Abstract
Nyere bevis tyder på at noen solide tumorer, inkludert kreft i eggstokkene, inneholder distinkte populasjoner av stamceller som er ansvarlig for startfasen, vekst, cellegift-motstand, og gjentakelse. The Hippo veien har vakt betydelig oppmerksomhet og noen forskere har fokusert på YAP funksjoner for å opprettholde stemness og celledifferensiering. I denne studien har vi lyktes i å isolere de eggstokkreft initiere celler (OCICs) og demonstrert YAP fremmet selvfornyelse av eggstokkreft initiert celle (OCIC) gjennom sin nedstrøms co-aktivator TEAD. YAP og TEAD familier var nødvendig for å opprettholde uttrykket av spesifikke gener som kan være involvert i OCICs «stemness og chemoresistance. Til sammen våre data først indikerer at YAP /TEAD co-aktivator regulert eggstokkreft initiert celle pluripotency og cellegift-motstand. Det foreslås en ny mekanisme på legemiddelresistens i kreftstamcelle at Hippo-YAP signalveien kan tjene som terapeutiske mål for eggstokkreft behandling i klinisk
Citation. Xia Y, Zhang YL, Yu C, Chang T Fan HY (2014) YAP /TEAD Co-Activator regulert pluripotency og Chemoresistance i eggstokkreft initierte celler. PLoS ONE 9 (11): e109575. doi: 10,1371 /journal.pone.0109575
Redaktør: Hong Wanjin, Institutt for molekylær og cellebiologi, Biopolis, USA
mottatt: 21 juni 2014; Godkjent: 01.09.2014; Publisert: 04.11.2014
Copyright: © 2014 Xia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81172473, 31371449), National Basic Research Program of China (2011CB944504, 2012CB944403 ), og grunnforskning Finansiering av Zhejiang University (2011QN81001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige av gynekologiske kreftformer, hovedsakelig på grunn av mangel på tidlig deteksjon, noe som resulterer i de fleste pasienter blir diagnostisert på et avansert stadium av sykdommen [1], [2]. Mekanismene bak kreftlegemiddelresistens og tilbakefall er fortsatt usikker. Nyere bevis tyder på at noen solide tumorer, inkludert kreft i eggstokkene, inneholder distinkte populasjoner av stamceller som er ansvarlig for startfasen, vekst, cellegift-motstand, og tilbakefall [3] – [6]. Det er noen mente at kjemoterapeutisk motstand ved eggstokkreft er først og fremst på grunn av eksistensen av små bestander av kreft stamceller (cscs).
Noen studier har rapportert at cscs organisert forankringsuavhengige, autonome, sfæriske strukturer [7] . Lignende strukturer ble observert i eggstokkene kreftpasient ascitesceller, som inkluderte en liten undergruppe av tumorfremmende celler som var i stand til å organisere inn i kulene. Det er kjent at høye ekspresjonsnivåer av stilk celle markører, så som OKT-4, SOX-2, Nanog, og Notch-1, kan påvises i cscs [8]. Noen celleoverflatemarkører er også sterkt uttrykt ved cscs, inkludert CD44, CD117, CD133 og [9], [10]. Det er godt akseptert at kreftceller med høy CD44 og CD117 uttrykk blir svært tumorgene og kan gjenopprette den opprinnelige tumor hierarki [11].
A stamcelle basseng som inkluderer kreft stamceller er også strengt regulert av signalveier fra mikro-miljøet i stamcelle nisje. Blant disse har Hippo pathway stor oppmerksomhet, og noen etterforskere har fokusert på YAP funksjoner for å opprettholde stemness og celledifferensiering [12], [13]. Ektopisk YAP uttrykk hindrer ES celledifferensiering
in vitro Hotell og opprettholder stamcelle fenotype [14], [15]. Men til dags dato, TEAD familiemedlemmer, som er YAP nedstrøms co-aktivatorer, har ikke blitt grundig undersøkt i kreftstamceller.
Nyere studier viser at samspill mellom flere veier, inkludert the Hedgehog [16], wnt [17] – [19], MAPK [20], PI3K [21], og Hippo trasé [22] – [24], var involvert i stamcelle pluripotency og regulere kreftutvikling. Knockdown av Hippo pathway kjernekomponentene påvirket vev homeostase i flatworm
Macrostomum Lignano Hotell og forårsaket hyper-spredning av stamceller [12]. LATS2, en tumor suppressor kinase av Hippo vei, undertrykker post-transcriptionally human celle omprogrammering [25]. YAP er funksjonelt viktig for tumor undertrykkende virkninger på LKB1, en oppstrøms kreft suppressor i MAPK-reaksjonsveien [26].
I denne studien vi med hell isolerte stamcellebobler fra mus tumorxenografter som ble avledet fra humant ovarie kreftceller. Disse kule dannende celler var svært tumorigent og kan serielt forplante med sine opprinnelige kreft fenotyper. Basert på denne forbedrede, reproduserbar tumorigenitet, utpekte vi disse kule dannende celler eggstokkreft initiere celler (OCICs), i samsvar med tidligere akseptert terminologi. Denne sub-populasjon av kreftceller også hadde forbedret OCICs «stemness og narkotika motstand gjennom YAP /TEAD regulerer spesifikke gener uttrykk. Disse resultatene støttes nyere observasjoner, inkludert vår egen, som YAP-TEADs bestemt eggstokkreft malignitet nivåer og gitt ekstra mekanistiske innsikt om rollene til YAP og TEADs i eggstokkreft.
Materialer og metoder
eggstokkreft initiere celle (OCIC) isolasjon og kultur
for å få OCICs, vi subkutant injisert celler av eggstokkreft cellelinjen A2780 inn hårløse mus (2 × 10
6 celler per mus). Etter en svulst diameter nådde ca 1,5 cm (vanligvis fire uker etter injeksjon), fjernet vi svulstvev, skjær den i små biter, og fordøyd det med kollagenase å forberede enkeltcellesuspensjoner. Da de innsamlede enkeltceller ble dyrket i serumfritt DMEM-F12 (Invitrogen) supplert med 5 ug /ml insulin (Sigma), 20 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF; Invitrogen), 10 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (b-FGF; Invitrogen), og 0,4% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) i Ultra-Low festeplater (Corning). OCICs og kontrollcellene ble tatt separeres fra andre celler ved hjelp av kontinuerlige densitetsgradient sentrifugering. Kontrollcellene ble også oppnådd ved injisering av A2780-celler i nakne mus, og separasjonsmetoder var de samme som de som brukes for OCICs. De ble dyrket i Ultra-Low festeplater (Corning) og mediet var lik med OCICs, bortsett fra at kulturmediet som er inkludert 10% føtalt bovint serum (FBS). Alle medier inkludert penicillin (10 enheter /ml) og streptomycin (10 ng /ml) og cellene ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2. Medium ble endret etter 3 dager.
Nude mus xenograft modell
Mus ble behandlet i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, godkjent av etisk komité av Zhejiang University. Mus ble plassert i et temperaturkontrollert rom med riktig mørke-lys sykluser, matet med et vanlig kosthold, og vedlikeholdes under omsorg av Forsøksdyravdelingen, Zhejiang University, Kina. Eggstokkreft celle-transplanterte nakne mus ble injisert 2 × 10
6 celler og undersøkt daglig i ca tre uker. Etter at svulsten diameter nådde til 1,5 cm, ble musene avlivet ved hjelp av CO
2 inhalering metode før den ble avlivet. For å vurdere OCIC tumorgene evne
in vivo
, sfæroider ble tellet, resuspendert i 100 ul PBS, og deretter injisert subkutant inn i de venstre kantene av 4 ukers gamle hunn nakne mus. Cellekonsentrasjonene som ble anvendt varierte fra 10
4 til 10
5 i OCIC og kontrollgruppene og ble musene delt i to grupper og fire mus i hver undergruppe. Fra en uke etter injeksjon, ble innpodet musene observert daglig for tumormasser og volum. En mus ble humant avlivet når tumor en diameter nådde 1,5 cm. Xenografttumorer ble dissekert ut, fiksert i 4% paraformaldehyde, i parafin, og delt med en Leica rotasjonsmikrotom (5 mikrometer tykkelse). Snittene ble anvendt for H . E farging, immunhistokjemi og histologiske vurderinger
Immunofluorescence farving
OCIC sfæroider ble høstet og plassert på objektglass, fiksert i paraformaldehyd (4 ° C, 30 min) , permeabilisert med PBS som inneholdt 0,3% Triton X-100 (PBST), og inkubert med blokkeringsbuffer (PBST inneholdende 5% bovint serumalbumin). Spheroids ble sekvensielt undersøkt med de primære antistoffer og Alexa Fluor 594- eller 488-konjugerte sekundære antistoffer (molekylære prober). Lysbilder ble montert ved hjelp Vectashield med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, Vector Laboratories). Digitale bilder ble ervervet ved hjelp av en epifluorescence mikroskop (Nikon Eclipse 80i) med 4-100X mål.
Immunohistochemistry
tumorxenotransplantater ble løst over natten i 10% PBS bufret 4% paraformaldehyde, og deretter innebygd i parafin. Snitt ble kuttet med en mikrotom Leica RM2235 på 5 um tykkelse og farget med de angitte primære antistoffer for immunohistokjemi ved hjelp av en vektor ABC kit (Vector Laboratories). Kort fortalt delene ble deparaffinized, utvannet, og inkubert i 0,3% H
2o
2. Etter antigen gjenfinning anvendelse av 10 mM natriumcitrat (pH 6,0) ble snittene inkubert i normalt geiteserum. Disse prøver ble deretter probet med primære antistoffer. Etter vasking med PBS som inneholdt 0,05% Tween-20 (PBS-T), ble prøver inkubert med et sekundært antistoff og vasket igjen med PBS-T før inkubasjon med ABC-løsning. Color ble utviklet med diaminobenzidine (DAB) substrat (DAB Underlag Kit, Vector Laboratories). Snittene ble vasket, kontra, dehydrert, og montert med Vectamount permanent monteringsmedium (Vector Laboratories). Snittene ble observert under et Nikon Eclipse 80i mikroskop (Nikon Corporation). Den negative kontrollen ble erstattet den primære antistoff med PBS inkubasjon.
Lentiviral shRNA infeksjon og klone-analysen
Lentivirus som kodet for
Yap Hotell og
Tead1 /3 /4
korte hårnål RNA (shRNAs) eller utenfor målgruppen oligonukleotider som en kontroll var fra GenePharma (Shanghai, Kina). Short interfering RNA for
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
valgt fra ulike målgrupper sekvensene ble satt inn i LV-3 /GFP + Puro vektorer. Celler i kuler ble infisert med
Yap Hotell og /eller
Tead1 /3/4
shRNA lentivirus i 48 timer.
Yap
-spesifikke shRNAs var: 5′-CCCAGTTAAATGTTCACCAAT-3 «(shYAP # 1) og 5′-GCCACCAAGCTAGATAAAGAA-3» (shYAP # 2). To shRNAs ble brukt til å målrette
Tead1
,
Tead3
, og
Tead4
sammen: 5′-ATGATCAACTTCATCCACAAG-3 «og 5′-GATCAACTTCATCCACAAGCT-3». Interferens effektivitet ble verifisert ved hjelp av RT-PCR og Western blotting. Lentivirus infisert OCICs ble sådd ut i triplikat i 12-brønners plater (1.000 celler /brønn) i 14 dager. Medium ble byttet hver 48. time og synlige kolonier ble tellet ved lysmikroskopi.
sfæroide differensieringsvurderingene
Cell sfærer ble dyrket under standardbetingelser differensierende (DMEM /F12 supplert med 10% FBS) og i Ultra Low festeplater (Corning). Etter 14 dager i kultur, ble cellemorfologi vurdert ved hjelp av en Zeiss Axiovert 40 invertert mikroskop med Axio-Vision programvare. Celleoverflatemarkører CD44 (og CD117) ble påvist ved immunfluorescens farging. En epitel differensiering markør, Cytokeratin-7 (CK-7), og ovariecancer antigen-125 (CA 125) ble anvendt for immunofluorescens farging, etterfulgt av inkubasjon med et FITC-merket geit anti-mus eller anti-kanin-IgG. Kjerner ble kontra med 4, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, Santa Cruz).
Kjemoterapi agenten følsomhetsanalyser
Cell kulene ble dissosiert og sådd på 4000 celler /brønn i 96- vel Ultra Low Attachment plate (Corning) og dyrket med serumfritt DMEM /F12 supplert med vekstfaktorer. OCICs og kontrollere eggstokkreft celler ble behandlet med cisplatin (20 til 60 pM), taxol (2 til 20 uM), eller bleomycin (20 uM to100 uM) i 48 timer. Etter dyrking i 48 timer ble cellelevedyktigheten vurdert ved anvendelse av en celletelling kit-8 (Dojndo, Japan), i henhold til produsentens instruksjoner. Celle overlevelse ble definert som prosentandelen av overlevende medikamentbehandlede celler dividert med ubehandlede kontrollceller. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Kvantitativ PCR microarray analyse og real-time RT-PCR
Menneskelig Cancer Drug Resistance RT
2 Profiler PCR array (Qiagen # 330231) ble brukt til å bestemme uttrykket profiler av 84 gener som er involvert i kjemoterapi regulering. Primere for 84 test gener og 5 housekeeping gener (
B2M
,
Hprt1
,
Rpl13a
,
GAPDH
, og
ACTB
) ble inkludert på hver 96-brønns plate. En First Strand (Qiagen # 330401) og SYBR Grønn qPCR Mastermix (Qiagen # 330500) var fra SABiosciences. qPCR ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (SABiosciences RT
2 Profiler PCR Array System) ved hjelp av en Bio-Rad CFX96TM Real-Time PCR-enhet. Dataanalyse ble gjort ved hjelp av den elektroniske SABiosciences PCR Array dataanalyse, som beskrevet i produsentens protokoll.
spheroid celler, differensierte sfæroide celler eller primære tumorceller ble plassert i RNAase-frie mikrorør. Total RNA ekstraksjon og revers transkripsjon ble gjort med RNAiso Plus og en Reverse Transcription Mix kit (Takala), i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (0,5 pg) ble reversert transkribert ved anvendelse av en cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Real-time PCR reaksjoner ble drevet ved hjelp av en CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Hver cDNA-prøve ble testet i tre eksemplarer. For å kvantifisere genuttrykk endringer ble △△ Ct metoden som brukes til å beregne relative fold-endringer etter normalisering til
ACTB
(β-aktin) mRNA nivåer. De gen-spesifikke RT-PCR-primer sekvenser er vist i tabell S1.
proteinekstraksjon og Western blotting-analyse
Celler ble lysert med cellelyseringsbuffer (Beyotime), som omfattet et passende volum av en proteasehemmer cocktail (Roche). Totale proteiner ble separert ved SDS-PAGE og deretter overført til polyvinylidenfluorid membran (Milipore, USA). Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 5% skummet melk i TBST ved romtemperatur i 1 time. Etter sondering med primære antistoffer, ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase-koblede anti-kanin antistoffer (cellesignalisering Technologies, Danvers, MA) og deretter vasket. Bundet antistoff ble visualisert ved hjelp av en utvidet Chemiluminescence Detection Kit (Amersham). De primære antistoffer var: anti-YAP, anti-oktober-4, anti-Notch-en, anti-aktin, som alle var fra Cell Signaling Technology. En anti-TEAD1 (1:1000; 5178-1) antistoff var fra Epitomics. Anti-TEAD2 (1:1000, LS-C119063) og anti-TEAD3 (1:1000, LS-C30406) antistoffer var fra levetid biovitenskap. Anti-TEAD4 (1:1000; ab97460) antistoff var fra Abcam. Proteiner ble gjort synlige ved hjelp av en Dura Super Signal Substrat (Millipore, USA).
Statistisk analyse
Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. GraphPad Prism programvare (GraphPad Prism, San Diego, CA) ble brukt til å sammenligne gruppe resultatene etter khikvadrattester eller ANOVA, etter behov. Forskjeller ble betraktet som signifikant for p. 0,05
Resultater
eggstokkreft initiert sfærer har kreft stamcelleegenskaper
Primær eggstokkreft celler ble dissosiert og plassert i ubestrøket kulturflasker i serumfritt medium supplert med EGF, b-FGF, insulin, og BSA. Etter en uke i kultur, ble ikke-adhererende sfæriske klynger av celler observert på bunnen av disse kolber. På en måned senere, ble kulene med økte størrelser klart observert (Fig. 1a). Vanligvis 5 x 10
6~1 x 10
7 spaltet xenograft-cellene ble satt i kultur, og ca. 2-4% av dem ble omdannet til OCICs under serum fratatt betingelser. Real-time RT-PCR og Western blotting Resultatene viste at stamcellemarkører OCT-4, SOX-2, nestin, Notch-en, og Nanog var alle sterkt uttrykt av disse cellene i kuler (Fig. 1B).
A: Bilder av ikke-heftende sfæriske cellegrupper som stammer fra dyrkede primære eggstokkreft celler. Skala barer = 100 mikrometer. B: Western blotting og real-time RT-PCR resultater som viser økt uttrykk av de angitte gener i OCICs. Relative mRNA-nivåer ble bestemt ved å normalisere til endogene p-aktin mRNA-nivåer (brukt som en intern kontroll) ved bruk av Microsoft Excel. For hver indikert gen, ble det relative nivået av transkripsjonen kontrollprøven (til venstre stolpe av hvert diagram) settes til 1. De relative transkripsjonsnivåer av andre prøver ble sammenlignet med kontrollen, og fold-forandringer er vist i diagrammet. C-D: Representative immunfluorescens fargings resultater for CA125, CK7, CD44, og CD117 uttrykk i udifferensierte og differensierte OCICs. Kjerner ble farget med DAPI. Scale bar = 100 mikrometer for alle panelene.
Deretter undersøkte vi om disse kule cellene hadde forankringsuavhengig selvfornyelse. Vi dyrket kuler i 14 dager under differensierende forhold (vekstfaktorer trukket tilbake og mellom som inneholdt 10% FBS). De sfæroide cellene endret fra flytelegemer til adherente celler ervervet en epitelial morfologi, og det dannet seg CA125 og CK-7-positive kolonier symmetrisk (fig. 1C). (CA125 og CK-7 er godt etablert celleoverflatemarkører for differensierte ovarialcancer celler). I tillegg ble de tidligere rapporterte celleoverflatemarkører i ovarier epiteliale stamceller, CD44 og CD117, uttrykt ved mye høyere nivåer i sfære celler enn i differensierte flate celler (Fig.1D).
Sphere-forming celler er sterkt tumorigent
Vi undersøkte om disse identifiserte kule dannende celler var så sterkt tumorigent som andre rapporterte epitel kreft initierende celler. Sammenlignbare tall av sfæriske celler og kontrollceller ble injisert subkutant inn i flankene til nakne mus. Etter to uker senere, ble tumorer funnet i tre av fire atymiske nakne mus som var blitt injisert med 10
4 sfære celler. Imidlertid tumorer ble ikke funnet i mus som var blitt injisert med differensierte ovarietumorceller, selv ved 10
5 celler pr innpoding (fig. 2A). Cellekonsentrasjon er vist i fig. 2A er 10
4 per mus og andre konsentrasjoner resultatene har ikke blitt vist
A:. Bilder av nakne mus viser xenograft eggstokkreft svulstdannelse etter injisering OCIC kuler. Celle konsentrasjoner brukt 10
4 i hver gruppe. B: H E fargingsresultater som viser histologi av tumorer avledet fra subkutant transplantert OCIC kuler. C: Representant IHC resultater for CA125 og YAP uttrykk i menneskelige xenografttumorer avledet fra OCICs. Spesifikt protein ekspresjon er indikert med brun farge og kjerner (blå) ble motfarget med DAPI. D: Representant IHC resultater for uttrykket av pluripotency markører OCT4, SOX2 og Nanog i xenograft ovarietumorer avledet fra OCIC kuler. E: Representant IHC resultater for fosforylert AKT og pMAPK (ERK1 /2) uttrykk i xenografttumorer avledet fra OCICs. Målestokk = 200 uM for be paneler
H .. E fargings Resultatene viste at svulster avledet fra de injiserte kule-dannende celler hadde et histologisk ligner på A2780 celle injisert tumorer (Fig 2B ). Disse tumorvev uttrykte høye nivåer av YAP og var positive for CA-125, en eggstokkene adenokarsinom markør (Fig. 2C). Disse resultatene viste at kule-dannende celler vi hadde identifisert var svært tumorgene og ikke kunne forplante serielt til sin opprinnelige tumor fenotype. Basert på denne forbedrede, reproduserbar tumorigenitet, utpekte vi disse kule dannende celler eggstokkreft initiere celler (OCICs), i samsvar med tidligere akseptert terminologi. I tillegg har vi også oppdaget stamcellemarkører (OCT4, SOX2, og Nanog) uttrykk og AKT /MAPK fosforylering nivåer i disse tumorvev med annen celle opprinnelse (Fig. 2D-E). Resultatene viste også at disse genene har en høyere uttrykk nivåer enn i kontrollene.
YAP og TEAD er nødvendig for å opprettholde OCIC pluripotency
En tidligere rapport viste at YAP var involvert i iPS celle vedlikehold henhold udifferensiert betingelser [14]. Dermed postulerte vi at YAP kan også opprettholde eggstokkreft stamcelle pluripotency. YAP og TEAD familiemedlemmer, bortsett TEAD2, ble alle uttrykt ved betydelig høyere nivåer av OCICs enn ved differensierte eggstokkreft celler (Fig. 3A-C). I tillegg mRNA nivåer av kjente YAP /TEAD målgener, inkludert
Runx2
,
Itgb2
, og
ErbB4
, ble alle betydelig økt i OCIC celler, noe som tyder på at YAP /TEAD aktiviteten var høy i disse cellene (fig. 3D). Disse resultatene var i samsvar med de i en tidligere rapport [27]
AC. Real-time RT-PCR (A), immunfluorescens farging (B), og Western blotting (C) resultater for YAP og TEAD1- 4 uttrykk nivåer i grunnskolen eggstokkreft celler (kontroll) og OCICs. Kjerner ble farget med DAPI. D: Real-time RT-PCR resultater for mRNA nivåer av kjente YAP /TEAD målgener, inkludert
Runx2
,
Itgb2
, og
ErbB4
, i primær eggstokkkreft celler (kontroll) og OCIC celler. EF. Real-time RT-PCR resultatene for de RNAi utarming effektiviteten av YAP, TEAD1, TEAD3, og TEAD4, etter å ha brukt to forskjellige shRNAs for hvert gen
For å undersøke om YAP og TEAD familiemedlemmer var involvert i å opprettholde OCIC pluripotency, vi banket ned
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
uttrykk i OCICs ved hjelp shRNAs. RT-PCR resultater bekreftet knock-down effektiviteten av den indikerte shRNAs (Fig. 3E-F). Immunofluorescence flekker Resultatene viste at oktober-4 uttrykk var svakere i shYAP og shTEAD behandlet OCICs enn i kontrollceller (fig. 4A). I tillegg til OKT-4, ble andre stamcellemarkører «uttrykk også redusert, som bestemt ved RT-PCR og Western blotting (fig. 4B-C). I en clony formasjon analysen, når kule dannende celler ble behandlet med
Yap
shRNA, kulene var mindre (fig. 4D). Lignende morfologiske endringer ble også observert for sh
Tead1 /3/4
behandlede OCICs (data ikke vist). Resultatene viste at en YAP /TEAD co-aktivator var nødvendig for å opprettholde OCIC pluripotency
A:. Representative immunfluorescens fargings resultater for oktober-4 uttrykk i
Yap
– og
Tead1 /3/4
-silenced OCICs. BC: Real-time RT-PCR (B) og Western blotting (C) resultater som viser at de angitte gener ble nedregulert i OCICs etter RNAi uttømming av
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
. D: Bilder av OCIC sfæriske klynger uten (øverste panelene) og med (nedre paneler) sh
Yap
-rensing ved 200 ganger forstørrelse
YAP-TEAD overfører kjemoterapeutisk legemiddelresistens til. OCICs
En egenskap ved kreft stamceller er deres motstand mot konvensjonell kjemoterapi. Dermed fant vi ut OCICs følsomhet for cisplatin, taxol, og bleomycin behandlinger. Primære tumorceller oppviste følsomhet for disse kjemoterapeutiske medikamenter på en dose-avhengig måte (Fig. 5A). Sammenlignet med primær tumorceller, oppviste OCICs forbedret motstand mot cisplatin, taxol, og bleomycin (Fig. 5A). Men OCICs med
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
knockdown hadde redusert overlevelse (fig. 5B). Disse resultatene støtter hypotesen om at YAP-TEAD forbedret legemiddelresistens av stammen lignende celler i eggstokkreft.
A. Overlevelse av primære eggstokkreft celler (kontroll) og OCICs etter behandling med cisplatin (CDDP), taxol, eller bleomycin på angitte konsentrasjoner. OCICs og kontrollceller ble behandlet med legemidler i 48 timer. *, P 0,01, sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe. **, P 0,001, sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe. B. Overlevelse av OCICs med eller uten
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
knockdown etter behandling med CDDP, taxol, eller bleomycin på de angitte konsentrasjoner for 48 timer. ns, ikke signifikant; *, P 0,01; **, P 0,001. C-D: Real-time RT-PCR resultater som viser at de angitte gener ble uttrykt i OCICs på et høyere nivå enn i grunnskolen eggstokkreft celler (C). Indikert gener «uttrykk nivåer i OCICs var signifikant nedregulert med
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
RNAi (D). *, P 0,01; **, P 0,001. E. Western blotting resultater for AKT og Pakt nivåer i OCICs med eller uten
Yap /Tead1 /3/4
shRNA behandling.
YAP opp-regulerer GSK3A og ABCB1 uttrykk for å forbedre OCICs «legemiddelresistens
for å bestemme resistente gener involvert i regulering OCICs, brukte vi multiresistent gen microarray analyse for OCICs og identifiserte flere mulige chemoresistance relaterte gener som var sterkt uttrykt i OCICs. En tabell sammendrag av sine microarray funn med de respektive fold endringene ble gitt i tabell S1. Den resistens relaterte gener ABCB1, ABCC1 GSK3A, hadde signifikant høyere uttrykk nivåer i OCICs enn i grunnskolen eggstokkreft celler (Fig. 5C). Vi videre undersøkt om disse genene ble regulert av YAP-TEADs i OCICs. Blant disse genene, ABCB1 og GSK3A var signifikant nedregulert i
Yap /Tead
-depleted OCICs, mens ABCC1 uttrykk ikke var signifikant påvirket (Fig. 5D).
I tillegg
Gsk3a
,
Gsk3b, etter og (5C fig.)
p53
genekspresjon ble også påvist i OCICs. Blant disse,
Gsk3a Hotell og
p53
ble bemerkelsesverdig nedregulert i
Yap /Tead
-depleted OCICs og
Gsk3b
endret seg lite (Fig. 5D ). Disse resultatene antydet at YAP og TEADs forbedret OCICs «legemiddelresistens ved opp- og nedregulere de gener som er involvert i legemiddelmetabolismen og celleoverlevelse.
PI3K signalveien er kjent for å samarbeide med Hippo vei å regulere celle vekst og proliferasjon [28]. Fosforylerte AKT nivåene var høy i OCICs og redusert med
Yap Hotell og /eller
Tead1 /3/4
uttømming. Interessant, vil den totale AKT nivåer ble også nedregulert i
Yap /Tead1 /3/4
co-utarmet OCICs. Resultatene viste også at YAP /TEADs var nødvendig for å opprettholde PI3K /AKT pathway aktivitet i OCICs (Fig. 5E).
MAPK pathway gener som er involvert i YAP opprettholdt OCIC pluripotency
Resultatene fra qPCR microarray analyse (tabell S2) viste at flere gener involvert i MAPK trasé, inkludert
c-Fos
,
EGFR
, og
Igf2r
, hadde høyere uttrykk nivåer i OCICs enn i grunnskolen eggstokkreft celler (fig. 6A). Deres uttrykk ble nedregulert etter
Yap Hotell og
Tead1 /3/4
shRNA behandling (Fig. 6B). Fordi C-juni og C-FOS danne AP-en kompleks og fungere sammen, undersøkte vi
c-Jun
genuttrykk i disse prøvene, og fant lignende resultater (Fig. 6A-B).
EGFR
og
Igf2r
genene koder for epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og insulin-lignende vekstfaktor-2-reseptor (IGF2R), respektivt. Dette er viktige cellemembranreseptorer som overfører viktige ekstracellulære signaler til kjernen ved aktivering av MAP-kinase-kaskader. Fosforylerte og aktiverte MAP kinaser translocate fra cytoplasma til kjernen å megle C-FOS og C-juni transkripsjon aktivering. Noen studier har vist at YAP reguleres TEAD gener til oppregulerer
Areg
-genet, som interagerer med den EGF /TGF-alfa-reseptoren for å fremme veksten av normale epitelceller [29], [30]. Dermed våre resultater antydet at disse genene i MAPK veier kan være involvert i YAP opprettholdt OCIC pluripotency.
A. Real-time RT-PCR resultater som viser at de angitte gener ble uttrykt i OCICs på et høyere nivå enn i grunnskolen eggstokkreft celler (kontroll). B. Real-time RT-PCR resultater som viser at de angitte genene «uttrykk nivåer var signifikant nedregulert i OCICs med
Yap Twitter /
Tead1 /3/4
RNAi.
Diskusjoner
Tumor forekomst og progresjon er nært knyttet til unormal somatisk celleutvikling og differensiering. Det er et lite antall spesifikke celler eller såkalt stamcelle i kroppen inkludert ovarievev som er i stand til selvfornyelse og retnings differensiering [31] – [33]. Som en del av disse cellene har kreft stamceller nylig vakte oppsikt. En tidligere studie viste at en mye mindre kreftstamcelle befolkningen faktisk eksistert i noen kreft vev, som startet utviklingen av kreftceller og ble knyttet til stamcelle eiendom vedlikehold, tumorigenesis, ondartet metastaser, og tilbakefall [34]. Cancer stamceller har flere viktige funksjoner, inkludert klone formasjon evne, uttrykk for stamcellemarkører og spesifikke celleoverflatemarkører, celledifferensiering og morfologisk identifikasjon, og sterk tumorigent kapasitet.
I denne studien har vi lyktes i å isolere eggstokkreft kreft stilk-liknende celler fra tumorbærende mus og viste at disse cellene hadde kreft stamcelle karakteristikker som er beskrevet ovenfor. Etter ca en måned i kultur, OCICs dannet klynger som inneholdt en rekke celler og hadde en diameter opp til 500 mikrometer. OCICs ikke bare hadde sterke klonogene evne, men også uttrykt kreft stamcellemarkører på høye nivåer. Celle differensiering Resultatene viste at sfæroidene vi isolert faktisk hadde de samme egenskapene av ovarialcancer. De tumorigene priser av disse OCICs var betydelig høyere enn de primære eggstokkreft celler og disse dataene ikke har blitt vist i Figur 2.
Mange signalveier, som Wnt, PI3K, MAPK signalveier, har vært rapportert å være nært knyttet til stamceller og flodhesten sti [18], [19]. The Hippo veien har også fått stor oppmerksomhet med hensyn til stamcelle regulering og tumorigenesis mekanismer [23], [35], [36]. Noen studier viser at YAP genet regulert epithelial stamcelle reparasjon og tarmstamcelle og stamcelle funksjon [37] – [40]. Tumor-spre celler og aktivitet bidratt til lungetumorprogresjon og metastase i CD24-avhengig og Yap /Taz-avhengige veier [41]. YAP ble hemmet av catenin under epidermal stamcelle spredning og hudkreft utvikling via Wnt signalveien [42]. I kontrast, YAP begrenset Wnt signaler under intestinal regenerering. I vår studie, AKT og MAPK fosforylering nivåene var dramatisk høyere uttrykk ikke bare i OCIC tumorvev, men også i OCICs.
transgene uttrykk for YAP redusert Wnt mål genuttrykk og resulterte i hurtig tap av tarm krypter. I tillegg er et tap av YAP resulterte i hyperplasi og utvidelse av tarm stamceller (ISCS) og nisje celler [38].
