Abstract
Vår tidligere studie har vist at mesothelin (MSLN) er en potensiell immunterapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen. Her har vi undersøkt ytterligere immunogenisiteten av kimære murine MSLN-viruslignende partikler (mMSLN-VLP), deres evne til å bryte toleranse til mMSLN, et selv-antigen, og tydet mekanismen for immunresponser fremkalt av mMSLN-VLP immunisering ved anvendelse av en pankreaskreft (PC) musemodell. I tillegg til det vi har funnet med xenogene human MSLN-VLP (hMSLN-VLP), mMSLN-VLP immunisering var i stand til å bryte toleranse for iboende MSLN og montere mMSLN spesifikke, cytotoksiske CD8
+ T-celler som førte til en betydelig reduksjon i tumorvolum, og forlenget overlevelse i en ortotopisk PC-mus-modellen. Videre CD4
+ foxp3
+ regulatoriske T-celler (tregs) var gradvis redusert i både milt og tumorvev følgende mMSLN-VLP immunisering, og dette var i det minste delvis på grunn av forhøyede nivåer av IL-6 produksjon fra aktivert plasmocytoid dendrittiske cellen (PDC) -lignende celler etter mMSLN-VLP immunisering. Videre mMSLN-VLP behandling hovedsakelig redusert hyppigheten av CD4
+ foxp3
+ ICOS
– treg delsettet. Men mMSLN-VLP indusert IL-6 produksjon økte også ICOSL uttrykk på PDC-lignende celler som støttes spredning av immunsuppressive CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg celler. Denne studien viser at mMSLN-VLP immunisering er i stand til å styre PC progresjon ved effektivt å montere en immunrespons mot mMSLN, en tumor selv-antigen, og å endre den immunsuppressive svulsten mikromiljøet via aktivering av PDCs-lignende celler og reduksjon i hyppigheten av CD4
+ foxp3
+ ICOS
– treg celler. Imidlertid vil kombinasjonsterapier sannsynlig må brukes for å målrette rest CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg celler
Citation. Zhang S, Yong LK, Li D, Cubas R, Chen C, Yao Q (2013) Mesothelin viruslignende partikkel Immunisering Controls Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Vekst gjennom CD8
+ T Cell Induksjon og reduksjon i frekvens av CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Regulatory T-celler. PLoS ONE 8 (7): e68303. doi: 10,1371 /journal.pone.0068303
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 11 juli 2012; Godkjent: 04.06.2013; Publisert: 09.07.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Dan L Duncan Cancer Center pilot stipend fra BCM og National Institutes of Health stipend CA140828 for Q. Yao og AI053831 for S. Zhang. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt en ødeleggende, svært dødelig sykdom. selv med dagens vitenskapelige fremskritt. Denne sykdommen representerer en enorm utfordring for klinikere og forskere fordi det er naturlig motstandsdyktig mot ulike former for behandlinger [1]. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye behandlingsformer for kreft i bukspyttkjertelen. Blant de nyeste terapeutiske tilnærminger, har kreftvaksiner vist noen lovende resultater for sykdomskontroll [2]. Mange har blitt rapportert å være lovende i indusere
in vivo
tumor regresjon [XPATH FEIL:. Ukjente variabelen «Start2»], [4]. Imidlertid er mekanismen for hvordan tumorvaksiner kan vellykket kontroll tumorprogresjon fortsatt uklart.
tumor-spesifikke cytotoksiske T-lymfocytt (CTL) induksjon har vist seg å være avgjørende for utrydding av kreftceller ved effektive anti-tumor vaksiner 5,6 ettersom CTL kan være spesifikke for en bestemt antigen uttrykt ved tumorceller. I tillegg har den rolle av regulatoriske T-celler (Tregs) i antitumorimmunitet er kraftig undersøkt og belyst [7]. Treg-celler er identifisert som CD4
+ CD25
+ foxp3
+ representerer den viktigste inhibitoriske lymfocyttpopulasjon [8], [9]. Fjerning av treg-celler ved
in vivo
administrering av et anti-CD25-antistoff som har vist seg å oppheve immun-suppresjon, begrense tumorvekst, og fremme tumor avvisning hos mus [10]. Den co-stimulerende molekyl ICOS er en av de regulatoriske proteiner uttrykt på CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs [11]. Utvidelsen av Tregs kan knyttes til ICOS signalering, som også deltar i utviklingen av antigen-spesifikke Tregs [12]. En fersk rapport viser at foxp3
+ Tregs har to distinkte undergrupper med ulike biologiske funksjoner basert på ICOS uttrykk. En av disse undergrupper, CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs, utskiller IL-10 og TGF-β som undertrykker dendrittiske celler (DCS) og CD4
+ T-hjelpeceller. Den andre undergruppe, CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Tregs, bare produsere TGF-β [13]. En studie har også vist at murine Tregs inneholde hyperproliferative og dødsutsatte undergrupper med differensial ICOS uttrykk [14]. Imidlertid har responsen av disse to Treg undergrupper til tumorImmun vaksinasjon ikke undersøkt.
induksjon og generering av foxp3
+ tregs er assosiert med DC-funksjon [15]. Selv om både konvensjonelle DC (CDCS, myeloid DC) og plasmacytoid DC (PDCs) kan samhandle med foxp3
+ Treg celler, bare PDCs er rapportert å ha en evne til å prime CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs [13]. PDCs er kjent som en primær like undergruppe i antivirale immunresponser [16]. Ved aktivering og modning, de skiller ut store nivåer av type I interferoner som aktiverer andre medfødte immunceller som CDC og NK-celler og bro adaptive immunceller som T-celler og B-celler [17]. PDCs ikke bare har kapasitet av presentasjon av MHC-II-epitoper for å aktivere CD4
+ T-celler, men kan også tverrliggende MHC-I epitoper for å utvide CD8
+ T-celler [18]. Induksjon av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs av PDCs, men ikke CDC, er koblet til ICOS ligand uttrykk på PDCs [13].
Effektiviteten av kreft immunterapeutiske tilnærminger er veldig avhengig immunogenisitet av målrettede tumorassosiert antigen. Mesothelin (MSLN), er et membranglykoprotein som normalt uttrykkes på mesothelial celler, men er overuttrykt i de fleste bukspyttkjertel kreft [19] – [21]. Den begrensede grad av MSLN ekspresjon i normale celler er det en passende terapeutisk mål for kreft vaksiner [22]. Blant de forskjellige vaksine tilnærminger som bærer og presentere tumorantigener til verten, kan viruslignende partikler (VLP) være mest egnet for å indusere både humorale og cellulære immunresponser. Som en analog av virus, kan kimære VLP betraktes inkompetente virus, som har den komplette virus struktur og virale proteinkomponenter for å stimulere sterk cellulære responser uten virale nukleinsyrer. VLP-er kan indusere forebyggende eller terapeutisk immunitet ikke bare mot tumor-relatert virus infeksjon som kan føre til tumorgenese [23], [24], men de kan også hemme tumorvekst ved spesifikt målrettet mot tumorassosierte antigener [25]. Vi har tidligere vist at chimeriske hMSLN-VLP effektivt kan redusere tumorvekst ved en reduksjon i frekvensen av CD4
+ foxp3
+ Tregs i en ortotopisk bukspyttkjertelkreft musemodell [21]. I denne studien har vi videre vurdert om selv antigen mMSLN inkorporert på VLP kan bryte toleranse for mMSLN, montere adaptive immunresponser og kontrollere tumorprogresjon. For ytterligere å forstå virkningsmekanismen der VLP immunisering kan oppnå tumor regresjon, vi også utforsket egenskapene til DC induksjon av mMSLN-VLP og cytokiner involvert i undertrykkelse av CD4
+ foxp3
+ Treg celler.
Resultater
mMSLN-VLP immunisering hemmer kreft i bukspyttkjertelen vekst og fremmer overlevelse i tumor-bærende mus
i vår forrige rapport, viste vi at immunisering med human MSLN-VLP kan effektivt kontrollere svulst vekst i en musemodell som førte til forbedring av cytotoksiske immunresponser mot kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom en reduksjon i hyppigheten av treg-celler [21]. Ettersom human og mus MSLN har bare omtrent 60% homologi, kan sterk immunrespons resulterer fra et xenogent respons på human MSLN. Men om immunisering med mMSLN-VLP kan bryte toleranse og indusere immunresponser mot mMSLN, et selv-antigen, i forbindelse med en VLP presentasjon, og hvorvidt mMSLN-VLP har en lignende effekt i å utløse en anti-tumorrespons ved å modulere Tregs har ikke blitt utforsket. For å evaluere effekt av immunterapeutisk mMSLN-VLP immunisering ble dyrene immunisert med enten mMSLN-VLP eller SIV VLP som en kontroll for VLP «ryggraden», eller PBS i tumorbærende mus. Som vist på fig. 1A, mMSLN-VLP immunisering betydelig redusert tumorvolum (0,92 ± 0,39) sammenlignet med de to kontrollgrupper (2,49 ± 0,43 i SIV-VLP og 3,18 ± 0,38 i PBS kontrollgruppen) (
p
0,05) . Det var ingen statistisk forskjell i tumorbyrde mellom PBS og SIV-VLP immuniseringsgrupper. Videre fant vi at alle mus behandlet med PBS eller SIV-VLP hadde 1 ml til 4 ml ascites eller blodig ascites i bukhulen. Det var mindre væske ( 1 ml) i mMSLN-VLP vaksinerte gruppe. I tillegg, som vist i fig. 1B, med SIV-VLP immunisering, var det en noe forlenget overlevelse ennå ikke er statistisk signifikant sammenlignet med PBS-kontrollgruppen (
p
= 0,1947). Tvert imot, mMSLN-VLP immunisering signifikant forlenget overlevelse av tumorbærende mus sammenlignet med PBS og SIV-VLP grupper (
p
= 0,0012 og
p
= 0,0198, henholdsvis) . Videre, mer enn 50% av mMSLN-VLP immuniserte musene var fremdeles i live på dag 30.
Panc02-celler (7 x 10
5) ble orthotopically implantert i bukspyttkjertelen fra 8 uker gamle C57BL /6 mus ved dag 0. Tre vaksinasjoner på dag 3, 13 og 21 ble brukt av ip rute med forskjellige VLP. Musene ble delt i tre grupper som var immunisert med enten 100 ul PBS eller 100 ug /100 ul av SIV-VLP eller 100 ug /100 ul av MSLN-VLP. EN). Redusert tumorbyrde i mMSLN-VLP vaksinert grupper. Tumorstørrelse mellom hver gruppe ble statistisk sammenlignet ved student t-test. *
p
0,05. B). Forlenget overlevelse av mMSLN-VLP immunisert mus grupper Kaplan-Meier overlevelsesanalyse.
P
verdiene ble beregnet og notert på figuren. Disse var representative data valgt fra fire uavhengige forsøk med A) fem eller B) minst ni mus per gruppe.
mMSLN-VLP Immunisering Aktiverer CD8
+ T-celler og Genererer MSLN-spesifikke funksjonelle CD8
+ -T-celler
Vårt tidligere rapporter har vist at VLP har en høy kapasitet til å aktivere Th1-orienterte cellulære immunresponser og generere spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter i vaksinerte mus [26], [27]. Som vist på fig. 2A, var det en økning i hyppigheten av CD8
+ CD62L
– T-celler etter mMSLN-VLP behandling (46,5% vs. 19,6% i PBS), noe som tyder på at mMSLN-VLP kan stimulere generell CD8
+ T-celleaktivering.
på 17
th dagen etter tumor implantasjon og etter en tid VLP vaksinasjon på dag tre, mus ble ofret for immunrespons analyse. FACSCalibur ble brukt til å erverve og FlowJo programmet ble brukt til å analysere dataene. EN). Generelt CD8
+ T-celle-aktivering i PBS kontrollgruppen og de VLP immuniserte muse-grupper. Celler ble separert på CD8
+ T-celler, T-celleaktivering markør CD62L uttrykk ble vist i histogrammet. B). MSLN spesifikke tetramer
+ CD8
+ T celler induksjon. Splenocytter ble farget med PE-merket MSLN spesifikke tetramer. C). MSLN-spesifikke IFN-γ produserende CD8
+ T-celle-induksjon. Splenocytter ble re-stimulert med MSLN peptid i 6 timer i nærvær av Golgi blokkering forbindelsen
in vitro
. Etter fiksering og permeabiliseringen, de forbehandlede splenocytter ble farget med PE-merket anti IFN-γ antistoff. D). MSLN-spesifikke CTL-induksjon mot Panc02 celler. Splenocyttene ble re-stimulert
in vitro
i 6 dager i nærvær av IL-2. De forhåndsbehandlede splenocytter ble talt og anvendt som effecter celler. Panc 02 celler ble brukt som målceller. Effecter celler og målceller ble blandet med forskjellige E: T-forhold og inkubert i 4 timer. Prosentandelen av lysering ble beregnet som:% Cytotoksisitet = [(Experimental – effecter Spontan – Target Spontan) /(Target Maximum – Target Spontan)] × 100. Vist var representative data valgt fra to uavhengige forsøk med fem mus per gruppe. (Statistisk betydninger vises, * viser
p
0,05.)
For å vurdere generasjon mMSLN spesifikke CD8
+ T celler i murine splenocytes etter immunisering. , en MHC-i: MSLN peptid tetramer ble anvendt for å bestemme prosentandelen av mMSLN-spesifikke CD8
+ T-celler. Som vist på fig. 2B, prosentandel av tetramer + CD8
+ T-celler i mMSLN-VLP-immuniserte grupper var tilnærmet 3-folder høyere enn i PBS-kontrollgruppen (3,21% vs. 1,18%). SIV-VLP immunisering ikke særlig øke hyppigheten av mMSLN-spesifikke CD8
+ T-celler (1,35%). Derfor kan mMSLN-VLP immunisering induserer mMSLN-spesifikke CD8
+ T-celler
aktiverte effektor-CD8
+ T-cellene kan deles i to forskjellige grupper. Cytokin sekresjon CD8
+ T -celler og cytotoksiske T-lymfocytter [28]. Etter MSLN-spesifikt peptid stimulering, ble MSLN-spesifikke CD8
+ T-celler som utskiller IFN-γ detektert av intracellulær cytokin farging. Som vist på fig. 2C, andelen av MSLN-spesifikke IFN-γ utskillende effecter CD8
+ T-celler i mMSLN-VLP immuniserte gruppen var omtrent 2-folder høyere enn i PBS-gruppen (2,55% vs. 1,42%). Imidlertid var det ingen forbedring i frekvensen av disse celler etter SIV-VLP immunisering (1,77%). For å vurdere evnen av VLP-indusert CTL for direkte å drepe tumorceller, en
in vitro
tumor drepende analysen ble utført ved anvendelse av Panc02-celler som målceller som ble vist å overuttrykke MSLN [21]. Som vist på fig. 2D, den cytolytiske effektivitet av CTL til Panc02-celler ble også vist å være høyest i de mMSLN-VLP vaksinert grupper i et forhold på 120:1. Disse resultatene tyder på at den spesifikke effektor CD8
+ T-celler indusert av mMSLN-VLP immunisering kan spille en viktig rolle i direkte kontrollere tumor regresjon.
mMSLN-VLP Immunisering undertrykker Både systemisk og Tumor infiltrerer CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ Tregs
Selv om vi har vist at VLP immunisering kan redusere antall CD4
+ foxp3
+ tregs celler i murine milt og i tumor vev, fenotype og biologi av disse cellene fortsatt remainslargely ukjente [21]. Som vist på fig. 3, nesten alle av foxp3
+ celler i tumor-bærende mus var tilstede i CD3e
+ CD4
+ T-cellepopulasjon siden CD3e
+ CD8a
+ foxp3
+ og CD3e
+ CD4
-CD8a
-foxp3
+ undergrupper var under 0,5%. Prosentandelen av CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ Tregs følgende mMSLN-VLP immunisering (12,9 ± 1,83%) var lavere enn i PBS kontrollgruppen (17,81 ± 1,26%) (p 0,05). SIV-VLP immunisering førte også til en nedgang i bestanden av tregs, riktignok til en lavere grad (14,4 ± 2,19%) (p 0,05). Derfor er redusert foxp3
+ celler i tumor-bærende mus tilhørte den konvensjonelle CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ Treg cellegruppe, siden VLP ikke indusere eller påvirke CD4
– foxp3
+ treg celler i murine milt. Derfor kan VLP immunisering redusere den systemiske befolkningen i CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ Tregs i tumorbærende mus.
A). Ved 12
th dagen etter tumor implantasjon og etter en tid VLP vaksinasjon på dag tre, ble musene ofret for immunrespons analyse. Om 10
6 splenocytes ble inkubert med riktig utvannet fluorescerende-konjugerte antistoffer inkludert CD3e, CD4, CD8, og foxp3. Foxp3
+ celler ble analysert i tre T-celle undergrupper: CD4
+ CD8
-, CD4
-CD8
+ og CD4
-CD8
-. Disse var representative data fra tre uavhengige eksperimenter med minst tre mus pr gruppe. B). CD4
+ foxp3
+ T-celler isolert fra tumorbærende splenocytes trykt Tresp celler spredning. Co-dyrking CD4
+ CD25
+ Tregs og CD4
+ CD25
– Tresps (CFSE farget) ved forskjellige forhold 1:8, 1:4, og 1:2. CFSE merket Tresps proliferasjon ble analysert ved FACS. Tallene på CFSE
høy topp indikere prosent av uskiftet celler. C). Den undertrykkende aktivitet av CD4
+ CD25
+ Tregs på CD4
+ CD25
– Tresp celleproliferasjon på ulike Treg: Tresps forhold (x-aksen). Y-aksen viser prosent av undertrykkelse på Tresp celler spredning aktivitet.
For å demonstrere at CD4
+ foxp3
+ T-celler isolert fra splenocytes av tumorbærende mus har undertrykkende aktivitet, vi utført en CFSE basert treg undertrykkelse analysen. For å få levende celler for 5 dagers co-kultur analysen, vi brukte CD4 og CD25 overflatemarkører for å isolere CD4
+ CD25
+ Tregs. Vi utførte intracellulær farging av foxp3 markør for å bekrefte at flertallet av isolerte CD4
+ CD25
+ Tregs var også CD4
+ foxp3
+ T-celler. Som vist i fig. S1, inngjerdet på CD4
+ CD25
+ celler, ca 87% av cellene farget positivt for foxp3
+. Den CFSE-baserte Treg undertrykkelse analysen ble utført av co-dyrking CD4
+ CD25
+ Tregs og CD4
+ CD25
– responder T-celler (Tresps) (CFSE farget) isolert fra milten av PC-tumorbærende mus. Som vist på fig. 3B, når ingen treg cellene ble tilsatt, det meste av Tresp celler gjennomgikk proliferasjon og bare 36,5% forble udelt. Som forholdet mellom Treg celler til Tresp celler økte i ko-kulturen, ble det observert undertrykkelse av Tresp celleproliferasjon. Prosentandelen av uskiftet Tresp celler økte fra 36,5% (ingen Treg lagt til) til 50,7%, 62,2% og 84,5% ved treg: Tresp forholdstall på 01:08, 01:04 og 01:02, henholdsvis. Som vist på fig. 3C, den undertrykkende aktivitet av CD4
+ CD25
+ Tregs på CD4
+ CD25
– Tresp celleproliferasjon var 22% når 12,5% Tregs var tilstede i ko-kulturen, og den økte til 40% og 76% ved 25% og 50% av Tregs var tilstede, henholdsvis. Disse data støtter sterkt forestillingen om at CD4
+ foxp3
+ T-celler i tumorbærende splenocytes har undertrykkende aktivitet.
For å bestemme fenotype av foxp3
+ Tregs i tumorvev, immunfluorescens farging ble utført. I tumorvev fra mus som ikke fikk mMSLN-VLP immunisering, fant vi at de fleste foxp3
+ Tregs ble infiltrert i svulstvev fra blodårene og ligger i nærheten av tumor blodkar (Fig. S2A). I tillegg foxp3
+ Tregs i tumorvevet var av fenotypen CD4
+ CD8a
– (Fig. S2B), og en stor del av CD8a
+ T-celler (grønt fargede celler) ble plassert ved siden av foxp3
+ T-celler (røde fargede celler) (fig. S2C). Sammenligning antall foxp3
+ celle tall mellom vaksinert og ikke-immuniserte grupper, er foxp3
+ celler reduseres i VLP-immunisert mus tumorvev (Fig. S2D). Denne observasjonen innebærer at foxp3
+ Tregs kan støtte seg direkte interaksjon med CD8a
+ T-celler til å utøve dets undertrykkende virkning på CD8
+ T-celle-antitumor-funksjonen i ikke-immuniserte mus gruppe, mens VLP immunisering reduserer foxp3
+ treg befolkningen og dermed undertrykkelse utøves av foxp3
+ Tregs i svulstvev kan lindres.
Høye nivåer av IL-6 induksjon av mMSLN-VLP er delvis ansvarlig for treg Nedregule gule~~POS=TRUNC
IL-6 ble rapportert å hemme naturlig forekommende foxp3
+ Tregs. For å vurdere om mMSLN-VLP immunisering kan indusere IL-6 produksjon ble begge splenocytes og JAWSII celler brukes for stimulering
in vitro
med mMSLN-VLP. Som vist på fig. 4A, var det en merkbar økning i IL-6 sekresjon DC i mMSLN-VLP behandlede gruppe sammenlignet med PBS kontrollgruppen (22,8% mot 3,21%). I tillegg ble forbedret IL-6-sekresjon fra murine splenocytter også detektert ved den mMSLN-VLP stimulering. Det var 100-ganger økning i nivåene av IL-6 utskilt fra splenocytter i mMSLN-VLP behandlede gruppe sammenlignet med PBS-kontrollgruppen. Dette tyder på at mMSLN-VLP har kapasitet til å stimulere lymfocytter, spesielt DCS, og indusere deres sekresjon av høye nivåer av IL-6.
A). Økt IL-6 produserende JAWSII celler og forhøyet IL-6 nivåer i lymfocytter kultur media på mMSLN-VLP behandling. JAWSII celler ble stimulert med MSLN-VLP (5 ug /ml) i 12 timer og intracellulær IL-6-farging ble utført. Lymfocytter ble fremstilt fra milten av naive B6 mus. Etter inkubasjon med MSLN-VLP i 24 timer ble supernatanten samlet opp for å bestemme IL-6 konsentrasjoner av Bio-Plex. B). Delvis redning av undertrykkende effekt av mMSLN-VLP stimulering på foxp3
+ Treg celler ved IL-6 nøytralisering. MSLN-VLP med eller uten IL-6-nøytraliserende Ab eller isotype kontroll Ab ble tilsatt til lymfocytter kultur i 3 dager. Den foxp3
+ celler ble farget ved hjelp foxp3 intracellulær farging kit. Data ble kjøpt for flowcytometri analyse inngjerdet på CD3
+ og CD4
+ T-celler. Vist var representative data fra tre til fem uavhengige forsøk. (Statistisk betydninger vises, ** indikerer
p
. 0,01).
For å møte om reduksjon i foxp3
+ Tregs av mMSLN-VLP behandling ble formidlet ved hjelp av IL-6, ble IL-6-nøytraliserende antistoff som brukes under VLP stimulering og en isotype kontroll-antistoff ble anvendt som en kontroll. Som vist på fig. 4B, prosentandel av foxp3
+ Tregs var 12,7% i CD3
+ CD4
+ gated celler fra friske naive B6 mus etter 3 dagers inkubasjon. Imidlertid er prosentandelen av foxp3
+ Tregs ble redusert med mMSLN-VLP behandling med eller uten isotype kontrollantistoff (6,51% og 6,18%). Følgelig er IL-6-nøytraliserende antistoff var i stand til delvis å redde reduksjon i hyppigheten av foxp3
+ Treg celler ved ca. 32% (8,16% sammenlignet med 6,18% i mMSLN-VLP eneste behandling). Disse dataene indikerer at IL-6 kan spille en rolle i reduksjon av foxp3
+ Tregs av mMSLN-VLP immunisering.
mMSLN-VLP Immunisering kan selektivt Undertrykk et delsett med CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Tregs
funksjonelle molekyler, slik som CTLA-4, CD25 og CD44 uttrykt på overflaten av foxp3
+ Tregs er viktig i dikterer homing, funksjon og overlevelse kapasitet av disse celler. For ytterligere å adressere hvordan VLP påvirke foxp3
+ Treg biologi, ble flere viktige funksjonelle molekyler farget. Sammenlignet med PBS gruppe, var det ingen åpenbare forskjeller i frekvensene av CD4
+ foxp3
+ CTLA-4
+ Tregs (Fig. 5A), CD4
+ foxp3
+ CD25
+ Tregs (fig. 5B), CD4
+ foxp3
+ CD44
hi Tregs (fig. 5C) etter VLP immunisering. Den hemmende molekyl PD-1 og co-stimulerende molekyl CD40L hadde et lavt uttrykk nivå i foxp3
+ Tregs (Fig. 5D). Prosent og mikrofinansinstitusjoner for CD4
+ foxp3
+ PD-1
+ og CD4
+ foxp3
+ CD40L
+ Tregs i VLP gruppene var svært lik disse verdiene i PBS-kontrollgruppen. Men sammenlignet med PBS-behandlinger (35,7%), prosentandelen av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs i VLP-behandlede grupper ble økt. Den høyeste andelen av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg undergruppe ble observert etter mMSLN-VLP immunisering (59,8%). Prosentandelen i SIV-VLP behandlet musene var 54,0% (Fig. 5F). Ved å korrelere de ovennevnte data til nedgangen i absolutte antall foxp3
+ celler og økningen i andelen ICOS
+ celler i foxp3
+ Treg gruppe, disse dataene tyder på at reduksjonen i foxp3
+ Tregs tilsvarer befolkningen i CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Tregs men ikke til CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs. ICOS kan derfor spille en avgjørende rolle i den tumorundertrykkende funksjon som utøves av Tregs i tumorbærende mus. Disse resultater antyder at selv om mMSLN-VLP immunisering kan redusere den totale frekvensen av treg celler disse er hovedsakelig fra CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Treg celle undersett, men disse Tregs som hører til CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ undergruppe synes å bli opprettholdt.
12
th dag etter tumor-implantasjon og etter en tid VLP vaksine på dag 3, ble musene avlivet for immun responsanalyse. Om 10
6 splenocytes ble inkubert med riktig utvannet fluorescerende-konjugerte antistoffer inkludert CD4, foxp3, CTLA-4, CD25, CD44, PD-1, CD40L, og ICOS. FACSCalibur ble brukt til å erverve og FlowJo programmet ble brukt til å analysere dataene. Celler ble separert på CD4
+ foxp3
+ befolkning og histogram av ulike molekyl uttrykk i ulike eksperimentelle grupper ble presentert i A). CTLA-4; B). CD25; C). CD44; D). PD-1; E). CD40L; F). ICOS. Vist var representative data fra tre forsøk med minst tre mus pr gruppe. (Statistisk betydninger vises, ** indikerer
p
. 0,01).
For å bestemme tilstedeværelsen av både treg celle undergrupper i bukspyttkjertelen kreftpasienter, vevsprøver ble analysert ved immunfluorescens farging. Som vist på fig. S3A, var det en høy tetthet av CD3
+ foxp3
+ Tregs i bukspyttkjertelen tumorvev og mer enn halvparten av disse foxp3
+ Tregs var ICOS
+ (Fig. S3b). Disse dataene antyder at foxp3
+ Tregs spille en viktig rolle i patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen, og begge foxp3
+ ICOS
+ og foxp3
+ ICOS
– tregs subpopulasjoner er involvert i immun undertrykkelse i tumorvev.
mMSLN-VLP Behandling Aktiverer PDCs og oppregulerer ICOSL på PDCs gjennom IL-6 for å opprettholde CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg celler, men ikke CD4
+ foxp3
+ ICOS
– treg celler
Tidligere rapporter har vist at PDCs uttrykker høy grad av ICOSL, og samspillet mellom ICOS og ICOSL er viktig for homeostase av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg celler [13], [29]. Siden mMSLN-VLP immunisering påvirker frekvensen av CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Treg celler, men ikke CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg celler, en av de mulige forklaringer på dette fortrinnsrett vedlikehold av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg celler kan skyldes mMSLN-VLP mediert oppregulering av ICOSL på PDCs. For å undersøke om mMSLN-VLP kunne aktivere PDCs, en mus DC cellelinje, JAWSII, ble brukt. LPS ble anvendt som en kontroll for å stimulere DCS. Som vist på fig. 6A, LPS stimulering økte signifikant CD11b ekspresjon sammenlignet med PBS-behandling (84,6% mot 28,0%). Ikke desto mindre, mMSLN-VLP i stor grad redusert ekspresjon av CD11b (9,14%). I motsetning til ekspresjonen av B220 og Gr-1 var dramatisk oppregulert etter mMSLN-VLP-behandling (95,5% og 86,4%). B220 og Gr-1 har blitt identifisert som primære markører for PDCs. Det var bare lave nivåer av B220 og Gr-1-ekspresjon etter PBS og LPS-behandlinger (10,3% og 10,4% i PBS, 19,7% og 17,5% hos LPS-behandling). Disse dataene indikerer at mMSLN-VLP kan fremme PDCs-lignende celler mens LPS har en preferanse for å aktivere CDC-lignende celler.
Om 10
7 JAWSII celler ble stimulert med enten PBS, LPS (1 ug /ml), eller MSLN-VLP (5 ug /ml) i fullstendig a-media med 5 ng /ml rmGM-CSF. Etter 24 timers inkubasjon ble celleoverflatemarkører farget og kjøpt opp av FACSCalibur. EN). Uttrykk av CD11b, B220, og Gr-1 på ulik behandling av PBS, LPS, eller mMSLN-VLP i JAWSII celler. B). Uttrykk av ICOSL i PBS, mMSLN-VLP eller IL-6 indusert PDCs. C). Uttrykk for ICOS på CD4
+ foxp3
+ Tregs. D). Andel Ki-67 flekker celler i både CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs og CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Tregs. Flere celleoverflatemarkører var flekker og analyse av subpopulasjon fenotyper ble gjort ved hjelp av FACSCalibur og FlowJo programvare. Vist var representative data fra tre til seks uavhengige forsøk. (Statistisk betydninger vises, ** indikerer
p
. 0,01).
For å finne ut om mMSLN-VLP aktiverte PDCs-lignende celler uttrykker forhøyet ICOSL, eller om mMSLN- VLP-indusert IL-6 kan oppregulere ICOSL på PDCs, ble PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) eller IL-6 (20 ng /ml) anvendes for å stimulere miltceller og beis for overflate ICOSL på gated PDCs. Som vist på fig. 6B, andelen av ICOSL-uttrykke celler i mMSLN-VLP aktivert PDCs eller IL-6 aktiverte PDCs var 12,4% og 12,3%, henholdsvis, som ble betydelig økt sammenlignet med PBS aktivert DC (4,95%). Disse data tyder på at mMSLN-VLP eller IL-6-aktiverte PDCs-liknende celler som uttrykker høye nivåer av ICOSL.
Vi har vist at mMSLN-VLP vaksinering induserte høye nivåer av IL-6-produksjon som er delvis ansvarlig for reduksjonen i treg celle frekvens, men effekten IL-6 har i CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs undergruppe fortsatt må bestemmes. Vi har derfor vurdert om mMSLN-VLP eller IL-6 kan også redusere total CD4
+ foxp3
+ Tregs samtidig opprettholde en høy prosentandel av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs
in vitro
. Musesplenocyter ble stimulert med enten PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) eller IL-6 (20 ng /ml). Mens vi observerer betydelig CD4
+ foxp3
+ Treg nedregulering i både mMSLN-VLP og IL-6 behandlingsgruppene, interessant, observerte vi at IL-6 hadde en lignende effekt som mMSLN-VLP behandling som også førte til en økning i hyppigheten av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Tregs celler (fig. 6C). For ytterligere å undersøke egenskapen av denne undergruppe av treg-celler, og for å bestemme hvorvidt ICOS uttrykk er knyttet til proliferasjon av CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg undergruppe, Ki-67 ekspresjon ble anvendt for å bestemme sykling av cellene. Som vist på fig. 6D, fant vi en betydelig andel av Ki-67 positive celler i ICOS
+ Tregs vs. ICOS- Tregs (47,8 ± 8,4% vs. 12,3 ± 3,8%, p 0,001). Dette tyder på at selv om mMSLN-VLP induserte IL-6 reduserer den totale hyppigheten av Treg celler kan det også være ansvarlig for den økte andelen av gjenværende CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg undergruppe gjennom økt spredning av ICOS
+ celler presentere et tveegget sverd.
Diskusjoner
Den raske utviklingen av kreftvaksiner gir store løftet for tumor forebygging og behandlingsformer [4]. I motsetning til andre tumorterapier, vaksiner har mange fordeler som for eksempel utvikling av en minnerespons, spesifikk målretting av kreftceller og færre bivirkninger blant andre. I denne studien demonstrerte vi at mMSLN-VLP immunisering kunne bryte toleranse overfor selv mMSLN og montere en sterk immunrespons mot mMSLN, og derfor effektivt redusere tumorstørrelsen og særlig forlenge overlevelse av tumorbærende mus i en ortotopisk bukspyttkjertelkreft modell . MSLN-spesifikke CD8
+ T-celler kan effektivt indusert av mMSLN-VLP behandling, og har blitt funnet å bidra til undertrykkelse av tumorvekst.
