Abstract
Kiselalger er en viktig klasse av encellede alger som produserer bioaktive flerumettet aldehyder (PUA) som induserer abort eller misdannelser hos barn av virvelløse dyr som utsettes for dem under svangerskapet. Her sammenligner vi effektene av PUAs 2-
trans
, 4-
trans
-decadienal (DD), 2-
trans
, 4-
trans
-octadienal (OD) og 2-
trans
, 4-
trans
-heptadienal (HD) på adenokarsinom cellelinjer lunge A549 og tykktarm COLO 205, og normal lunge /lunsj epitelial BEAS-2B cellelinje. Ved hjelp av levedyktighet MTT /trypanblått-analyser viser vi at PUAs har en toksisk effekt på både A549 og COLO 205-tumorceller, men ikke BEAS-2B normale celler. DD var den sterkeste av de tre PUAs testet, på alle tidsintervaller vurderes, men HD var like sterk som DD etter 48 timer. OD var den minst aktive av de tre PUAs. Effekten av de tre PUAs var noe sterkere for A549 celler. Vi studerte derfor død signalveien aktiveres i A549 viser at celler behandlet med DD aktivert tumornekrosefaktor reseptor 1 (TNFR1) og Fas-Associated død domene (FADD) som fører til necroptosis via caspase-3 uten å aktivere overlevelsesreaksjonsveien reseptor-veksel Protein ( HVIL I FRED). Den TNFR1 /FADD /caspase sti ble også observert med utvendig diameter, men først etter 48 timer. Dette var den eneste PUA som aktivert RIP, i samsvar med det funn at OD forårsaker mindre skade på cellesammenlignet med DD og HD. I kontrast, celler behandlet med HD aktivert Fas /FADD /caspase pathway. Dette er den første rapport som PUAs aktivere en ytre apoptotisk maskineri i motsetning til andre anticancer legemidler som fremmer en iboende død vei, uten å påvirke levedyktigheten av normale celler fra den samme vevstypen. Disse funnene har interessante implikasjoner også fra økologisk synspunkt med tanke på at HD er en av de vanligste PUAs produsert av kiselalger
Citation. Sansone C, Braca A, Ercolesi E, Romano G, Palumbo A, Casotti R, et al. (2014) Diatom-Avledet Flerumettet aldehyder Aktiver celledød i humane kreftcellelinjer, men ikke normale celler. PLoS ONE 9 (7): e101220. doi: 10,1371 /journal.pone.0101220
Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, India
mottatt: 14 januar 2014; Godkjent: 04.06.2014; Publisert: 03.07.2014
Copyright: © 2014 Sansone et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Stazione Zoologica Anton Dohrn og av den italienske nasjonal Operativ prosjektleder PON01_02093 Studier av nye teknologier og teknologiske plattformer for forbedring av produksjonsprosesser av aktive farmasøytiske ingredienser av industriell interesse og søke etter nye bioaktive molekyler fra naturlige kilder. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekrefter at medforfatter Adrianna Ianora er en PLoS ONE akademisk redaktør, men at dette ikke endrer forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Kiselalger er mikroskopiske, encellede alger som representerer dominerende fotosyntetiske organismer i verdenshavene. Deres gunstig rolle som mat for beitedyr ble utfordret over et tiår siden, etter at det er registrert noen diatomfragmentenes arter produserer teratogene forbindelser som flerumettede aldehyder (PUA) som induserer abort, fødselsskader, dårlig utvikling og høy avkom dødelighet i rov planktoniske og bunnlevende virvelløse dyr [ ,,,0],1] – [3]. PUAs er sluttproduktene av et lipoksygenase /hydroperoksyd lyase metabolismeveien [4] initiert av skade på algeceller, som forekommer ved beiting av rovdyr. Celleskader aktiverer lipase enzymer som frigjør flerumettede fettsyrer (PUFA) fra cellemembraner som er umiddelbart oksidert og spaltet i løpet av sekunder for å danne PUAs og en mengde andre forbindelser kollektivt betegnet oxylipins [4], [5]. Mange funksjoner har blitt foreslått for PUAs eksempel: Grazer forsvar [6], [7]; allelopathy [8], [9], celle til celle signalisering [10], antibakteriell aktivitet [11], [12], og blomstre avslutning [13], [14]. Dermed samme sekundære metabolitter har flere funksjoner fra beite forsvar for å signalmolekyler som medierer flere plankton interaksjoner.
Først beskrevet i marine kiselalger av Miralto et al. [15] som viste at PUAs 2-
trans, etter 4-
cis
, 7-
cis
-decatrienal, 2-
trans
, 4-
trans
, 7-
cis
-decatrienal og 2-
trans
, 4,
trans
-decadienal (DD) arrestert embryonal utvikling i hoppekreps og kråkeboller, og hadde antiproliferative og apoptotiske virkninger på menneske adenokarsinom CaCo2 cellelinje. Suksessivt, har både laboratorie- og feltstudier viste en negativ innvirkning diatomfragmentenes dietter på raudåte Grazer reproduktiv suksess [6], [16] – [19]. PUAs kan fanges og lagres under eggcelle utvikling og sendes matern til embryoet, eller kan opptre direkte på befruktede egg. Ved hvilken rute, vil tidspunktet for reproduksjon i forhold til giftige diatomeen overflod har viktige konsekvenser for virvelløse rekruttering [6].
Lignende forbindelser produsert av høyere blomstrende planter som antas å spille en sentral rolle i planteforsvar fordi de fungerer som kjemiske attraktorer (f.eks feromoner, pollinator tiltrekning) eller alarmsignaler mot herbivore angrep (f.eks i tritrophic interaksjoner) og beskyttende forbindelser (antibakteriell, sårheling) [20]. Diatom oxylipins viser også en høy likhet med flyktige organiske forbindelser som frigjøres fra brunalger som er foreslått å være involvert i kjemisk signal og feromon tiltrekning mellom kjønnsceller av forskjellig kjønn [20] og ser ut til å være mellomprodukter for medfødt immunitet [21].
den PUA DD er best studerte metabolitt av denne gruppen, og har dermed blitt en modell aldehyd for eksperimentelle studier på effekten av oxylipins på marine organismer (anmeldt i [1], [3]). Imidlertid har flere marine kiselalger vist seg å gi andre enn DD PUAs, inkludert
Skeletonema marinoi
, en kosmopolitisk blomst danner diatomeen som produserer 2-
trans
, 4-
trans
-heptadienal (HD), 2-
trans
, 4-
trans
-octadienal (OD) og 2-
trans
, 4-
trans
, 7-octatrienal (octatrienal) [22], [23]. Av disse er den mest vanlige HD [13], [24]. Ceballos og Ianora [25] gjennomført eksperimenter teste effekten av DD, OD og HD på raudåte egg-klekking suksess som viser at jo lengre kjedelengde på PUAs, jo sterkere den biologiske aktiviteten til disse molekylene, som også bekreftes av [26] i bakterier, alger, sopp, pigghuder, bløtdyr og krepsdyr, og [27] med kråkebolle egg. Ribalet et al. [9] fant også en konsentrasjonsavhengig reduksjon i veksttakten av marine planteplankton, som tilhører forskjellige taksonomiske grupper, utsatt for PUAs med lengre kobles aldehyder som har sterkere effekt på vekst enn kortere kobles aldehyder.
Her vi sammenligner effekten av ulike PUAs, inkludert DD, OD og HD på lunge adenokarsinom cellelinje A549, colon adenokarsinom hentet fra metastatisk ascites COLO 205 cellelinje, og lunge /lunsj normal epitel cellelinje BEAS-2B. PUAs er kjent for å forårsake apoptose [15], [28] – [29], men i en tidligere studie [6] ble de vist å utøve dramatiske effekter bare på formerende, udifferensierte celler. Vi brukte derfor to svært aggressive tumorcellelinjer for å bedre forstå de veier som er involvert i celledød og en normal en å vurdere en hypotetisk bestemt handling mot voksende celletyper. En annen viktig målsetting var å sammenligne effekten av DD, en modell PUA i toksikologiske eksperimenter, men ikke den vanligste PUA stede i marint planteplankton (i en undersøkelse av 51 arter av marine kiselalger, DD var den minst oppdaget PUA, [24]) med jo mer utbredt diatomeen PUAs HD og OD. Dette er mer sannsynlig å forårsake lumske (sensu [15]) antiproliferative effekter på plankton og bunn beitedyr
i situ
under naturlige diatomfragmentenes blomstrer slik som de som er rapportert etter [3] og referansene der.
Materiale og metode
celle~~POS=TRUNC kulturer~~POS=HEADCOMP og behandling
A549 (ATCC CCL185) human lunge adenokarsinom og COLO 205 (ATCC CCL-222) colon adenokarsinom metastatisk ascites-utledning cellelinjer ble opprettholdt i DMEM ( Dulbeccos modifiserte Eagles medium) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter ml
-1 penicillin og 100 ug ml
-1 streptomycin. Celler ble inkubert i en 5% CO
2 fuktet kammer ved 37 ° C for vekst. A549 og COLO 205-celler (2 x 10
4 celler vel
-1) ble sådd i en 24-brønners plate og holdt natten over for å festes. Den neste dag ble mediet erstattet med friskt medium med tre konsentrasjoner (2, 5 og 10 uM) for hver av de tre PUAs (dd, OD, og HD, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) ble testet; Cellene ble tillatt å vokse i 24, 48 og 72 timer. Etter inkubering ble supernatanten fjernet og adherente celler ble kontrollert for levedyktighet. A549 celler brukes for protein /RNA-ekstraksjon og cellesyklusanalyse 2 × 10
6 ble sådd i petriskåler (90 mm diameter) og behandles som angitt ovenfor.
I en uavhengig eksperiment, A549 celler (2 x 10
3-celler vel-1) ble sådd i en 96-brønns plate og holdt natten over for å festes. Den neste dag ble mediet erstattet med friskt medium med tre konsentrasjoner (2, 5 og 10 uM) for hver av de tre PUAs (dd, OD, og HD, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) og testet med caspase-3- inhibitor (C
30H
41FN
4O
12, sc-3075, Santa Cruz) på 9,7 mikrometer; Cellene ble tillatt å vokse i 24, 48 og 72 timer. Etter aldehyd behandling ble levedyktige celler bedømt som beskrevet nedenfor. Den BEAS-2B (ATCC CRL-9609) lunge /lunsj normal epitel-cellelinjen ble opprettholdt i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) supplert med 50% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter ml
-1 penicillin og 100 ug ml
-1 streptomycin. Celler ble inkubert i en 5% CO
2 fuktet kammer ved 37 ° C for vekst. BEAS-2B (2 x 10
3-celler vel
-1) ble sådd i en 96-brønns plate og holdt over natten for å festes. Den neste dag ble mediet erstattet med friskt medium med tre konsentrasjoner (2, 5 og 10 uM) for hver av de tre PUAs (dd, OD, og HD, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) ble testet; Cellene ble tillatt å vokse i 24, 48 og 72 timer. Etter inkubering ble supernatanten fjernet og adherente celler ble kontrollert for levedyktighet
Levedyktighets assays
Vi utførte to typer levedyktighet analyser:. MTT og Trypan blå assay. Vi her velger å representere de mest betydningsfulle data som oppnås med den ene eller den annen type test, avhengig av egenskapene til de behandlede celler. Spesielt normale celler (BEAS-2B) som ikke ble berørt av PUAs behandling (og dermed var det ingen døde celler) ble undersøkt med MTT kolo analysen mens A549 og COLO 205 celler ble farget med trypanblått som flekker bare døde celler. Videre A549-celler behandlet med PUAs i nærvær av kaspase-3 inhibitor ble også undersøkt med MTT-analyse for å vurdere inhibisjon av toksisitet.
For Trypan blå, A549 og COLO 205-celler (2 x 10
4 /brønn) ble sådd ut i hver brønn av en 24-brønners plate og holdt over natten for å festes i nærvær av Dulbeccos medium. Den neste dag ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 0, 2, 5 eller 10 uM av DD, OD eller HD. Behandlede celler ble inkubert i 24, 48 og 72 timer. Etter inkubering, ble supernatanten oppsamlet og kastet, mens adherente celler ble behandlet med en 0,4% trypanblått-oppløsning (Hyclone, Lot nr: JRH27098) i henhold til den trypanblått Dye Exclusion analyse [30]. Etter farging ble cellene løsnet med trypsin, sentrifugert, og pelleten ble vasket med fosfatbuffer saltvann (PBS); 10 ul av denne løsning ble plassert i et Burker tellekammer. Blue-celler (som angir døde celler) ble tellet i hvert område, og sammenlignet med kontroller for å beregne% celleviabilitet.
For MTT, ble A549 og BEAS2B-celler sådd i 96-brønns plate (2 x 10
3 celler /brønn) etter behandlingstider, og ble inkubert med 10 ul (10 mg /ml) av MTT (3- [4,5-metyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazoliumbromide, Applichem A2231). Antall levedyktige celler etter aldehyd (DD, OD, HD) behandling ble evaluert ved spektrofotometrisk MTT analyse i henhold til produsentens protokoll og beregnet som forholdet mellom gjennomsnittlig absorbans (λ = 570 nm) av prøven og betyr absorbansen for kontroll og uttrykt som prosent levedyktighet.
akridinorange /etidiumbromid-farging dobbelt test for morfologisk analyse
Kontroll og behandlede adherente A549 celler ble trypsinert og oppsamlet ved sentrifugering ved 500 g i 5 min. Cellene ble vasket 3 x med PBS og ble påvist forandringer i cellemorfologi med akridinorange /etidiumbromidfarging test. Celler ble resuspendert i 25 ul av fargestoff (100 ug ml
-1 av akridinorange og 100 ug ml
-1 etidiumbromid fremstilt i PBS og forsiktig blandet). 10 mL av fargede celler ble plassert på et objektglass, dekket med et dekkglass og undersøkt under et konfokal mikroskop (Zeiss LSM510, laser 488 med LP505 filter for grønn fluorescens, laser 543 med LP 560 filter for rød fluorescens) med 25 × objektiv. Acridinoransje trenger både levende og døde celler som avgir grønn fluorescens når Pilgrim i vanlig dobbelt nukleinsyrer (DNA) og rød fluorescens når bundet med skadede enkelt nukleinsyrer. Etidiumbromid penetrerer bare døde celler med skadet membraner emitting rød fluorescens. Fire celletyper ble identifisert i henhold til [31] på grunnlag av fluorescensemisjon og morfologisk aspekt av kromatin kondensasjon i fargede kjerner: (1) levedyktige celler med ensartet lyse grønne kjerner og en organisert struktur (kontroll); (2) tidlig apoptotiske celler med uregelmessige grønne kjerner med kondensert kromatin og med apoptotiske legemer farget i rødt, (3) sent apoptotiske celler med oransje til rød atomkjerner med svært fragmentert kromatin; (4) jevnt oransje til rødt kjerner med en organisert struktur skyldes nekrotiske celler.
RNA isolering og RT
2 Profiler PCR Arrays
Etter behandling ble A549 cellene vasket i vevskultur tallerken ved å legge kald PBS og rock forsiktig. Cellene ble vasket direkte i en kultur tallerken ved å legge til 1 ml Trizol Reagens (Life Technologies, katten. 10296-010) per 10 cm diameter parabol og skraping med celleskrape. RNA ble isolert i henhold til produsentens protokoll. RNA konsentrasjon og renhet ble vurdert ved hjelp av nanophotomer Nanodrop (Euroclone). RNA (400 ng) ble utsatt for revers transkripsjon reaksjon ved hjelp av RT
2 første strand kit (Qiagen, cat.330401) i henhold til produsentens protokoll.
For å vurdere uttrykket av apoptotiske gener, real- tid kvantitativ revers transkripsjon PCR (QRT-PCR) ble utført ved hjelp av RT
2 Profiler PCR Arrays kit (Qiagen, cat.330231). Eksperimenter ble utført i tre paralleller for A549 cellelinje behandlet med PUAs på 5 mikrometer konsentrasjon i 2 timer eksponeringstid.
Platene ble kjørt på en VIIa 7 (Applied Biosystems 384 vel blokker), Standard Fast PCR Sykling protokollen med 10 ul reaksjonsvolumer. Sykkelforholdene som ble anvendt var – en syklus initiering ved 95,0 ° C i 10 minutter og etterfulgt av amplifikasjon i 40 sykluser ved 95,0 ° C i 15 s og 60,0 ° C i 1 min. Forsterkning data ble samlet inn via VIIa 7 Ruo programvare (Applied Biosystems). CT-verdier ble analysert med PCR tabellens dataanalyse online programvare (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).
Protein utvinning
A549 cellelysat etter behandling, ble fremstillet ved å skrape celler fra hver petriskål inn i 1 ml RIPA-lysebuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1 % SDS) supplert med proteasehemmere (1 mikrometer PMSF og komplett proteasehemmer Cocktail Tabletter, Roche, Monza, Italia) og fosfatase hemmere (PhosSTOP Cocktail Bord, Roche). Lysatet ble inkubert på is i 15 minutter og deretter klaret ved sentrifugering ved 14.000 g i 20 min. Total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved anvendelse av en Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad, Milano, Italia) med bovint serumalbumin (BSA) som en standard. Den proteinekstrakt ble lagret ved – 80 ° C inntil bruk
Elektroforese
Før elektroforese ble proteinprøver inkubert ved 100 ° C i 5 min.. Etter 10% SDS-PAGE, ble geler farget med Coomassie eller blottet på nitrocellulose (Hybond, GE Healthcare) membran. Membranene ble blokkert i 1 time i 1 x Tris-buffret saltvann (TBS), med 0,1% Tween-20 med 5% vekt /volum fettfri tørrmelk, og inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffene fortynnet i 1 x TBS, 0,1% Tween -20 med 5% BSA. Primære antistoffer var fra Død reseptor antistoff Sampler Kit (Cell Signaling Technology, 8356S), inkludert anti-TNFR1 (1:1000), anti-TNFR2 (1:1000), anti-FADD (1:1000), anti-RIP (1 :1000), anti-Fas /Fasl (1:1000). Anti-aktiv Cas-3 (1:1000) kjøpt fra BioVision. Positiv kontroll ble oppnådd ved anvendelse av anti-actin-antistoff (1:500) (Sigma). Aktin ble anvendt som en kontroll for hvert protein analysert. Her viser vi bare et representativt gel for aktin. Etter inkubasjon ble membranene vasket tre ganger i 5 minutter hver med 15 ml TBS /Tween og deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff anti-kanin (1:2000, Cell Signaling Technology) med forsiktig omrøring i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubasjon ble membranene vasket tre ganger i 5 minutter hver med 15 ml TBS /Tween. Utslettet membraner ble immunpåvist hjelp ECL Prime western blotting deteksjonsreagensen (GE Healthcare). Proteinene ble visualisert med Amersham Hyperfilm (GE Healthcare). Densitometrisk analyse av immunopositive båndene ble utført ved hjelp av Image J programvare.
cellesyklusanalyse
A549-celler ble samlet fra platene ved hjelp av 1 ml Trypsin-EDTA (Lonza, Italia), fiksert i 70% etanol og lagret ved -20 ° C. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS, resuspendert i PBS inneholdende 1 mg ml
-1 RNase A (Qiagen, Cat.19101), inkubert ved 37 ° C i 45 minutter og deretter farget med propidiumjodid (PI, 10 ug ml
-1) i 15 min. DNA fordelingen inne i cellene ble deretter beregnet ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Prosentandelen av celler i de ulike fasene av cellesyklus ble beregnet ved hjelp ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, USA).
Statistisk analyse
statistiske forskjeller mellom behandlede og kontrollceller for celleviabilitet tellinger ble bestemt av enveis ANOVA og Dunn multiple sammenligningstest med betydelige p-verdier ≤ 0,05 hjelp GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego California USA).
genuttrykk data ble analysert ved PCR rekke data analyse online programvare (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen). Histogrammene viser relative uttrykk forhold av de analyserte genene i forhold til kontroller uten PUAs. Eneste uttrykk verdier større enn en 1,55 gangers forskjell i forhold til kontrollene ble betraktet som signifikant.
Immunoblotting proteinekspresjon ble beregnet som prosentandelen av integralet område av hver enkelt gel bånd med hensyn til totalt gel kjørefelt område, representert som piksler. Statistiske forskjeller mellom behandlet og kontroller ble bestemt av T-student analyse med betydelige p-verdier ≤ 0,05. Data signifikant forskjellig fra kontroller, med p-verdier. 0,001 er merket med 2 stjerne i tallene
Resultater
Livskraftig av A549 og COLO 205 kreftcellelinjer, og normal BEAS-2B celle linje etter behandling med PUA decadienal (DD)
Som vist i fig. 1A-1B, behandling av A549 og COLO 205-celler med 2, 5 eller 10 mM av DD resulterte i en signifikant dose- og tidsavhengig reduksjon i celleviabilitet sammenlignet med kontroller (p 0,05). Etter 24 timer ble en reduksjon i prosentandel av levedyktige A549 celler observert ved alle doser som ble testet (70%, 50% og 18% levedyktige celler på 2, 5 og 10 uM DD konsentrasjoner, henholdsvis). Lignende resultater ble oppnådd med COLO 205-celler (80%, 44% og 26% levedyktige celler på 2, 5 og 10 uM DD konsentrasjoner, henholdsvis). Etter 48 timers behandling, ble en ytterligere reduksjon observert, spesielt ved høyere DD konsentrasjoner på 5 og 10 uM for A549-celler; COLO 205 levedyktigheten reduseres langsommere (67%, 43% og 23% levedyktige celler på 2, 5 og 10 uM DD konsentrasjoner, henholdsvis). Ved 10 uM A549-celler viste åpenbare morfologiske endringer, for eksempel tap av kontakt tilslutning med andre celler, så vel som med platen substratet. Etter 72 timer, nedsatt A549 celleviabilitet til 0% med 5 og 10 mm DD og 26% med 2 mikrometer DD; COLO-205 cellelevedyktigheten var 30%, 21% og 13% med 2, 5 og 10 uM DD hhv.
(D) Virkning av DD på A549-cellelinje i nærvær av kaspase-3 inhibitor ( 9,7 mm). Andel av levedyktige celler for A549 og COLO 205 kalkulert med trypanblått levedyktighet analysen og for BEAS-2B med MTT levedyktighet analysen. Verdiene er angitt som middelverdi ± S.D sammenlignet med kontroller (100% levedyktighet); ▴ 2 mikrometer; ▪ fem mikrometer, ♦ 10 mikrometer.
Behandling av BEAS-2B celler med 2, 5 eller 10 mm av DD ikke redusere celleviabilitet sammenlignet med kontroller (Fig. 1C). Etter å ha redusert 24 timer DD behandling BEAS-2B cellenes levedyktighet svakt (74%, 65% og 85% levedyktige celler på 2, 5 og 10 uM DD konsentrasjoner, henholdsvis), men etter 48 og 72 timer celleviabilitet utvunnet og var sammenlignbare med kontroll , noe som indikerer milde toksiske effekter etter bare 24 timer. Til slutt, for å bedømme den spesifikke cytotoksiske effekten registrert for A549-cellelinjen, ble MTT-assayet eksperiment utføres i nærvær av et caspase-3-inhibitor for alle aldehyd behandlinger. Figur 1D viser at prosentandelen av cellenes levedyktighet er sammenlignbare med celler behandlet med PUAs uten inhibitor ved 2 uM; 5 og 10 uM det er en langsommere reduksjon i celleviabilitet, sammenlignet med behandling uten kaspase-3 inhibitor etter 48 h (Fig.1A), men etter 72 timer, de samme konsentrasjoner induserte en økning i celle-død.
levedyktigheten til A549 og COLO 205-cancercellelinjer og normal BEAS-2B-cellelinjen etter behandling med PUA octadienal (OD)
behandling av A549-celler med 2, 5 eller 10 mM av OD hemmet celleproliferasjon med tiden, spesielt ved høyere konsentrasjoner (10 uM) når cellenes levedyktighet ble redusert til 35% etter (2A fig.) 72 timer. Ved 2 uM konsentrasjoner, effekten på cellelevedyktigheten etter 24 timer var ikke signifikant forskjellig i forhold til kontroller, men ble så etter 72 timer (p 0,05). Mens COLO 205 cellenes levedyktighet etter 24 timer ikke reduseres signifikant (fig. 2B), ble cytotoksiske effekter sterkere etter 72 timer for alle de tre OD konsentrasjoner (60%, 60% og 41% levedyktige celler på 2, 5 og 10 uM OD konsentrasjoner henholdsvis, p. 0,05)
(D) Virkning av OD på A549-cellelinje i nærvær av kaspase-3 inhibitor (9,7 uM). Andel av levedyktige celler for A549 og COLO 205 kalkulert med trypanblått levedyktighet analysen og for BEAS-2B med MTT levedyktighet analysen. Verdiene er angitt som middelverdi ± S.D sammenlignet med kontroller (100% levedyktighet); ▴ 2 mikrometer; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.
Behandling av BEAS-2B-celler med 2 og 5 uM av OD ikke i betydelig grad redusere cellenes levedyktighet sammenlignet med kontroller etter 24, 48 og 72 timer (fig. 2C ), mens ved 10 uM OD, redusert BEAS-2B cellenes levedyktighet svakt etter 72 timer (75% levedyktige celler). Behandling av A549-celler med OD i nærvær av kaspase-3 inhibitor resulterte ikke i signifikante forskjeller i prosent cellenes levedyktighet (fig. 2D).
levedyktigheten av A549 og COLO 205 cancercellelinjer og normal BEAS-2B cellelinje etter behandling med PUA heptadienal (HD)
Som vist i fig. 3A, har behandling med 2, 5 og 10 uM av HD på A549-celler svakt inhiberte celleproliferasjon etter 24 timer, men virkningen var fremdeles signifikant forskjellig i forhold til kontrollene (p 0,05). Virkningen var mer tydelig med tiden. Spesielt, på 10 uM bare 10% av cellene var levedyktige etter 48 timer og 0% etter 72 timer. HD-behandling på COLO 205 celler også forårsaket en reduksjon i celle levedyktighet, men effekten var ikke så sterk som med A549 celler. Etter 48 og 72 timer (fig. 3B), ble en signifikant toksisk effekt observert ved konsentrasjoner HD høy (40% og 28% cellelevedyktigheten ved 10 uM HD).
(D) Virkning av HD på A549 celle linje i nærvær av kaspase-3 inhibitor (9,7 uM). Andel av levedyktige celler for A549 og COLO 205 kalkulert med trypanblått levedyktighet analysen og for BEAS-2B med MTT levedyktighet analysen. Verdiene er angitt som middelverdi ± S.D sammenlignet med kontroller (100% levedyktighet); ▴ 2 mikrometer; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.
Som i tilfellet med DD og OD, behandling av BEAS-2B-celler med HD-induserte ikke toksisitet (Fig. 3C). Behandling av A549 celler med HD i nærvær av kaspase-3 inhibitor ikke resulterte i forskjeller i prosent av levedyktige celler ved høyere konsentrasjoner HD (5 og 10 uM) (Fig. 3D). På to mikrometer, var det en betydelig økning i celle dødelighet i nærvær av caspase-3 Inhibitor etter 72 h (Fig.3D).
Morfologiske effekter av diatomeen PUAs DD, OD og HD på A549 cellelinje
å observere morfologiske endringer i celler behandlet med DD, OD og HD, og for å verifisere om redusert levedyktighet etter behandling ble korrelert med apoptoseinduksjon, doble vi fargede celler med fluorescerende fargestoffer for nukleinsyrer, acridinoransje (AO) og etidiumbromid (EO) etter 48 timers behandling. Levedyktige celler ble identifisert av lyse grønne kjerner i intakte celler (AO). Tidlig apoptotiske celler ble identifisert ved uregelmessig strukturerte grønne atomkjerner med kondensert kromatin og oransje eller lyserøde flekker. Sene apoptotiske celler inneholdt positivt farget atomkjerner med begge fargestoffer (EB og AO), vises oransje eller lys rød sammen med apoptotiske legemer. Kjerner av nekrotiske celler hadde intakt kromatin og dukket rødt. Alle kontroll kjerner dukket grønn med en vanlig sfærisk struktur og kromatin organisasjon med unntak av noen få senescent celler i en nekrotisk scene som viste rødt fluorescerende kjerner (Fig. 4A). Ved 10 uM DD, alle celler var i sent stadium apoptose og ble karakterisert ved gul-orange dobbel farging (AO /EB) på grunn av kromatin kondensering og tap av membranintegritet (Fig. 4B). Ved 10 uM OD, celleskade var mindre tydelig med tydelige forandringer i morfologi og nærvær av rød farging i noen celler, noe som indikerer progresjon i celle apoptose (pilene i fig. 4C). Ved 10 mikrometer HD, ble cellemorfologi vesentlig endret med spredt kromatin i kjernen som dukket forstørret. Kjennetegn på slutten av apoptose som kjernekraft fragmentering var også synlige (pilene i fig. 4D).
Kontroll og behandlede celler dobbel farget med acridinoransje og etidiumbromid etter 48 mikrometer DD, OD og HD observert ved konfokal mikroskop . Tallene angir (1) normale celler; (2) tidlig apoptotiske celler; (3) sent apoptotiske celler; (4) nekrotiske celler (se materiale og metoder for detaljer). Pilene viser celler med fragmenterte kjerner.
Immunoblot analyser av dødsreseptorer (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) og effektorer (caspase-3) på A549 cellelinje behandlet med PUAs (DD, OD og HD )
etter 24 timers behandling, DD induserte en doseavhengig økning i ekspresjonen av tumornekrosefaktor reseptor 2 (TNFR2) spesielt ved 5 og 10 uM, sammenlignet med kontroller, slik det er åpenbart ved densitometrisk analyse av fotografiske ark (fig. 5A) for immunoblotting membranen. Tvert imot, ble TNF-reseptor-assosiert faktorer (TRAF1 og TRAF2) ikke aktivert indikerer fravær av en overlevelsesreaksjonsveien. Videre DD indusert aktivering av TNFR1 i celler behandlet med 5 og 10 uM konsentrasjoner (Fig. 5A). Nedstrøms Fas-assosiert protein med døden Domain (FADD) ble også sterkt aktivert på 10 mikrometer konsentrasjoner, mens nivåene av Receptor-samspill Protein (RIP) sunket dramatisk på alle tre DD konsentrasjoner (Fig. 5A). Reduksjon i ekspresjonen av RIP betyr en tidlig død signalveien som indikert ved fravær av kort proteiner som Tumor nekrose faktor reseptor type 1-Associated død domene protein (Tradd) eller TNF-reseptor Associated faktorer TRAF1 og TRAF2 (data ikke vist). DD også aktivert kaspase-3 bekrefter celledød via apoptose etter (5A Fig.) 24 timer. Andre dødsreseptorer innblandet i ytre apoptotiske sti (Fas, DR3, DR4, DR5) samt noen faktorer aktivert i indre apoptotiske baner (akt1, akt2, PARP, Apaf1) ble ikke involvert i cellen respons til DD (data ikke vist ).
Immunanalysen analysen~~POS=HEADCOMP viser at PUAs indusere TNF signale etter 24 (DD og HD) og 48 timer (OD) av behandling med aktin. Stjernen angir signifikant økning i proteinnivået måles. ** P≤0.05 versus kontroll; feilfelt representerer ± SD.
Det samme bane ble observert etter OD behandling, men først etter 48 timer. TNFR2 uttrykk noe øket sammenlignet med kontroller, men forskjellen var ikke signifikant. TNFR1 og FADD viste en betydelig reaksjon ved de høyeste konsentrasjoner (5 og 10 uM) (Fig. 5B). I motsetning til DD, OD-behandlede celler viste en sterk og vedvarende ekspresjon av RIP, noe som indikerer en sameksistens av en overlevelse og død aliserte responsen (Fig. 5B). Caspase-3 ble også aktivert som med DD (Fig. 5B).
HD ikke signifikant øke uttrykket av TNFR2 (Fig. 5C) og ikke utløse noen reaksjon i TNFR1 etter 24 timer og 48 timer. Etter 24 timer HD sterkt øket ekspresjonen av Fas-reseptor (Fas /Fasl-Ligand-systemet) i en doseavhengig måte. Maksimal effekt av HD på Fas ble observert ved 5 og 10 uM konsentrasjoner (fig. 5C). HD også økt ekspresjon FADD og aktivert caspase-3 (fig. 5C). I motsetning til dette nivå av RIP sunket dramatisk etter (5C Fig.) 24 timer. Videre Apaf1 ble ikke avslørt etter HD-behandling på 24 og 48 h (data ikke vist).
Expression analyse av gener som koder for dødsreseptorer (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) og effektorer (caspase-3, AIFM1) på A549 cellelinje behandlet med PUAs (DD, OD og HD)
for å bedre forstå de toksiske effekter på molekylnivå, ble A549 celler analysert etter to timer av PUAs behandling fordi alle proteiner for DD og HD ble allerede uttrykt og aktiveres etter 24 timer. Vi valgte å bruke fem mikrometer konsentrasjon siden ved høyere konsentrasjoner effektene var for alvorlige.
Kontroll gener for sanntids qPCR var Actin-beta (ACTB), Beta-2-mikroglobulin (B2M), hypoxantin phosphoribosyltransferase (HPRT1
