn2 /3 og deres reseptor den kortikotropin frigjørende faktor reseptor 2 (CRF2) var oppregulert i høy klasse og dårlig differensiert CRC. Dette tyder på en rolle for CRF2 i tap av cellulær organisering og tumorprogresjon. Ved hjelp av HT-29 og SW620 celler, to CRC cellelinjer forskjellige i sine evner til å utføre celle-celle kontakter, fant vi at CRF2 signaler gjennom Src /ERK vei å indusere endring av celle-celle veikryss og transport av p120ctn og Kaiso i kjernen. I HT-29-celler, dette signalveien fører også til ombygging av celleadhesjon ved i) fosforylering av fokal adhesjonskinase og ii) en modifikasjon av aktin cytoskjelettet og kontaktklebe komplekser. Disse hendelsene stimulere celle migrasjon og invasjon. I konklusjonen, våre funn tyder på at CRF2 signaliserer kontroller cellular organisasjon og kan fremme metastatisk potensial av menneskelige CRC cellene gjennom en epitelial-mesenchymale overgang lignende prosess. Dette bidrar til forståelsen av tumorfremmende effekter av stress molekyler og utpeker Ucn2 /3-CRF2 tandem som et mål å forebygge CRC progresjon og aggressivitet
Citation. Ducarouge B, Pelissier-Rota M, Lainé M Cristina N, VACHEZ Y, Scoazec JY, et al. (2013) CRF2 Signa er en roman Regulator av Cellular Adhesjon og migrasjon i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (11): e79335. doi: 10,1371 /journal.pone.0079335
Redaktør: Alice Y. W. Chang, Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan
mottatt: 1 juli 2013; Godkjent: 30 september 2013; Publisert: 18.11.2013
Copyright: © 2013 Ducarouge et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av foreningen pour la Recherche sur le Cancer (www.arc-cancer.net), Ligue Nationale contre le Cancer (www.ligue-cancer.net), Association François Aupetit (www.afa.asso.fr), GEFLUC (www.gefluc.org) og ESPOIR Isère Cancer (www.espoir-isere-cancer.com). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i vestlige land. Histologisk grad er en viktig prognostisk markør som høyverdig, dårlig differensierte svulster er vanligvis mer aggressive og invasive enn deres lavgradig, godt differensierte kolleger. Et kjennetegn på CRC er tap av mobilnettet organisasjonen. Selvklebende interaksjoner mellom celler og ekstracellulære matriks (ECM) er viktige faktorer som bestemmer vev organisasjon og deres modulasjoner delta i cellemigrasjon og metastase.
I epitelceller, celle-celle adhesjon opprettholdes gjennom flere protein komplekser som adherens kryss (AJ). Cadherins er transmembrane proteiner som nucleate AJ ved å danne homotypisk kalsium avhengige interaksjoner med cadherins fra nabocellene. Manipulering av E-cadherin funksjon i tarmepitelet har åpenbart en viktig rolle i celledifferensiering eller celle /matrise-adhesjon [1]. E-cadherin er redusert i invasiv CRC sammen med kjøpet av en mesenchymale fenotype [2]. Den intracellulære domenet av E-cadherin samhandler direkte med p- og P120 catenins (CTN). De regulerer AJ ved å kontrollere cadherin clustering, endocytose eller stabilitet og aktin cytoskjelettet forankring (anmeldt i [3]). I E-cadherin manglende celler p120ctn transport til cytoplasma og /eller kjernen hvor den utøver ulike funksjoner avhengig av dets partnere [4], [5]. I kjernen, kan p120ctn samvirke med transkripsjonsfaktor Kaiso og avlaster dets gen undertrykkelse aktivitet [6], [7]. Unormal kjernefysiske lokalisering av p120ctn og Kaiso er prognostisk for aggressivitet i CRC [8].
Micro-miljøet styrer kreft progresjon gjennom cellekontakter eller mekler signaler [9]. Den kortikotropin frigjørende faktor (CRF) og analoger som urocortins (Ucns) [10] skilles peptider relatert til stress. De virker gjennom to G-protein-koblede reseptorer, CRF1 og CRF2, med forskjellige affiniteter [11]. CRF og Ucn1 binde begge reseptorer, mens Ucn2 /3 er selektive for CRF2. CRF-reseptorer er primært koplet til Gas og utløse cAMP-dannelse via adenylylcyklase aktivering [12]. Hvis CRF-systemet er godt dokumentert i mage-tarmkanalen for dets ekspresjon og regulering av stress og inflammasjon, er dens implikasjon i CRC dårlig undersøkt [13], [14]. Ligander og reseptorer er uttrykt og utskilt ved hjelp av forskjellige normale og kreftceller. Derfor kan CRF system modulere tumor mikro-miljø ved auto /paracrine aktiveringer på kreft eller stromale celler [9], [15], [16]. Hensikten med denne studien var å bestemme ekspresjon av CRF2 og dets ligander i CRC og hvordan deres signalering kunne delta i tumorprogresjon. Våre resultater er beskrevet avvikende uttrykk for CRF2 og ligander i både CRC svulster og cellelinjer, i henhold til deres karakter og /eller differensiering status. Bruke HT-29 og SW620 cellelinjer, oppdaget vi at CRF2 signale endrer mobilnettet vedheft og etablert en mekanisme som reke molekyler kan delta i tumorprogresjon.
Materialer og metoder
Cell kultur
humane kolon adenocarcinoma cellelinjer HT-29 og SW620 oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære i DMEM inneholdende 25 mM glukose (Invitrogen , Cergy Pontoise, Frankrike) og supplert med 10% FCS, 5% penicillin og streptomycin. Det humane CRF2-GFP konstruksjonen ble klonet inn i pBabe ekspresjonsvektor. Retrovirale infeksjoner av HT-29-celler ble utført som beskrevet tidligere [17], og deretter dyrket i medium inneholdende 2 ug /ml puromycin (BD Biosciences), etter å FACS utvalg av virus-infiserte celler.
Antibodies og reagens
Polyklonale antistoffer rettet mot CRF2 var fra Abcam (12964, Paris, Frankrike). Det immuniserende peptid anvendt for å danne den CRF2 antistoffet ble utviklet i den konserverte sekvensen av de a, p og y-isoformer. Dette antistoff vil da gjenkjenne alle isoformer av reseptoren. Anti-human E-cadherin (HECD1) monoklonalt antistoff ble hentet fra Takara Biochemicals (Cambrex Bio Science, Paris, Frankrike). Monoklonalt antistoff mot p120ctn (klon 98) ble kjøpt fra BD Transduksjon Laboratories (Pont de Claix, Frankrike). Anti-aktin, anti-MMP3 polyklonale antistoffer og anti-Kaiso, ble anti-vinculin monoklonale antistoffer erholdt fra Sigma Aldrich (L’Isle d’Abeau, Frankrike). Polyklonale antistoffer rettet mot Src-P
Tyr418 ble kjøpt fra MBL Calbiochem (Fontenay-sous-Bois, Frankrike), monoklonalt anti-Src og anti-MMP7 antistoffer var fra Millipore (Molsheim, Frankrike). Monoklonale antistoffer mot ERK og ERK-P
Tyr204 var fra BD transduksjon laboratorier og Santa Cruz fra Tebu (Le Perray en Yvelines, Frankrike) hhv. Polyklonale anti-FAK-P
Ser910 antobodies ble oppnådd fra Invitrogen (Cergy Pontoise, Frankrike). Alexa-konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff ble oppnådd fra Molecular Probes (Eugene, OR). Pepperrot-peroxydase-konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff ble oppnådd fra Bio-Rad (Marnes-la-Coquette, Frankrike), ble esel anti-kanin-antistoffer oppnådd fra Jackson Immunoresearch (Immunotech, Marseille, Frankrike). Topro3 ble kjøpt fra Invitrogen. Urocortins, ble CRF og Astressin 2b kjøpt fra Sigma Aldrich.
Pasient årsklasse, Tissue Micro Arrays og immunhistokjemi
Denne studien ble utført på cDNA av en kohort av 30 CRC pasienter. Prøver fra frossen svulsten og peritumoral vev ble hentet fra svulstvev Bank of Hospices Civils de Lyon, støttet av National Institute of Cancer (Inca) og franske Departementet for Health. Vevet banken i samsvar med franske regler. Alle pasienter har gitt skriftlig samtykke til bruk av vevsprøver for forskningsformål; i fravær av informert samtykke, kan vevsprøver fra pasienter kjent for å være avdøde også brukes til forskningsformål i samsvar med franske regler. Prosedyrer for innsamling, lagring og frigjøring av vevsprøver er i samsvar med nasjonale og internasjonale anbefalinger og kvalitetsstyring programmet har blitt utviklet. Alle prosjekter som sendes inn til vevet bank gjennomgås og godkjennes av sin vitenskapelige komité, som også bekrefter deres samsvar med etiske regelverk. For å bevare anonymiteten ble det bestemt ID tilskrives hver pasient. For hver prøve, ble cDNA fra tumorvevet koblet sammen med cDNA av tilstøtende normalt vev. Tumorstadier ble definert i henhold til TNM status av svulstene (American Joint Committee on Cancer Staging system). Tissue Micro Arrays (TMA) CDA3 ble kjøpt til SUPER BIO CHIPS (Korea). Sleiden ble blokkert i TBS /BSA 3% /Tween-20 0,1% og inkubert over natten ved 4 ° C med anti-CRF2 ved 1:100. Den videre IHC ble utført med Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, Courtaboeuf, Frankrike), kontra med 1 min inkubasjon i Hematoxylin, dehydrert og montert med DPX. Hver mikroskop oppkjøp var nede i «TRIBUN» og kvantifisert med bilde J. IHC quantifications ble utført i ImageJ WCIF med CIE Lab funksjon av farge basert thresholding segmentering å skille CRF2 flekker fra Hematoxylin mot flekker. Seks forskjellige felt av hver prøve ble segmentert og den midlere grå verdi ble beregnet for den CRF2 og Hematoxylin. Den CRF2 intensitet for hver prøve er gjennomsnittet for CRF2 /Hematoxylin forholdet beregnet på de seks ulike felt.
Cell fraksjone
For atomfraksjonering, celle ble lysert i HEPES 10 mm /MgCl2 1,5 mM /KCl 10 mM /0,5 mM DTT /NP40 0,05% /pH 7,9. Etter en 10 minutters sentrifugering ved 3000 rpm og 4 ° C, pelletene ble resuspendert i HEPES 5 mM /MgCl2 1,5 mM /EDTA 0,2 mM /DTT 0,5 mM /glycerol 26% (v /v) /pH 7,9, og homogenisert med 20 fullstendig slag i Dounce. Etter 30 min inkubering på is, ble lysater sentrifugert 20 minutter ved 24000 g og 4 ° C. Supernatanter som inneholder atom ekstrakter ble analysert ved immunblot.
Immun og Immunpresipitasjon
Totalt lysatene eller subcellulære fraksjoner ble behandlet for immunoblot som beskrevet tidligere [18].
Immunofluorescent farging
Celler ble dyrket på dekkglass og deretter behandlet som beskrevet tidligere [18]. Etter fiksering med 4% PFA sukrose, ble ikke-spesifikke seter blokkert i 1 time ved 37 ° C med 3% BSA 0,5% Tween 20. Da celler ble inkubert i 1 time ved 37 ° C med spesifikke antistoffer som ble fortynnet i blokkeringsløsning ved 1:100 for primær og 1:500 for sekundære antistoffer. Fluorescens photomicrographs ble tatt med en konfokalmikroskop på × 100 objektiv (Leica TCS SPE) eller en epifluorescence mikroskop ved × 100 mål (Zeiss, AvioVert 200M).
RT og qPCR
Total RNA ekstraksjoner ble utført ved hjelp av Trizol
TM reagent og en mikrogram total RNA ble denaturized og deretter bearbeides for revers transkripsjon ved å bruke M-MLV (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. QRT-PCR ble utført med en lys cycler 480 og den universelle probe biblioteket (Roche). Primer sekvenser og prober er oppsummert i tabell 1.
ECM forberedelse og celle adhesjon
Tissue kultur retter ble belagt med LM-332 ved hjelp av følgende metoder: A431 epidermoide celler ble dyrket til konfluens på forskjellige overflater ved 37 ° C for å tillate deponering av LM-332, deretter celler ble fjernet som tidligere beskrevet [19], [20]. I korthet konfluente monolag ble sekvensvis ekstrahert med 1% (v /v) Triton X-100 i PBS, etterfulgt av 2 M urea i 1 M NaCl. Platene ble vasket i PBS, inkubert med 1% BSA og lagret ved -20 ° C. Humant kollagen type IV fra placenta ble erholdt fra Sigma Aldrich. Belegg av plast petriskåler (Mikrotiterplater med 96 brønner, Nunclone; Nunc, Roskilde, Danmark) ble utført ved inkubering over natten med ECM-proteiner (10 ug /ml) ved 4 ° C. Plater ble mettet med 3% (w /v) BSA i PBS i 2 timer ved 37 ° C. HT-29 CRF2-GFP-celler ble forbehandlet eller ikke med 100 nM Ucn3 i 30 minutter før som skal bli belagt (5 x 10
4 celler /brønn) i triplikat i belagte 96-brønners mikrotiterplater og inkubert mellom 0 og 60 min ved 37 ° C. Ikke-adherente celler ble fjernet ved vasking tre ganger med PBS, og celleadhesjon ble estimert ved en celle proliferasjonsanalyse (CellTiter 96 AQ
ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Promega)
Cell transmigrasjon og invasjon.
HT-29 CRF2-GFP celler ble sådd på 24 brønners transwells (8 mikrometer porestørrelse) (Becton Dickinson). Etter cellesammenløpet, kulturmediet ble serum høstet over natten i opp og ned kamre. Transmigrasjon ble deretter initiert ved etablering av en serum-gradient med 10% FCS i det nedre kammer, med eller uten 100 nM Ucn3 i hvert kammer. 72 timer etter initiering av transmigrasjon, ble bomullspinner brukes til å fjerne celler på den øvre overflaten av transwells. Etter fiksering med 4% PFA ble trekkende celler farget med Hematoxylin og manuelt tellet under mikroskop. Gjennomsnittsverdiene +/- SEM ble beregnet og analysert ved hjelp av Student test.
HT-29 CRF2-GFP celler (2,5 10
-5 /ml) ble plassert i den øverste rommet av en 24-multiwell sette innsatsplate (BD Falcon) som ble separert fra det nedre rom av BD-Matrigel Matrix membran, med 0,4 um porestørrelse. Serumfritt RPMI med eller uten Ucn3 (1 uM) ble tilsatt til det øverste rommet og 10% FCS inn i det nedre rom. Etter 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære, celler som hadde invadert gjennom Matrigel, ble analysert som beskrevet før for å trans analysen.
Cellelevedyktigheten ble evaluert med CellTiter 96 Kit (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner.
Gelatin degradering analysen
Om 40 ul (20-30 mikrogram celle protein) høstet dyrkingsmedium ble elektroforese etter ikke-reduserende forhold i en 10% akrylamid gel som inneholder 1 mg /mL gelatin (Sigma-Aldrich), i henhold til metoden beskrevet av Werb og al., [21]. Etter elektroforese, ble gelene vasket ved romtemperatur i 3 x 30 minutter i 2% Triton X-100 og over natten ved 37 ° C i buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,7) og 5 mM CaCl
2.Thereafter , geler ble farget med 0,1% (vekt /volum) Coomassie Brillant Blue R-250 i 50% (vol /vol) isopropylalkohol /10% (vol /vol) iseddik i 60 min og avfarget i 20% (vol /vol) isopropylalkohol /5% (vol /vol) iseddik.
Densitometrisk analyse og statistikk
immunoblotter vist er representative for minst tre uavhengige forsøk. Alle grafene representerer middelverdien ± SD av protein uttrykk nivåer målt ved densitometrisk analyse i «Image J» programvare (NIH). De relative ekspresjonsnivåer av mRNA eller proteiner ble bestemt som følger: uttrykk for nivået av hvert transkript eller protein ble normalisert til i) sin husholdningsgenet i qPCR eller RT-PCR; ii) til aktin i hele lysat westernblots eller histoner i atom ekstrakt westernblots. I noen forsøk og for å vise et gangers økning i forhold til kontrollen, ble den relative ekspresjon av transkripter eller proteiner i kontrollforhold satt til 1. Statistisk er uparet t-test, og statistisk signifikans er gitt ved antallet av stjerner (* P 0,05 ; ** P 0,01; *** P. 0,001)
Resultater
uttrykk for CRF2 og dets ligander øke med oppsetningen i CRC vev og cellelinjer
har urfremført qPCR for CRF2α (den store CRF2 isoform av colonic epitel), [22] og Ucn2 /3 i normale og CRC vev av 30 pasienter, for å bedre forstå sin regulering i løpet av tumorprogresjon (figur 1A). De clinicopathological Resultatene av tumorene ble benyttet i studien er vist i tabell 2. Tumorene ble gruppert i lav (n = 19, svarende til trinn 1-2) og høy (n = 11, svarende til trinn 3-4) karakterer og standardisert til sin normale vev. Statistisk analyse viste en signifikant økning av CRF2α og Ucn3 mRNA-ekspresjon i tumorer sammenliknet med normalt vev i henhold til tumoren karakter. Det var ingen signifikante forskjeller i Ucn2 transkripsjoner i disse forholdene. Imidlertid, når analysen ble utført i svulster vev bare ble et mønster åpenbart om Ucn2 mRNA-ekspresjon: Ucn2 transkripsjonsnivåer ble øket i henhold til pnm status, lymfeknute invasjon og mikro ustabilitet (MSI). Endelig fikk CRF2α, Ucn2 og Ucn3 transkripsjonsnivåer ikke relatere til mutasjoner av
K-ras eller B-raf
. Et lignende resultat ble funnet med CRC-cellelinjer (supplerende Figur S1). Immunhistokjemisk analyse ble brukt for å påvise CRF2 reseptor-protein-ekspresjon i kolorektale seksjoner som svarer til normale vev (n = 9), lav grad (n = 24), og høy grad av (n = 18) tumorer (figur 1B). Andelen av prøver som er større enn gjennomsnittet av normalt vev økt fra 22% i normal til 33% og 72% i lav og høy grad av svulster henholdsvis (figur 1C, venstre panel). Dessuten økte CRF2 proteinet uttrykket i henhold til tumoren klasse (ANOVA p = 0,047) (høyre panel). Disse resultatene tyder på en sammenheng mellom CRF2 protein uttrykk og høyere kreft karakterer. Vi har utvidet vår analyse av qPCR i 17 menneske CRC cellelinjer (supplerende figur S1). Interessant, fant vi at uttrykket av CRF2 ligander er omvendt korrelert til epitelial differensiering markører som E-cadherin (
Cdh1
), men korrelert til mesenchymale stakere som vimentin (
Vim
), noe som tyder på en rolle av CRF2 i mobil uorden observert under tumorprogresjon. To CRC-cellelinjer ble valgt: i) HT-29-celler, som uttrykker høyt nivå av E-cadherin, men lavt nivå av Ucn2 og ingen vimentin; ii) SW620-celler, dårlig differensierte mesenchymale celler som uttrykker høye nivåer av Ucn2 og vimentin sammenlignet med en svak grad av E-cadherin (figur 2A). Ekspresjonen av CRF2 og E-cadherin på proteinnivået ble bekreftet ved immunblotting (figur 2B). Ved hjelp av HT-29 celler som stabilt overuttrykker den CRF2 koblet til GFP protein (HT -29 CRF2-GFP celler) vi observert at CRF2-GFP ble hovedsakelig er lokalisert på membranen, i inter kontakter (figur 2C). Denne observasjonen ble også støttet av mikros konfokal analyse som viser en samlokalisering av CRF2-GFP protein med E-cadherin i HT-29 celler (figur 2D). Med Ucn3 (den mest effektive CRF2 agonist i HT-29 celler, se supplerende figur S2), ble celler kontakter endret og CRF2-GFP forskjøvet i cytoplasmatiske vesikler (figur 2C).
(A) Histograms representerer CRF2α, Ucn2 og Ucn3 transkripsjon uttrykk normalisert til husholdningsgenet PGK (fosfoglyceratkinase) i humane normale vev eller CRC (lav og høye karakterer). (B) Representant CRF2 immunhistokjemi utført på CRC vev fra lav til høy klasse. Scale bar, 50 mikrometer. (C) Histograms representerer CRF2 protein uttrykk kvantifiseres fra immunhistokjemi. Hver prøve er representert som mørke barer +/- SD (til venstre) og den midlere verdi for hver gruppe +/- SD (til høyre). Høy klasse er statistisk forskjellig fra vanlig på *, p. 0,05
(A) Karakterisering av HT-29 og SW620 cellelinjer av mRNA uttrykk for Ucn2, vimentin (Vim) og E-cadherin ( Cdh1) normalisert til husholdningsgenet HPRT (human phosphoribosyltransferase). (B) E-cadherin /aktin og CRF2 /aktin proteinekspresjon kvantifiseres ved immunblot i SW620 og HT-29 cellelinjer. (C) Konfokalmikroskopi analyse av CRF2-GFP fordeling i Ucn3-behandlede HT-29-celler. Scale bar, 15 mikrometer. (D) Konfokalmikroskopi analyse av CRF2-GFP og E-cadherin fordeling i HT-29 celler. Målestokk, 20 um.
Til sammen indikerer disse data at CRF2 og dets ligander er uttrykt i humane CRC og cellelinjer i henhold til tumoren karakter og /eller differensiering status. CRC celler kan aktivere sin CRF2 via en autokrint produksjon av ligander, spesielt i udifferensierte cellelinjer.
Regulering av celle-celle kontakter ved CRF2 signale
CRF2 signa har nylig blitt utvidet til ikke kanoniske G protein koblet reseptor reaksjonsveier, inkludert Src kinase som direkte kommuniserer med den går gjennom endocytose CRF-reseptorer og deltar i aktivering av ERK [23], [24]. Src-P
Tyr418-ekspresjon ble gradvis øket fra 5 til 30 minutter, mens det totale Src forble uforandret (figur 3A). Den fosforylert form av Src har vært co-immunopresipitert med CRF2 under den tidlige fasen av den kinetiske (supplerende Figur S3). I CRC, korrelerer Src kinase aktivering til E-cadherin forstyrrelse, histologisk gradering og dårlig prognose [25]. Vi undersøkte derfor involvering av Src aktivitet i Ucn3-mediert celle dissosiasjon. I HT-29 celler, konfokalmikroskopi analyse viste at E-cadherin flekker produsert en honeycomb lignende mønster på lateral membran cortex (figur 3B). Aktivering av CRF2 av Ucn3 raskt endret dette mønsteret. Bare en fortykket og forstyrret lineære membranfarging vedvarte mens mange cytoplasmatiske ansamlinger dukket opp, noe som indikerer en endocytose av E-cadherin knyttet til AJ avbrudd. Cycloheximide ble brukt for å hindre opphopning av neosynthesized E-cadherin. Intern analyser ved hjelp HECD-1-antistoffer ble gjort for å bekrefte Ucn3-indusert E-cadherin endocytose (figur supplerende S4). Celledissosiasjon og endocytose av E-cadherin, ved Ucn3 eksponering ble hindret av forbehandling med Src-familie-inhibitoren PP2, som indikerer at Src-aktivering var nødvendig for den Ucn3-mediert celle-celle-kontakter avbrudd (figur 3C). I SW620-celler som uttrykker lavt nivå av E-cadherin og utfører noen AJ, blokade av CRF2 signalering av dens spesifikke agonist astressin2b (A2b) i 24 timer var ansvarlig for en økt ekspresjon av E-cadherin (figur 3D). Immunofluorescens-analyse av E-cadherin fordeling i SW620-celler viste svake membran ekspresjon og celle-celle-kontakter med eller uten Ucn3 (figur 3E). I nærvær av A2b, SW620 celler dannet klaser og E-cadherin ble lokalisert ved celle-celle-kontakter. Ucn3 litt snudd A2b-indusert celle clustering. Modulering av selvklebende proprieties av SW620 celler ble også dokumentert i aggregering analyser viser at både tilhenger og ikke-heftende celler var i stand til å aggregere i nærvær av A2b (supplerende figur S5).
(A) immunoblotanalyse av Src- P
Tyr418 og Src total ekspresjon i HT-29 celler etter tidsforløpet av Ucn3 behandling. (B) Confocal analyse av E-cadherin fordeling i HT-29-celler forbehandlet med cykloheksimid før Ucn3 behandling. Scale bar, 15 mikrometer. (C) Effekt av PP2 (10 mikrometer, en time) på E-cadherin distribusjon i HT-29 celler behandlet eller ikke med Ucn3, analysert ved epifluorescence mikroskopi. Scale bar, 20 mikrometer. (D) Virkning av CRF2 antagonist (A2b, 8 nM, 24 timer) på E-cadherin ekspresjon i SW620 celler. Kvantifisering ble utført fra immunoblotter og normalisert til aktin. (E) E-cadherin fordeling i SW620-celler forbehandlet eller ikke med A2b og ytterligere behandlet eller ikke med Ucn3. Analysert ble utført med epifluorescens mikroskopi. Scale bar, 10 mm.
E-cadherin er assosiert med catenins på AJ komplekser. Forstyrrelse av celle-celle kontakter fører til AJ proteiner dissosiasjon og cytoplasma og /eller kjernefysiske lokalisering av catenins, som fremmer celle invasjon i CRC [26]. I HT-29 celler behandlet med Ucn3, ble p120ctn akkumuleres i cytoplasma og kjernen (figur 4A). I kjernen, har p120ctn blitt beskrevet for å regulere aktiviteten av transkripsjonsfaktoren Kaiso. Ucn3 betydelig økt p120ctn og Kaiso atom uttrykk som observert av immunoblotting etter atomfraksjonering (figur 4B). For å identifisere signalmolekyler som er involvert i dette kjernefysisk skyt, testet vi effekten av Src (PP2) og MEK (U0126) hemmere. Som vist på figur 4C, har vi funnet at disse inhibitorene reversert Ucn3-indusert kjernefysiske akkumulering av disse proteinene. De induserte også en økning av basalatom uttrykk for p120ctn og Kaiso, sannsynligvis på grunn av deres toksisk effekt. Atom utdeling av Kaiso ble videre analysert ved konfokal mikroskopi (figur 4D). Prosentandelen av positive kjerner for Kaiso økte omtrent 40% i HT-29 celler behandlet med Ucn3. Interessant, i kontrollceller, celler som tilsvarer kjerner positive for Kaiso ble observert ved periferien av klyngen, som svarer til celler med mindre intercellulære kontakter. Under Ucn3, cellene i sentrum av klyngen ble positiv for kjerner merking av kaiso.
(A) Confocal analyse av p120ctn plassering i HT-29-celler forbehandlet med cykloheksimid før Ucn3 behandling. Scale bar, 10 mikrometer. (B) immunoblotanalyse av p120ctn og Kaiso protein uttrykk i atom ekstrakter fra HT-29 celler behandlet eller ikke med Ucn3 (uttrykk var normalisert til histoner). (C) Effekter av Src og MEK-hemmere (PP2 og U0126: 10 mm, 1 time) på p120ctn og Kaiso protein uttrykk i atom ekstrakter fra HT-29 behandlet eller ikke med Ucn3. Expression ble normalisert til histoner. (D) Confocal analyse av cellulær fordeling av Kaiso i HT-29-celler. Kjerner ble farget med Topro3. Celler negative for kjerner merking av Kaiso ble omsluttet av en hvit stiplet linje. Scale bar, 60 mikrometer.
Til sammen våre data indikerer at CRF2 signaler gjennom en Src vei å indusere AJ avbrudd av E-cadherin endocytose. Dette etterfølges av p120ctn og Kaiso kjernefysisk translokasjon. Gjennom denne ruten, kan CRF2 delta i celle dedifferentiation og migrasjon.
CRF2 signale reorganiserer celle-matrise kontaktene i favør av celle migrasjon og invasjon
Kreft celle migrasjon er nødvendig for metastaser og resultater fra omorganisering av celle-celle og celle-matriks-kontakter. Ucn3-indusert celledissosiasjon var også assosiert med cellen form ombygging som observert av aktin cytoskjelettet farging med phalloidin-TRITC på basal pol av HT-29 celler (figur 5A). I ubehandlede celler, ble actin utleveres i cellen periferien og arrangert som stress fibre spredt over cellene. Med Ucn3, aktin farging var mindre intens på celle periferien hvor kontaktene er dissosiert. Det var også færre stresset fiber, som dukket kortere og mer fragmentert. Ombygging av celleform er drevet av intra-cellulære kinaser signalering. I denne linje, ERK-reaksjonsveien er også ofte blitt aktivert som svar på CRF2 aktivering. I HT-29 CRF2-GFP celler, viste vi at ERK ble fosforylert på Tyr
204 i et kort tidsperspektiv etter Ucn3 eksponering (figur 5B). Forholdet av fosforylert /total ERK ble økt med en 2,5 ganger mellom 5 og 15 minutter og vendte tilbake til dets basale nivå ved 30 og 60 min. PP2, omgjorde ERK-aktivering indusert av Ucn3 uten å endre basalnivået (lav panel). MEK-inhibitor, U0126, indusert tap av de fosforylerte formene for ERK henhold til basale betingelser og etter Ucn3 behandling. Celle adhesjon ombygging og migrasjon innebærer det sentrale vedheft (FA) kinase (FAK). Dette kinase kan fosforyleres på Ser
910 av ERK Ser /Thr kinase. Vi har derfor bestemme graden av FAK-fosforylering i HT-29 CRF2-GFP-celler utsatt for Ucn3 (figur 5C). FAK P
Ser910 ble forbigående økt med et maksimum ved 30 min. Dette fosforylering ble litt hemmet av PP2 og U0126 henhold basale forhold og avskaffet etter Ucn3 behandling. Disse dataene antyder at Ucn3 aktiverer en Src /ERK /FAKfosforylering kaskade gjennom CRF2 reseptoren.
(A) Phaloidin-TRITC fluorescens er analysert ved konfokalmikroskopi på basal pol av HT-29 CRF2-GFP celler etter Ucn3 behandling. Scale bar, fem mikrometer. (B) ERK-P
Tyr204 /ERK total forholdet kvantifisert fra immunoblot i HT-29 celler behandlet med Ucn3 (0-60 min) (Øvre panel). Effekter av Src (PP2: 10 mm, 1 time) eller MEK (U0126: 10 mm, 1 time) hemmere på Ucn3 indusert ERK-P
Tyr204 (Nedre panel). (C) Ucn3-mediert fosforylering av FAK- P
Ser910 i HT-29. Kvantifiseringen ble utført fra immunoblotter og normalisert til aktin (øvre panel). Effekter av Src (PP2, 10 um, en time) og ERK (U0126, 10 mm, 1 time) hemmere på Ucn3 indusert FAK-P
Ser910 (Nedre panel). (D) Confocal analyse av vinculin fordeling på basal pol av HT-29 følgende Ucn3 behandling. Scale bar, 20 mikrometer. (E) Kvantifisering av plasteret antall etter størrelse på 30 min av Ucn3 behandling.
Focal klebe strukturer, som er regulert av FAK, delta i celle-ECM interaksjoner. Disse interaksjonene er mediert av ulike trans reseptorer som inte, knyttet til cytoskjelett komponenter og stillas molekyler som vinculin [27]. Vi analyserte effekten av Ucn3 på FA gjennom distribusjon av vinculin (figur 5D). Uten Ucn3 ble vinculin uttrykt i sterke patcher distribueres hovedsakelig på celle periferien. Med Ucn3, mindre tegnsetting klør vist i vinculin flekker som var homogent fordelt over hele cellen, og likevel ikke begrenset ved omkretsen, spesielt ved 30 min. Kvantifisering av disse lappene ved størrelse avdekket at små flekker økt mens store forbli uendret (figur 5E). Denne etiketten antyder dannelsen av begynnende fokale kontakter, som tidligere har blitt beskrevet til å delta i celle adhesjon og migrering [28]. Vi har utført celleadhesjonsprosesser eksperimenter for å teste om Ucn3 utløst vinculin omorganisering kan endre cellebinding til kollagen IV (CoIV) og laminin 332 (LM-332) (to store ECM proteiner av tykktarms basal lamina) (Figur 6A). Ucn3 reduserer HT-29 celle adhesjon på disse to matrisekomponenter ved 20 og 60 min fra platekledning. For å finne ut om denne effekten var assosiert til migrasjon og /eller invasjon vi testet effekten av Ucn3 på HT-29 cellemotilitet av transwell migrasjon og Matrigel invasjonen analysene (figur 6B og C). Ucn3 behandling betydelig øket nivå av cellemigrering og invasjon sammenlignet med kontrollceller. Denne effekten ble ikke støttet ved modifikasjon av celle-levedyktighet (figur 6D), men kan reguleres ved sekresjon av matriks-metallproteaser (MMP). Vi undersøkte derfor uttrykket og aktiviteten til MMP. Som vist i figur 6E, ble mRNA-nivåer for MMP3 og MMP7 funnet å være forbigående økes med Ucn3. Vi har ikke observert signifikant modulering av MMP2 og MMP9 transkripsjoner (data ikke vist).
