Abstract
Bakgrunn
hormon-refraktær prostatakreft fortsatt hindret av uunngåelige utviklingen av resistens mot førstelinjebehandling med docetaxel. Nyere studier tyder på at fenotypiske endringer knyttet til kreft kan overføres fra celle til celle
via
mikrovesikler /exosomes. Her ønsket vi å undersøke fenotypiske endringer knyttet til docetaxel-motstand i orden for å fastslå kompleksiteten i dette problemet og for å vurdere relevansen av utskilt exosomes i prostatakreft.
Metodikk /hovedfunnene
docetaxel-resistente varianter av DU145 og 22Rv1 ble etablert og preget i form av kryssresistens, morfologi, spredning, bevegelighet, invasjon,
anoikis
, kolonidannelse, exosomes sekresjon deres og funksjonell relevans. Foreløpige analyser av exosomes fra relevante serumprøver ble også utført. Ervervet docetaxel-Resistens kryssresistens mot doksorubicin og induserte endringer i motilitet, invasjon, spredning og forankring uavhengig vekst. Exosomes utvist fra DU145 og 22Rv1 docetaxel-resistente varianter (DU145RD og 22Rv1RD) overdro docetaxel-motstand mot DU145, 22Rv1 og LNCaP celler, som kan være delvis på grunn av exosomal MDR-1 /P-gp overføring. Exosomes fra prostatakreftpasienter «sera indusert økt celleproliferasjon og invasjon, sammenlignet med exosomes fra alderstilpassede kontroller. Videre exosomes fra sera fra pasienter som gjennomgår et kurs av docetaxel behandling sammenlignet med matchede exosomes fra de samme pasientene før påbegynt docetaxel behandling, når den brukes til både DU145 og 22Rv1 celler, viste en sammenheng mellom cellulær respons til docetaxel og pasientenes behandlingsrespons med docetaxel.
Konklusjon /Betydning
Våre undersøkelser tyder på det komplekse og mangefasetterte natur docetaxel-motstand i prostatakreft. Videre vårt
in vitro
observasjoner og foreløpige kliniske studier indikerer at exosomes kan spille en viktig rolle i prostata cancer, i celle-celle-kommunikasjon, og kan således gi potensial som bærere inneholdende prediktive biomarkører og nye terapeutiske mål.
Citation: Corcoran C, Rani S, O’Brien K, O’Neill A, Prencipe M, Sheikh R, et al. (2012) Docetaxel-Resistance in Prostate Cancer: Evaluering Associated Fenotypiske Endringer og potensial for Resistance Transfer via Exosomes. PLoS ONE 7 (12): e50999. doi: 10,1371 /journal.pone.0050999
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 28. mars 2012; Godkjent: 30 oktober 2012; Publisert: 10.12.2012
Copyright: © 2012 Corcoran et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Science Foundation Irland finansiering av strategiske forskningsklynge, Molecular Therapeutics for Cancer Irland (08 /SRC /B1410) til JC, WW, LOD; finansiering, til LOD, for å støtte KOB som Marie Keating Foundation Scholarship ved Trinity College Dublin; og infrastruktur og kjernefasilitet støtte gjennom Irlands HEA Program for forskning i tredje nivå Institutes (PRTLI) Cycle 5 til LOD blant annet TCD proteasehemmere. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mens docetaxel tilbyr forbedring i total overlevelse for pasienter med hormon ildfast prostatakreft (hrpc) som fremgår av to fase III-studier (TAX 327 og SWOG 9916) og påfølgende klinisk ledelse, dessverre tilbakefall er nesten uunngåelig. Årsaker til svikt i docetaxel for å øke overlevelse utover ~2.5 månedene har ennå ikke helt klarlagt. Legemiddelresistens er ofte tilskrevet med over-ekspresjon av transportørproteiner, inkludert P-glykoprotein (MDR-1 /P-gp), i forbindelse med utstrømningen i en rekke anti-kreft (og andre) midler [1] – [3]. Dessuten har kjemoterapi-resistens også blitt vist å bidra til endringer i invasiv og bevegelige fenotypen av cellene [4] – [7]. Andre fenotypiske egenskaper som kan være forbundet med dette problemet i prostatakreft har ennå ikke definert.
I tillegg til dette, nyere studier tyder på at fenotypiske endringer knyttet til kreft kan overføres fra celle til celle
via
mikrovesikler /exosomes. Exosomes er blitt beskrevet som nano-størrelse membranbundne vesikler av endocytiske opprinnelse [8]. Avhengig av deres celle opprinnelsesland, har disse små blærer vært innblandet med flere ulike roller noe som inkluderer deres tilknytning til syke tilstander som kreft. Intercellulære kommunikasjonen er en slik rolle, gjennom deres evne til å fremme signaltransduksjon [9] og overføring av membranreseptorer, proteiner, mRNA, og mirnas [10], [11] fra en celle til en annen. Relevansen av exosomes i form av sitt potensial til å bistå i prostata kreft progresjon og utvikling av cellegift-motstand har ennå ikke bestemt.
På grunn av den komplekse natur av prostatakreft progresjon, docetaxel-resistente prostata cellelinjer ble utviklet og preget til å representere både primære og metastatiske svulster samt androgen-følsomhet og androgen-motstand i prostatakreft. I korte trekk, ervervet-motstand mot docetaxel, i to prostatakreft cellelinjer, overdro kryssresistens til antracyklin, doxorubicin og induserte endringer i motilitet, migrasjon, invasjon, spredning og forankring uavhengig vekst. Påføring av exosomes, isolert fra docetaxel-resistente DU145RD og 22Rv1RD kreftceller, til docetaxel-sensitive DU145, 22Rv1 og LNCaP foreldre celler tillagt en betydelig økning i motstand mot docetaxel til hver av disse mottakercellene. Dette kan i det minste delvis, være på grunn av overføring av MDR-1 /P-gp med exosomes. Exosomes fra prostata cancer serumprøver som induserte en signifikant økning i celleproliferasjon og invasjon i forhold til exosomes fra alderstilpassede friske kontroller. Videre exosomes fra sera fra pasienter som gjennomgår et kurs av docetaxel behandling sammenlignet med matchede exosomes fra de samme pasientene før påbegynt docetaxel behandling, når den brukes til både DU145 og 22Rv1 celler, viste en sammenheng mellom cellulær respons til docetaxel og pasientenes respons på docetaxel behandling. Disse foreløpige translasjonsforskning studier støtter videre den kliniske relevansen av exosomes i prostatakreft.
Resultater
bestemme omfanget av Resistance til Docetaxel
Som beskrevet i tabell 1, DU145RD og 22Rv1RD celler ble funnet å være ca 108- og 71-fold motstandsdyktig mot docetaxel sammenlignet med sine respektive alderen foreldercellelinjer.
docetaxel-resistente celler Demonstrer Noen kryssresistens mot andre kreftlegemidler
Både resistent cellelinje varianter utviste kryssresistens (4-8 ganger) for å Doxorubicin (tabell 1), mens Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i følsomhet til 5-fluorouracil eller Karboplatin for DU145RD eller 22Rv1RD i forhold til deres respektive ordnede celler.
docetaxel-resistente varianter skiller seg ikke i morfologi, men har forskjellig spredning, motilitet og invasjon fenotyper Versus Parent cellelinjer
Observasjon av cellemorfologi avdekket ingen vesentlige forskjeller i morfologi av cellene etter ervervet docetaxel-resistens (figur 1), selv om resistente celler formere seg langsommere enn deres docetaxel-følsomme moderpopulasjoner (tabell 2). Sårhelende analyser ble anvendt til å evaluere effektene av docetaxel-motstand på celle motilitet (figur 2). Etter 24 timer, DU145RD celler viste signifikant (p 0,05) øket sårheling sammenlignet med DU145. Docetaxel bestandig 22Rv1RD viste marginal, men signifikant (p 0,05), redusert til lukking av sår i forhold til 22Rv1. Tatt i betraktning cellulær migrasjon (figur 3A) og invasjon (figur 3B), ble DU145RD funnet å ha økt motilitet (p 0,01) og invasive evner (p 0,05) sammenlignet med DU145. 22Rv1RD forhold til 22Rv1 celler, men viste en redusert trend i migrasjon (p 0,01) og invasjon (p 0,05).
Bilder av sensitive foreldre og docetaxel-resistente varianter av DU145 og 22Rv1 cellelinjer. (Olympus CKX4, 20X forstørrelse).
sårhelende analyser ble utført for å vurdere cellemotilitet. Monolag ble ripet med en pipettespiss og de resulterende sårede områder ble overvåket ved fasekontrastmikroskopi i 24 timer (DU145) og 48 timer (22Rv1). Resultatene vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p. 0,05 (t-test)
Migrasjon analysene ble utført ved hjelp av 8 mikrometer porestørrelse 24-brønns transwell kamre; B: For invasjonen analysene innleggene var pre-belagt med ECM. Celler ble tillatt å migrere /invadere i 48 timer (DU145) og 72 timer (22Rv1). Resultatene vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p 0,05, ** = p. 0,01 (t-test)
ervervet Docetaxel-motstand Påvirker Anchorage uavhengig overlevelse og vekst
Gransker om ervervet resistens kan også gi
anoikis
motstand, vi observert resistens å være signifikant assosiert med redusert celledød under
anoikis
forhold for både narkotika -resistente varianter
dvs.
DU145RD (p 0,05) og 22Rv1RD (p 0,05); sammenlignet med de respektive kontrollceller (Figur 4A). Deretter vurdere om disse levedyktige celler er også i stand til å spre seg i suspensjon, ble kolonidannelse i soft agar funnet å være signifikant økt i DU145RD (
P
0,05) og 22Rv1RD (
P
. 0,05) i forhold til sine respektive moderceller (figur 4B)
anoikis
analyser, cellelinje-varianter ble utsådd på poly (hydroksyetyl methactylic) syre-belagte 24-brønners platene – eller 95% etanol-belagte plater, som kontrollgruppe – og ble dyrket i 24 timer. 100 ul av Alamar blue fargestoff ble deretter tilsatt til hver brønn, inkubert i 4 timer, og absorbansen ble målt ved 570 nm; B: kolonidannelse analysene ble utført ved hjelp av Cytoselect ™ 96-Well Cell Transformation kit. Cellene ble inkubert i 8 dager i halvfast agar media før de blir lysert og oppdaget med CyQuant GR Dye i en fluorescens plateleser. Resultatene vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p. 0,05 (t-test)
Exosomes utskilles fra prostata kreft celler og kan påvirke Response to Docetaxel men ikke signifikant Alter spredning, motilitet og invasjon
Transmisjonselektronmikros elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC identifisert tilstedeværelsen av exosomes isolert fra kondisjonert medium av alle cellelinje varianter (figur 5A). Videre western blotting for både TSG101 og PDC6I /Alix (figur 5B), proteiner vanligvis forbindes med exosomes dannelse og dermed anses å være viktige markører for vellykket isolering av exosomes [12], [13], ble påvist i isolater fra kondisjonerte mediet av alle cellelinje varianter. Mengder av exosomes utvist fra docetaxel-resistente og alderen matchet varianter avvek ikke signifikant (figur S1 A). Som ervervet docetaxel-motstand i DU145RD celler var assosiert med økt migrasjon og invasivitet, neste undersøkte vi om autolog (DU145) eller resistente (DU145RD) exosomes kan endre motilitet vurdert av sårhelende kapasitet (figur 5C) og invasjon (figur 5D ( i)) av DU145. Ingen signifikant forskjell mellom viklet stengninger av celler i nærvær av DU145 eller DU145RD exosomes ble funnet. På samme måte når den brukes til 22Rv1 celler, verken DU145- eller DU145RD-avledet exosomes tillagt en betydelig effekt på invasjonen (figur 5D (ii))
A:. Transmisjonselektronmikroskopi ble utført for å undersøke størrelse og struktur på exosomes ; B: Western blotting ble utført for å vurdere uttrykk for vanlige exosomes markører på 30 mikrogram (TSG101) og 8 mikrogram (PDC6I /Alix) exosomes isolert fra DU145 og 22Rv1 cellelinje varianter; C: DU145 sårhelende analyser i nærvær av exosomes (5 pg) fra DU145 cellelinje-varianter; D (i): DU145 invasjonsforsøk i nærvær av exosomes (15 ug) fra DU145 cellelinje-varianter; D (ii): 22Rv1 invasjonsforsøk i nærvær av exosomes (15 ug) fra DU145 cellelinje varianter
En svak økning i proliferasjon av DU145-celler i nærvær av DU145-avledede exosomes ble notert. . Dette nærmet signifikans (p = 0,053); imidlertid, DU145RD exosomes forandret ikke vesentlig spredning av DU145-celler (figur 6A (i)); muligens som følge av den langsommere veksthastigheten til celler fra hvilke de sistnevnte exosomes ble avledet. Etter behandling med IC
50 konsentrasjon av docetaxel, tilstedeværelse av DU145 exosomes (p 0,05) og i større grad DU145RD exosomes (p 0,01) (figur 6A (ii)), ble funnet å indusere en signifikant grad av docetaxel ufølsomhet (motstand) til cellene. Til mer bredt undersøke om DU145RD exosomes kan indusere lignende påvirker når den brukes til andre cellelinjer, vi neste undersøkt disse exosomes på både 22Rv1 og LNCaP celler (Figur 6B og 6C). Hverken DU145- eller DU145RD-avledede exosomes påvirkes i betydelig grad av spredning av 22Rv1 eller LNCaP-celler (figur 6B (I) og 6C (i)). Etter behandling med docetaxel, ble det ikke observert noen vesentlig forandring i respons av 22Rv1 eller LNCaP-celler for å docetaxel i nærvær av DU145 exosomes når sammenlignet med virkningen av medikamentet i nærvær av PBS i stedet for exosomes (figur 6B (ii) og 6C ( ii)). Imidlertid, i nærvær av DU145RD exosomes, evne til 22Rv1 og LNCaP-celler til å overleve i denne konsentrasjonen av docetaxel betydelig høyere (p 0,001) (figur 6B (ii) og 6C (ii)). For å finne ut om dette er sannsynlig å være spesifikke for exosomes fra en cellelinje variant (DU145RD) eller mer generelt til exosomes fra docetaxel-motstand celler, exosomes fra 22Rv1 og 22Rv1RD varianter ble deretter vurdert. Her fant vi den samme tendensen til å skje
dvs.
Det var ingen signifikant økning i spredning av DU145 eller LNCaP celler i nærvær av enten 22Rv1 eller 22Rv1RD exosomes (Figur 6D (i) og figur 6E (i)). Det var ingen signifikant endring i respons til docetaxel, enten ved DU145 eller LNCaP celler, i nærvær av alderen forelder 22Rv1-avledet exosomes. Imidlertid, i nærvær av exosomes fra resistent variant 22Rv1RD, begge DU145-celler (p 0,01) (figur 6D (ii)) og LNCaP-celler (p 0,01) (figur 6E (ii)) viste en signifikant økning i motstanden mot docetaxel
AC (i). DU145, 22Rv1 og LNCaP spredning i nærvær av exosomes (20 mikrogram) fra DU145 cellelinje varianter; A-C (ii) Reaksjon av DU145, 22Rv1 og LNCaP-celler til docetaxel i nærvær av exosomes (20 ug) fra DU145 cellelinje-varianter; D-E (i): DU145 og LnCap proliferasjon i nærvær av exosomes (20 ug) fra 22Rv1 cellelinje-varianter; D-E (ii): Response av DU145 og LNCaP celler til docetaxel i nærvær av exosomes (20 mikrogram) fra 22Rv1 cellelinje varianter; F: Western blotting ble utført for å vurdere ekspresjon av MDR-1 /P-gp i totalt cellulært protein (50 ug) og tilsvarende exosomes (30 ug) av DU145 og 22Rv1 cellelinje varianter. Resultatene vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001 (t-test)
Vi har tidligere rapportert at både DU145RD -og 22Rv1RD i større extent- uttrykt MDR-1 /P-gp, mens MDR-1 /P-gp ble uoppdaget i de alders matchet kontrollceller, DU145 og 22Rv1 [14] (figur 6F). For å undersøke om MDR-1 /P-gp er muligens gjennomført
via
exosomes fra DU145RD eller 22Rv1RD celler, vi undersøkt tilstedeværelsen av denne efflukspumpen i exosomes isolert fra disse resistente varianter. Her rapporterer vi at MDR-1 /P-gp er faktisk til stede i de tilsvarende exosomal utdrag (Figur 6F).
Exosomes detekteres i serum fra pasienter med prostatakreft, og kan påvirke Cellular spredning, Invasion og respons på Docetaxel
Western blotting for både TSG101 og PDC6I /Alix (figur 7A) demonstrerte vellykket isolering av exosomes fra sera av prostatakreftpasienter og friske kontroller. Mengder av exosomes påvist i sera hos prostatakreftpasienter og eldre-matchet kontroller var ikke signifikant forskjellig (figur S1B). Da lagt til DU145 cellene, exosomes fra docetaxel-naive pasienter med prostatakreft (n = 6) viste en signifikant (
P
0,001) økning i invasjonen i forhold til exosomes fra alderstilpassede friske kontroller (figur 7B ). Videre, når den brukes til 22Rv1 celler, var det en betydelig økning i proliferasjon i nærvær av prostatakreft exosomes i forhold til de fra friske kontroller (
P
0,01) (figur 7C). For det formål å vurdere potensielle relevansen av sirkulerende exosomes med hensyn til hvordan de kan bidra til å forutsi eller faktisk påvirke pasientenes respons på docetaxel behandling, påvirkning av exosomes isolert fra pasienter før docetaxel behandling (n = 8) sammenlignet med matchede exosomes isolert fra de samme pasientene i løpet av sine 10 sykluser med docetaxel behandling ble vurdert. For hensikten med denne pilotstudien pasienter (n = 6) som oppnådde avtagende PSA nivåer med behandling i forhold til sine pre-behandling PSA nivåer ble ansett som «respondere», mens de (n = 2) hvis PSA nivåer økte i løpet behandling ble ansett som «non-respondere». Som indikert i figur 7D, ble 22Rv1 og DU145-celler eksponert for deres omtrentlige IC
50 konsentrasjoner av docetaxel og den resulterende cellelevedyktigheten ble deretter tilordnet en vilkårlig verdi på 1. De exosomes isolert i løpet av behandlingen av pasienter med økende PSA nivåer (Pasienter A B; «non-responders») ble funnet å beskytte både 22Rv1 og DU145 celler fra virkningene av docetaxel. I motsetning til de seks docetaxel «respondere», de exosomes isolert under behandlingen virket å forbedre den hemmende effekten av docetaxel på både 22Rv1 og DU145 cellene.
Western blotting ble utført for å vurdere uttrykk for vanlige exosomes markører i 30 mikrogram exosomes isolert fra sera av docetaxel-naive pasienter (pasient # 1-6) og alderstilpassede friske kontroller (kontroll # 1-6). B: DU145 invasjon i nærvær av exosomes fra docetaxel-naive pasienter og i alderen matchet friske kontroller (25 mikrogram), med representative invasjon bildet. C: 22Rv1 spredning i nærvær av exosomes fra behandlingsnaive pasienter og alderstilpassede friske kontroller (25 mikrogram). Resultatene vises som n = 6 ± SEM, hvor ** = p 0,01, *** = p 0,001 (t-test). D: Response, til docetaxel, av 22Rv1 og DU145 cellene i nærvær av serum-avledet exosomes fra pasienter med forhøyede PSA nivåer (n = 2; Pasienter A B) og i nærvær av exosomes fra pasienter med nedsatt PSA nivåer ( n = 6; Pasienter C-H)
Diskusjoner
Mens docetaxel fortsatt som dagens gullstandard for hrpc behandling, øker det bare total overlevelse ved i gjennomsnitt 2,5 måneder og de. pasienter som i utgangspunktet reagerer etter hvert utvikler resistens mot dette stoffet. I denne studien viser vi den komplekse natur av docetaxel-motstand ved bruk av
in vitro
human prostatacancercellelinje modeller. Både docetaxel-resistente cellelinje varianter i denne studien viser kryssresistens mot doxorubicin, som er konsistent med tidligere studier av docetaxel-resistente kreft i bukspyttkjertelen celler [15] og brystkreftceller [16]. I tillegg er paclitaxel, docetaxel som er syntetisk-avledet, blitt forbundet med kryssresistens mot doksorubicin i paclitaxel-motstandsdyktig prostatakreft-cellelinjer [2]. Interessant, DU145RD og 22Rv1RD celler, sammenlignet med de eldre-moderpopulasjoner, også delte en rekke andre fenotypiske karakteristiske forandringer i tillegg til motstand og kryssresistens. Disse inkluderte redusert spredning, økt
anoikis
motstand og økt koloni formasjon; men DU145RD og 22RV1RD skilte med hensyn til endringer i deres motilitet og invasjon
Økt migrasjon og invasjon har tidligere blitt koblet med chemoresistance [4] -. [6] som gjenspeiles i resultatene av vår DU145 modell. Mens 22Rv1 cellevariantene vist de motsatte virkninger med hensyn til migrering og invasjon, er det verdt å merke seg at for de motilitet analyser nivået for sårheling var minimal følgende 48 timer og invasjon /migrerings analyser ble sådd ut ved en vesentlig høyere tetthet enn nødvendig for DU145 celler for å oppnå de observerte resultater. Det er mulig at disse forskjellene er identifisert kan være assosiert med allerede kjente forskjeller mellom de cellelinjer (for eksempel detaljert, 22Rv1 cellene er fra en primærtumor og er androgen-følsomme, mens DU145 er fra en hjernemetastaser, og er androgen-insensitive). Dette understreker ytterligere behovet for disse typer studier og inkludering av større paneler av cellelinje modeller, der det er mulig, å så optimalt som mulig reflektere andre pasient-til-pasient forskjeller og så øke vår forståelse av kompleksiteten i docetaxel-resistens i prostatakreft. Knockdown av beta catenin i osetocarcinoma celler øker motstanden mot doxorubicin har tidligere vært forbundet med undertrykt invasjon [7]. Videre har multiresistent cellelinjer avledet fra Dunning R3327 modell av rotte prostatakarsinom vist seg å miste metastatisk potensial i vertsdyr i forhold til sine overordnede celler [17].
Tidligere studier med kolorektal kreft ( HT29), brystkreft (T47D) og tykktarmskreft (H630) celler, i samsvar med vår egen, har funnet ut at ervervet chemo-motstand kan redusere vekstraten [18], [19]. Redusert celleproliferasjon på grunn av tilstedeværelsen av kromosomal ustabilitet, som er forbundet med multimedikamentresistens, er nylig blitt demonstrert i kolorektal kreftceller [20]. Dermed økte evne docetaxel-resistente varianter å motstå celledød under
anoikis
forholdene i vår studie kan ikke tilskrives en enkelt økt forekomst av spredning. Sammenhengen mellom økt klonogene overlevelse og cellegift-motstand, observert i både vår DU145RD og 22Rv1RD celler, er i tråd med flere andre studier [18], [21], [22].
Den nye bevis for at cellene kan kommunisere med nabo «eller sekundære celler» gjennom utskillelsen av mikro- eller nanostørrelse vesikler (kjent som exosomes) bærer mobil informasjon har nylig understreket betydningen av disse enhetene [23]. Vi har derfor undersøkt muligheten av disse vesikler til å bli utvist og overføre fenotypiske endringer, forbundet med docetaxel-motstand, til sekundære celler. Ingen vesentlige forskjeller i motilitet, invasjon eller spredning av DU145 og 22Rv1 celler ble observert i nærvær av DU145- eller DU145RD-avledet exosomes. Begrensede studier, til dags dato, har vist at exosomes uttrykker amfiregulin [24] og HSP90α [25] kan øke kreft cellemotilitet og migrasjon. Men dette ser ikke ut til å være tilfelle med prostatakreft celle-avledet exosomes vurderes her.
Interessant vi fant indusert docetaxel resistens med DU145 cellene i nærvær av DU145RD exosomes (ca. 22%), sammenlignet med når disse cellene ble utsatt for sin egen exosomes. Dette tyder på at DU145RD exosomes er, faktisk, å overføre resistens til docetaxel. Videre ble et lignende mønster funnet når DU145- og DU145RD-avledede exosomes ble tilsatt til 22Rv1 og LNCaP-celler. Nærmere bestemt, en betydelig økning i docetaxel-motstand (ca. 15% for 22Rv1,. 16% for LNCAP), uavhengig av påvirkninger spredning, resulterte. Dette, for første gang viser at exosomes kan være et middel for å kommunisere docetaxel-motstand mellom cellene. For å bekrefte at den observerte påvirker av DU145RD-avledet exosomes er ikke begrenset til denne cellelinjen variant, utførte vi en lignende undersøkelse med 22Rv1 og 22Rv1RD exosomes. I tråd med funnene fra våre første DU145RD exosomes analyser, observerte vi en lignende trend konferert docetaxel-resistens (
dvs.
en økning på ca. 11-12%) til både DU145 og LNCaP celler i nærvær av 22Rv1RD exosomes.
MDR-1 /P-gp er uttrykt av både våre DU145RD og 22Rv1RD celler, men ikke påvises i de overordnede cellene, impliserer det som er involvert i det oppkjøpte docetaxel-resistens (denne observasjonen er noe i tråd med den kliniske situasjon der flertallet av prostata kreft er MDR-1 /P-gp-positive [26]). Viktigere, fant vi at uttrykket mønster i de tilsvarende exosomes reflektert som av cellene som de ble hentet, ytterligere støtte potensialet for motstand overføring og vårt forslag at MDR1 /P-gp kan potensielt være -Minst partly- involvert i nyervervede resistens~~POS=HEADCOMP med de exosomes. Men forskjellen i MDR-1 /P-gp-nivåer mellom exosomes fra docetaxel-resistente varianter i forhold til foreldre celler ikke nødvendigvis en årsaks rolle for MDR1- /P-gp i resistens observert.
for ytterligere å undersøke potensialet for exosomes i en klinisk setting, som en pilotstudie vi isolert exosomes fra docetaxel-naive pasienter med prostatakreft og alderstilpassede friske kontroller. Vi undersøkte påvirker av disse exosomes på kreftcelle invasjon og spredning. Den økte proliferasjon og invasjon av celler i nærvær av exosomes fra kreftpasienter som tyder på en kausal rolle for disse exosomes. Selv om dette er en liten pilotstudie, tatt sammen med våre cellelinje-avledet exosomes studier, støtter videre hypotesen om at exosomes kan ha en rolle i prostatakreft cellekommunikasjon.
I sammenheng med docetaxel-motstand, vi senere undersøkt relevansen av exosomes avledet fra aktuelle pasientene. Spesielt denne pilotstudien (n = 8 pasienter) inkludert matchet serum exosomes innhentet før og i løpet docetaxel behandling. Her vurderte vi responsen av DU145 og 22Rv1 celler til deres IC
50 konsentrasjoner av docetaxel (som vist i tabell 1
ie
1,7 nM for DU145-celler; 4 nM for 22Rv1 celler) i nærvær av disse exosomes populasjoner. Den observerte docetaxel-resistens overdratt til begge cellelinjer ved exosomes isolert fra pre-syklus 7 sera (n = 2 pasienter) korrelert med pasientenes økning i PSA-nivå. De exosomes fra de resterende 6 pasienter syntes å gi økt følsomhet for både DU145 og 22Rv1 celler, korrelere med pasientene (n = 6) reduserte nivåer av PSA over deres løpet av behandlingen.
En mulig forklaring på den måten hvorved exosomes påvirker fenotypen av «target» celler er at de skal overføre mRNAer, mirnas og /eller proteiner fra de overtatte motstands-celler som er årsaks molekyler i å endre den cellulære fenotype av mottaker sekundære celler. Dette er i tråd med oppsamling av bevis på at exosomes spiller en viktig rolle i celle-til-celle-kommunikasjon. For eksempel i 2007 Valadi et al. demonstrerte at mRNA som utføres via exosomes fra mastceller blir translatert til protein på deres overføring til målceller [10]. Den vellykkede opptak av exosomes av sekundære celler ble også demonstrert ved Skog et al. [11] når fluorescently-merkede glioblastom exosomes ble inkubert med endotelceller. Mange nyere eksempler på disse observasjonene har blitt rapportert, og en fersk uttalelse fra Mittelbrunn og Sanchez-Madrid [27] videre beskriver hvordan denne overføringen av genetisk informasjon kan forekomme, med effekten av exosomes på sekundære celler potensielt bidrar til kreftutvikling og tumorvekst; støping svulsten mikromiljøet; fremme angiogenese; og modulering av immunresponsen [28], [29]. Spesielt i forbindelse med modulering av respons til anti-kreftterapi, har HER2-overuttrykkende exosomes fra donorceller er vist å redusere følsomheten av mottakercellene til trastuzumab [30]. Så mens vi ikke kan spekulere i de spesielle molekyler som kan utføres
via
exosomes fra våre resistente celler for å indusere fenotypiske endringer i målceller (annet enn å foreslå at overføringen av MDR-1 /P-gp protein kan delvis være en medvirkende faktor), er det rimelig å anta at det kan være en enkelt-eller kombinasjon av-mRNA, mirnas og /eller proteiner som har en kausal rolle i docetaxel-motstand. Dermed, nå som funksjonell relevans har vært forbundet med disse exosomes i overdragelse et nivå av docetaxel-motstand, profilering av innholdet i disse exosomes er garantert å bedre forstå den nøyaktige molekyl (e) og mekanismen (e) som er involvert.
som konklusjon, denne undersøkelsen bekrefter at docetaxel-resistens i prostata cancer er svært kompleks og kan være forbundet med variert cellulær rammer når det gjelder resistens mot andre kjemoterapeutiske medikamenter, motilitet, invasjon, og forankrings-uavhengig vekst. Det er imidlertid klart at gitt den mangefasetterte natur docetaxel-motstand som ikke bare én, men flere faktorer er trolig å formidle deres virkninger i prostatakreft. Her viser vi, for første gang, at mobil kommunikasjon
via
exosomes kan delvis resultere i overdratt docetaxel-motstand mot sekundære celler. Fremtidige studier på større kohorter av serumprøver, både fra docetaxel-naive pasienter og også fra pasienter etter docetaxel behandling, er garantert -assessing både påvirker av og de molekylære innholdet i exosomes- å utvide vår forståelse av exosomes og deres relevans for celle kommunikasjon og docetaxel-motstand i prostatakreft
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
prostatakreft cellelinjer, 22Rv1 (ATCC CRL-2505,. androgen-sensitive ; fra en primær human svulst), DU145 (ATCC HTB-81; androgen-ufølsomme, fra en hjernemetastase) og LnCap (ATCC CRL-1740; androgen-følsomme; fra lymfeknutemetastase) ble kjøpt fra American Type Culture Collection ( ATCC). 22Rv1 og DU145-celler ble holdt i RPMI medium (Sigma-Aldrich) supplert med 10% føtalt bovint serum (PAA), 1% L-glutamin (Sigma-Aldrich) og ved 37 ° C /5% CO
2. LNCaP-celler ble opprettholdt i avansert RPMI (Biosciences) supplert med 10% føtalt bovint serum (PAA), 1% L-glutamin (Sigma-Aldrich) og 1% Hepes (Sigma-Aldrich) og ved 37 ° C /5% CO
2.
