Abstract
L-asparaginase ha lav glutaminase har vært en sentral terapeutisk middel i behandlingen av akutt lymphpoblastic leukemi (A.L.L). I den foreliggende undersøkelse, et ekstracellulært L-asparaginase med lav glutaminase-aktivitet, fremstilt ved
Bacillus licheniformis
ble renset til homogenitet. Protein ble funnet å være en homotetramer av 134,8 kd med monomere størrelsen på 33,7 kd og svært spesifikke for sin naturlige underlaget
dvs.
L-asparagin. Aktiviteten av renset L-asparaginase forbedret i nærvær av kationer, inkludert Na
+ og K
+, mens den var moderat hemmet i nærvær av divalente kationer og tiolgruppe blokkerende reagenser. Det rensede enzym var maksimalt aktiv over området pH 6,0 til 10.0 og temperatur på 40 ° C og enzymet var stabil maksimum ved pH 9,0 og 20 ° C. CD spektra av L-asparaginase spådd enzymet å bestå av 63,05% α- helix og 3,29% beta ark i sin opprinnelige form med T
222 av 58 ° C. Fluorescerende spektroskopi viste at proteinet skal være stabil selv i nærvær av mer enn 3 M GdHCl. Kinetiske parametre K
m, V
max og k
cat av renset enzym ble funnet som 1,4 × 10
-5 M, 4,03 IU og 2,68 × 10
3 s
– 1, henholdsvis. Den rensede L-asparaginase hadde cytotoksisk aktivitet mot ulike kreftcellelinjer
nemlig.
Jurkat klone E6-1, MCF-7 og K-562 med IC henholdsvis
50 på 0,22 IU, 0,78 IU og 0,153 IE . Men enzymet hadde ingen toksisk effekt på humane erytrocytter og CHO cellelinjer derfor bør vurderes potensiell kandidat for videre farmasøytisk bruk som en anticancer stoffet
Citation. Mahajan RV, Kumar V, Rajendran V, Saran S, Ghosh PC, Saxena RK (2014) Rensing og karakterisering av en roman og Robust L-Asparaginase ha lav-glutaminaseaktivitet fra
Bacillus licheniformis: In vitro
Evaluering av anti-kreft egenskaper. PLoS ONE 9 (6): e99037. doi: 10,1371 /journal.pone.0099037
Editor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, USA
mottatt: 24 februar 2014; Godkjent: 09.05.2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Mahajan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatteren Richi V. Mahajan takket Rådet for industriell og teknisk forskning (CSIR), New Delhi, for fellesskap støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, utgifter til eksperimentering utstyr og kjemikalier, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
den manglende evne til leukemiceller til å syntetisere sin egen L-asparagin har gjort enzymet L-asparaginase en viktig del av cellegift i behandling av akutt lymfatisk leukemi (ALL) [1] [2]. Dette enzym hydrolyserer L-asparagin til L-asparaginsyre og ammoniakk i blodet vaskulære system, slik at leukemiceller blottet for vesentlig eksogent L-asparagin, som fører til hemming av proteinsyntesen og apoptose [3] – [5], dermed gjør dette enzymet en potent anti-kreft agent.
Den nåværende kommersielle tilførsel av L-asparaginase er hovedsakelig hentet fra
E. coli Hotell og
Erwinia chrysanthemi
men stoffet fra disse kildene er sterkt immunogene dermed nøytralisere de terapeutiske effektene og forårsaker symptomer i mer enn 50% av krefttilfellene [6]. Også har mange studier observert økning i antall pasienter med klinisk resistens mot dagens marked narkotika [6] – [8]. Den kommersielle L-asparaginase ble funnet å ha
in vitro
motstand mot cellene fra pasienter med residiverende A.L.L [9]. Et annet problem knyttet til de kommersielle L-asparaginases er den lave substrat spesifisitet og høy glutaminaseaktivitet, noe som kan føre til leversvikt, pankreatitt, leukopeni, nevrologiske anfall, og koagulasjonsabnormaliteter fører til intrakraniell trombose eller blødning [10]. Derfor er det behov for nye og robuste L-asparaginases fra GRAS (
generelt anerkjent som Safe
) mikroorganismer som har forbedret stabilitet, lavere glutaminaseaktivitet med høy underlaget affinitet, lav K
m verdi og tilstrekkelig halv -Life under fysiologiske betingelser slik at det kan overvinne de ovenfor nevnte utfordringer i dagens situasjon.
Derfor er den foreliggende studie rettet mot rense L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 (jord Isolate) som har blitt bekreftet å være en roman L-asparaginase og har blitt evaluert for sine biofysiske og biokjemiske egenskaper og sitt potensial som et anticancermiddel mot forskjellige humane kreftcellelinjer.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse: Bedrifter den blodprøver i nåværende arbeid ble innhentet fra Rotary Blood Blank, New Delhi som en gave, og disse blodprøvene er kommersielt tilgjengelig i Rotary blod~~POS=TRUNC for forskningsformål. Etisk komité godkjenning er ikke nødvendig for å oppnå menneskelig blod til forskningsformål. Vi har brukt menneskeblod for forskningsformål hentet fra Rotary Blood Bank og publisert den samme som tidligere [11].
2.1 Kjemikalier
Kjemikalier som brukes for enzymet rensing (kromatografiske matriser) og karakterisering ble kjøpt fra Sigma Aldrich. Nessler reagens ble kjøpt fra Fluka (Buchs, Sveits). L-asparagin ble kjøpt fra Spectrochem (India). Alle kjemikalier som brukes til produksjon var av analytisk kvalitet og ble kjøpt fra Hi-Media (India). Kjemikalier og markører som brukes i native og SDS PAGE ble hentet fra Bio-Rad.
2,2 L-asparaginase Produksjon
L-asparaginase produksjon av
Bacillus licheniformis
RAM-8 (jord isolat ; identifisert på grunnlag av 16 s RNA og 500 bp analyse, Midi-labs, USA) ble utført i optimalisert modifisert Czapek Dox medium [12]: Na
2HPO
4, 6 g /l; KH
2PO
4, 2 g /l; NaCl, 0,5 g /l; L-asparagin, 20 g /l; glycerol, 2 g /l; Magnesiumsulfat
4.7H
20, 0,2 g /l; CaCl
2.2H
2o, 0,005 g /l. Kolber inneholdende produksjonsmedium (50 ml i 250 ml kolbe) ble inokulert med 2% inokulum (v /v) (ytre diameter 2,0). Inkubasjon ble utført ved 37 ° C ved 200 rpm i 24 timer. Enzymproduksjonen var ekstracellulær og enzymaktiviteten ble bestemt ved anvendelse av kulturfiltratet. Alle forsøkene ble utført i triplikat, og middelverdiene med standardavvik (SD) ble beregnet.
2,3 Enzym-analyse
Analyse av enzymet ble utført i henhold til prosedyren angitt nesslerization av Shirfrin
et al
. [13] under anvendelse av 189 mM L-asparagin som substrat eller på annen måte er nevnt, i 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,6) og lesing av absorbansen ved 436 nm. Ammoniumsulfat løsning ble anvendt for fremstilling av standardkurven. En internasjonal enhet (IU) av asparaginase-aktivitet er definert som den mengde enzym som kreves for å frigjøre ett pmol av ammoniakk per ml per minutt ved pH 8,6 ved 37 ° C.
2,4 Enzyme Purification
2.4.1 Ultrafiltrering.
den cellefrie fermenteringsmedium ble underkastet ultrafiltrering med membrankassett av 30 kDa for å fjerne de nedre proteinene og å konsentrere det ønskede protein. Retentatet og permeatet oppsamlet etter ultrafiltrering ble analysert med hensyn til L-asparaginase-aktivitet og proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford-metoden [14].
2.4.2 Aceton utfelling.
avkjølt aceton (-20 ° C) var tilsatt til den konsentrerte buljong med konstant omrøring ved 4 ° C i gradienten konsentrasjon på 20 til 80%, for proteiner for å utfelle. Fraksjonene som viser maksimal aktivitet ble sentrifugert lufttørket og oppløst i minimal mengde 50 mM Tris HCl (pH 8,6) og dialysert mot den samme buffer for å oppnå den konsentrerte protein.
2.4.3 DEAE-cellulose-kromatografi.
Den konsentrerte enzym ble påført på dietylaminoetyl-cellulose-kolonne (DEAE-cellulose) (4 x 60 cm) ekvilibrert med 50 mM Tris-HCL (pH 8,6). Kolonnen ble vasket med 2 volumdeler av utgangsbuffer, og proteinet ble eluert med lineær gradient av NaCl (0-0,5 M) fremstilles i fosfatbuffer pH 7,4 ved en hastighet på 60 ml per time. Fraksjoner som viser L-asparaginase aktivitet, ble samlet sammen dialysert mot 50 mM Tris-HCL (pH-8.6) og konsentrert med benk topp protein konsentrator ved 4 ° C.
2.4.4 Gel filtrering.
den konsentrerte enzymløsning ble tilsatt på toppen av sephadex G-100 kolonne (4 x 60) cm-ekvilibrert med 50 mM Tris-HCl (pH 8,6) og eluert med den samme buffer ved en strømningshastighet på 0,5 ml per minutt. Fraksjonene som L-asparaginase-aktivitet ble slått sammen og dialysert mot den samme buffer og frysetørket med topplaten lyofiliseringsanordning. Den homogenitet av proteinet ble sjekket av SDS og nativ PAGE.
2,5 Karakterisering av renset L-asparaginase
2.5.1 Bestemmelse av molekylvekt.
Den rensede L- asparaginase ble påført på Sephacryl S-200 ™ høy oppløsning kolonne (Pharmacia, 16/60) ekvilibrert med 50 mM tris-HCl (pH-8,6) og eluert ved en strømningshastighet på 0,5 ml per minutt [15]. Standardmolekylmarkørproteiner ble tilført til kolonnen, og elueringen volum (V
e) for hver markørprotein og hulromsvolum (V
o) i kolonnen ble registrert. Den molekylmasse av proteinet ble bestemt på et semi-log kurve som ved å avsette V
e /V
o på X-aksen og logaritmen av molekylvekten på Y-aksen.
2.5.2 effekt av pH og temperatur på aktiviteten og stabiliteten av enzymet.
aktiviteten av L-asparaginase ble evaluert ved forskjellige pH-verdier og temperaturer. Optimal pH for L-asparaginase-aktivitet ble bestemt over et pH-område fra 4 til 10. For pH-stabilitetsstudier ble enzympreparater inkubert ved pH-verdi på 4-10 i 24 timer ved 4 ° C og gjenværende aktivitet ble bestemt under analysebetingelser ( pH 8,6, 50 mM). Det optimale temperaturområde for enzymaktivitet ble bestemt ved å utføre enzymanalyse ved forskjellige temperaturer fra 25 til 65 ° C. Også varmestabiliteten av enzymet ble bestemt ved inkubering av den frysetørkede enzymet ved forskjellige temperaturer
nemlig
-20 ° C, 4 ° C, 10 ° C, 30 ° C og 60 ° C i 30 dager.
2.5.3 substrat spesifisitet.
enzymaktivitet ble evaluert med ulike amider som underlag,
nemlig.
L-asparagin, D-asparagin, L-glutamin, D-glutamin, L -asparaginsyre, D-asparaginsyre, L-glutaminsyre, L-ornitin og urea, ved konsentrasjoner på 10 mM, respektivt. Resultatene ble presentert i form av prosentvis relativ aktivitet.
2.5.4 Effekt av ulike metallioner, serumkomponenter og hemmere på enzymaktivitet.
Effekt av ulike uorganiske ioner på enzymaktiviteten ble bestemt ved pre-inkubering av enzymet med forskjellige salter ved en konsentrasjon på 100 mM i 6 timer ved 4 ° C. Også effekten av serum, serumkomponenter og inhibitorer (sulfhydryl og serin) ble bestemt ved inkubering av enzymet ved effektor konsentrasjon på 10 mM i 6 timer ved 4 ° C. Resultatene ble presentert i form av prosentvis relativ aktivitet.
2.5.5 Kinetic parametre.
V
max,
K
m
,
k
katt, og
k
cat /
K
m
ble bestemt ved 25 ° C ved hjelp av L-asparagin som substrat ved de konsentrasjoner som varierer fra 2 til 20 mM med konstant enzymkonsentrasjon på 1 mg /ml. Den innledende omløpshastighet på ti forskjellige konsentrasjoner av substrat ble beregnet, og typen av inhibering og Michaelis-Menten parametre ble bestemt fra Lineaweaver-Burk plottene ved hjelp av ligning avledet fra lineær-regresjonsanalyse av kurve.
k
cat verdi ble beregnet ved bruk av ligningen
k
cat =
V
max /[E], der [E ] er den enzymkonsentrasjon i analysen. k
katt og spesifisitet konstanter (k
cat /K
m) ble beregnet på grunnlag av en aktiv side per 33,7 kD underenhet som beskrevet av Kumar
et al
. [16].
2.5.6 sirkulærdikroismeanalyse.
CD spektra ble registrert på en JASCO J-815 spectropolarimeter (JASCO Corporation, Hachioji-shi, Tokyo, Japan) med en sylindrisk kvarts celle av veilengden 1 mm og 1 cm, henholdsvis for langt og nesten UV-område. Endringer i den sekundære og tertiære struktur av proteinet ble overvåket i det fjerne og nære -UV området mellom 190-260 nm og 260-320 nm, respektivt. Tre påfølgende spektrale skanninger ble beregnet og korrigert ved å trekke fra tilsvarende blanke og utsatt for støyreduksjon. Utfoldelsen overgang mønster av renset L-asparaginase ble overvåket av langt UV CD-spektroskopi, der endringer i signalintensitet på 222 nm ble plottet mot funksjon av temperatur.
2.5.7 fluorescens spektroskopi.
Fluorescens målingene ble utført ved hjelp av Eclipse Cary Varian UV-Vis spektrofluorometer (Varian, Inc. Hansen Way, Palo Alto, CA, USA) festet til en Peltier temperaturregulator. En eksitasjonsbølgelengde på 280 nm med eksitasjon en spalte på 5 nm og en emisjons sliss på 5 nm ble anvendt, og fluorescensen ble registrert fra 300 nm til 400 nm. Utfolding mønster og stabilitet av protein ble bestemt ved anvendelse av 0-6 M guanidin HCl (GdHCl) som beskrevet av Bansal
et al.
, [17]. Fluorescensintensiteten ble plottet som funksjon av bølgelengden ved hjelp av F
400 nm som baseline.
2.5.8 N-terminal sekvensering av L-asparaginase.
For å bekrefte identiteten til protein, ble proteinprøver svarende til en molekylvekt på 33,7 kDa på SDS-PAGE blottet på en polyvinyldifluorid (PVDF) membran (Sigma-Aldrich, USA) og utsatt for N-terminal aminosyresekvens bestemmelse ved hjelp av en automatisert protein sequencer PPSQ31A (Shimadzu, Japan).
2,6 Anti-tumor Bruk av L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
2.6.1 celler og celledyrkningsforhold.
kreft egenskaper av renset L-asparaginase ble evaluert på ulike humane tumorcellelinjer
nemlig.
Jurkat klone E6-1, MCF-7 og K-562 (anskaffet fra NCCer, Pune). Jurkat-cellene og K-562 ble dyrket i suspensjon i RPMI-1640 medium og MCF-7 ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% varmeinaktivert FBS (Sigma), penicillin (100 ug /ml) og streptomycin (100 ug /ml ). Celler ble opprettholdt under en fullstendig fuktet atmosfære på 95% romluft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
2.6.2 Celleviabilitet måling.
Den anti-proliferative virkning av L-asparaginase ble målt ved kolorimetrisk analyse som måler reduksjonen av gule 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) av mitokondrielle succinatdehydrogenase til en uoppløselig, farget ( mørk purpur) formazanprodukt som er oppløst i organisk oppløsningsmiddel og måles spektrofotometrisk. I korthet ble cellene sådd ut i en celletetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i flatbunnede 96-brønns mikroplater standard. Det rensede L-asparginase (100 IU /mg) ble seriefortynnet i ufullstendig medium og tilsatt til cellekulturer ved en endelig konsentrasjon 0,75 til 25 ug /ml. Etter inkubering i 24 timer, 20 ul av MTT ved en konsentrasjon på 5 mg /ml i fosfatbuffer-saltvann (PBS, pH 7,4) ble tilsatt til hver brønn. Etter 4 timers inkubering ble platene sentrifugert ved 2000 rpm i 10 minutter, hvoretter platene ble snudd raskt med en fast raskt for å fjerne kulturmediet. For å oppløse formazanfremstilling bunnfall ved tilsetning av 150 ul av 01:01 blanding av etanol og DMSO ble tilsatt til hver brønn og platene ble ytterligere inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Absorbansen ble så bestemt ved spektro-fotometrisk mikroplateleser Tecan uendelig 200 pro, ved en testbølgelengde på 550 nm og en referansebølgelengde på 620 nm.
2.6.3
In vitro
hemolyse test.
det rensede L-asparaginase ble testet for in vitro hemolyse ved å inkubere økende konsentrasjoner av enzymet (6,25 ug til 100 ug) med heparinisert humant helt blod (oppnådd fra Rotary Blood Bank, New Delhi) i fosfatbuffer ( pH 7,2) i 24 timer som beskrevet av Lubran [18]. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 2,5% glutaraldehyd etter 24 timers inkubering og deretter sentrifugert. Supernatanten ble avlest ved 540 nm mot negativ kontroll, dvs. prøve uten enzym. Utarbeidelse av menneskeblod i dobbelt destillert vann ble behandlet som positiv kontroll.
Resultater
3.1 Rensing av L-asparaginase og molekylær massebestemmelse
trinnvis rensing av L- asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 har blitt presentert i Tabell 1 og Figur 1a. Rekken av kromatografiske trinn var meget effektiv og ga samlet rensing av 33-fold. Den endelige proteininnholdet i den rensede L-asparaginase var 15,25 mg, med utbytte på 32,95%. Den spesifikke aktivitet av renset enzym ble 697,09 IU /mg protein. Protein ble funnet å ha molekylstørrelse på 134,8 kDa (figur 1b), som bestemt ved gel-filtrering, kromatografi og monomere størrelsen på 33,7 kDa bekreftet ved SDS-PAGE. Den teoretiske IEF enzym ble beregnet til å være 5,48.
3,2 Effekt av pH og temperatur på aktivitet og stabilitet av L-asparaginase
Renset L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 var aktiv i løpet av lang rekke pH-verdi på 6-11 med maksimal aktivitet ved pH 9 (figur 2a). Det fremgår av figur 2c at det rensede enzym var aktiv ved temperaturområdet fra 30-50 ° C og viste et bratt bart i aktivitet over 60 ° C. Også enzymet var maksimalt stabil ved pH-området på 7,0 til 9,0 i løpet av periode på 24 timer (figur 2B). Den beste temperatur for enzym lagring ble funnet å være -20 ° C hvor det var enda stabil etter 30 dager for å holde (figur 2d).
100% aktivitet tilsvarer 140 U av enzymet. Feilfelt representerer SD av tre forsøk.
3,3 Effekt av metallioner, Serum Komponenter og hemmende på L-asparaginase aktivitet
Det er tydelig fra figur 3a at enzymaktiviteten økt betraktelig i nærvær av de fleste de monovalente kationer og var maksimal i nærvær av Na
+, K
+ og Mg
++. Men de andre toverdige kationer hadde skadelig virkning på enzymaktiviteten. Enzymet beholdt mer enn 80% aktivitet i nærvær av serin-protease-inhibitorer viz. PMSF PBA derav som indikerer at det ikke er en serin hydrolase. Det var nedgang på 60% i aktiviteten av L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 i nærvær av sulfhydryl-inhibitorer. Også dissosiering midler urinstoff og EDTA inhiberer aktiviteten med 70% (figur 3b).
100% aktivitet tilsvarer 140 U av enzymet. Feilfelt representerer SD av tre forsøk.
Men renset L-asparaginase aktivitet var robust ved fysiologisk pH og temperatur, men enzymaktiviteten redusert med ca 40%, når den rensede L-asparaginase ble inkubert med humant serum og komponentene henholdsvis under
in vitro
forhold for 48 timers der på detaljert evaluering ble det oppnådd at laktat, oxylate og pyruvat utstilt mer enn 70% hemming (figur 3c).
3,4 Substrat spesifisitet
Det rensede L-asparaginase viste en høy spesifisitet mot sin naturlige underlaget dvs. L-asparagin. Men mindre enn 10% og 1% aktivitet mot D-asparagin og L-glutamin, henholdsvis ble observert (figur 3d). Ingen andre substrat ble funnet å samhandle med enzymet i sin rene form.
3,5 Kinetic Parametere
Lineweaver Burk plot i figur 4 infers at K
m og V
max renset L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM 8 ved hjelp av L-asparagin som substrat var 1,4 × 10
-5 M og 4,03 IU, henholdsvis og omsetningstall (K
katt) av enzymet var fast bestemt på å være 2,68 × 10
3 s
1. (K
cat /K
m) av enzymet ble funnet å være 1,503 × 10
6 M
-1s
1.
K
m = 1,4 × 10
-5 MV
max = 4.03 IU /mikrogram.
3,6 sirkulærdikroismeanalyse
CD spekteret av renset L-asparaginase ga negative elipticities på 208 og 222 nm (figur 5a). Den k2D analyse av den fjerne UV-CD-spektrum 240-200 nm forutsagt APHA helix å være 63,05% og beta-ark til å være 3,29%, og T
m av protein ble funnet å være 58 ° C, noe som oppgir sin årsak for bratt bart i aktivitet når enzymet ble testet over 60 ° C (figur 5b). Den nære UV-CD-spektra av proteinet ga negative elipticities i området fra 260-290 som vist i figur 5c.
c). I nærheten av UV-CD spektra av renset L-asparaginase 1,0 mg /ml i 0,1 M Tris HCL (pH-8.4).
3,7 flourescensspektroskopi
Det rensede L-asparaginase protein viste maksimal fluorescens ved 323 nm i sin native form i fravær av GdHCl, men en overgang til 352 nm ble observert når 6 M GdnCl ble tilsatt, og dermed angivelse av en fullstendig utfolding som presentert i figur 6. en høyere fluorescens ble observert i proteinet i sin utfoldet kald tilstand
nm (eksitasjon bølgelengde: 292 nm).. og utfoldelse overganger av L-asparaginase på 0 M, 3 M og 6 M guanidin HCl
3,8 N-terminal Sequencing av L-asparaginase
proteinprøver svarende til molekylmasse på 33,7 kDa på SDS-PAGE ble blottet på en polyvinyldifluorid (PVDF) membran (Sigma-Aldrich, USA) og ble utsatt for den N-terminale amino- syresekvensbestemmelse ved anvendelse av en automatisert proteinsekvense PPSQ21A (Shimadzu, Japan). Sekvensen av de første 15 N-terminale aminosyrerester ble funnet å være DNKKVEAATGGTQAG som viste en bred variasjon med det kjente og rapporterte proteinsekvens av L-asparaginase.
3,8 Anti-proliferative effekt av L-asparaginase
Den anti-proliferative aktivitet av L-asparaginase ble målt mot tre forskjellige humane tumorcellelinjer viz. Jurkat klon E6-1, MCF-7 og K-562. IC
50 av renset L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 ble funnet å svært effektiv mot de leukemiske cellelinjer viz. Jurkat-klon E6-1 cellelinjer og K-562 cellelinjer med IC
50 til 0,22 IU IU og 0,15 henholdsvis (figur 7). Den brystkreft cellelinje MCF-7 viste også en veksthemming mot økende konsentrasjoner og viste en IC
50 på 0,78 IE.
3.9
In vitro
Hemolyse Test for testing av legemiddeltoksisitet
The L-asparaginase inkuberes med heparinisert blod viste ingen effekt selv ved konsentrasjon på 100 ng /ml (figur 8). Også medikamentet ikke har inhiberende effekt på testcellelinje fra kinesisk hamster ovarie (CHO) -celler derav medikamentet kan anses sikker for de ytterligere
in vivo
evalueringer
A.: Negativ kontroll (uten L-asparaginase); B: positiv kontroll (med dobbelt destillert vann); C: 100 ug /ml; D: 50 ug /ml; E: 25 ug /ml; F: 12,5 pg /ml; G:. 6,25 mikrogram /ml L-asparaginase
Diskusjoner
Rensing av L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 ble oppnådd ved hjelp av ultra- filtrering, 80% aceton presipitering, DEAE-cellulose-kromatografi og sephadex G-100 gelfiltrering, respektivt. L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 ble renset til tilsynelatende homogenitet med rensing fold av 30,17 og et utbytte på 32,95%, hvor den spesifikke aktivitet av enzymet økte fra 23,10 IU /mg til 697,09 IU /mg. Protein hadde en molekylvekt på 134,8 kDa, men monomere størrelsen på 33,7 kDa derfor kunne være en mulig homotetramer. Disse funn er i overensstemmelse med tidligere rapporter om at bakterie L-asparaginase er et homotetramer [19] – [21]. Den teoretiske IEF enzym ble beregnet til å være 5,48, nær det av L-asparaginase av
E. coli
(IEF 5), men forskjellig fra den til
Erwinia plakater (IEF 8.7) [16], [22]. Renset L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 var funksjonelt stabile og aktive bredt spekter av pH og temperatur, og viste den optimale aktivitet under fysiologiske betingelser. Derfor denne L-asparaginase var mer robust i forhold til L-asparaginase fra
E. coli Hotell og
Erwinia product: [16], [22] – [23]. De monovalente kationer, Mg
++ og serumsukkerarter forbedret enzymaktiviteten, mens enzymaktivitet ble redusert i nærvær av andre divalente kationer og serum organiske syrer. I dette henseende, enzymet var lik
Erwinia
L-asparaginase [24]. Den hemmende effekten av divalente kationer så som Ca
++ og serum organiske syrer kan overvinnes ved innfanging av enzymet i liposomer som kan maskere den hemmende virkning. Enzymet innesperring kan ytterligere forlenge plasmahalveringstiden og også redusere immunogenisiteten, ytterligere øke den terapeutiske effektivitet sammenlignet med fritt enzym [25]. Aktivitet av L-asparaginase betydelig redusert med 60% i nærvær av sulfhydryl-inhibitorer, som kan være på grunn av tilstedeværelsen av frie SH-grupper på de aktive setene enzym [26]. Enzymet ble funnet å være meget spesifikk for dens naturlige substrat L-asparagin, med mindre enn 1% glutaminase-aktivitet. Men
E. coli
L-asparaginase er forbundet med sterk glutaminase-aktivitet [2]. Det er rapportert at skadelige effekter er oppstått når glutamin er oppbrukt under kritiske nivåer, noe som reduserer syntesen av flere viktige proteiner
nemlig
. albumin, insulin, fibrinogen og protein-C [10], [25]. Lavere glutaminaseaktivitet forbedrer også L-asparagin uttømming [25]. Det rensede enzym har K
m verdi på 1,4 x 10
-5 M som er lavere enn L-asparaginase fra
Erwinia plakater (3,0 x 10
-3 M) [27] og
E. coli product: (3,5 × 10
-3 M) [28] og dermed et bedre underlag affinitet, men lavere K
m verdi på 7,4 × 10
-6 M ble oppnådd i tilfelle av L- asparaginase fra
Vibrio succinogenes product: [28]. CD-spektrum av det rensede L-asparaginase viste negative elipticities ved 208 og 222 nm som er karakteristisk for spektra ble oppnådd for blandede alfa- /beta typer proteiner [29]. Den nære UV-CD-spektra av proteinet ga negative elipticities i området på 260 til 290 som kan tilskrives nærværet av de aromatiske aminosyre-sidekjeder av fenylalanin, tyrosin og tryptofan og gi CD-spektrene som er karakteristisk for naturlig kompakt foldet protein strukturen [29]. Det var en gradvis overgang fra 323 nm til 352 nm λ
em på å øke konsentrasjonen av GdHCl 1-6 M, men skiftet var fremtredende bare når konsentrasjonen av GdHCl ble økt mer enn tre M. likhet har blitt rapportert i ved hyperthermophilic asparaginase produsert fra det muterte
Pyroccocus furiosus
av Bansal,
et al
i 2011 [17]. Sekvensen av de første 15 N-terminale aminosyrer viste en bred variasjon med det kjente og rapporterte proteinsekvens av L-asparaginase, men den konserverte sekvensen av ATGGT ble nedtegnet [16] således derav denne L-asparaginase-proteinet er ny som kanskje tillegger sin robuste egenskaper og lav glutaminaseaktivitet. Renset L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 ble funnet å være meget effektive mot kreft-cellelinjer, Jurkat klon E6-1, MCF-7 og K-562, hvor IC
50 ble tatt opp i området fra mindre enn 1 IU /ml. Men den kommersielle L-asparaginase fra
Erwinia
har blitt rapportert å ha IC
50 fra 7,5 til 10,0 IU /ml og den til
E. coli
har IC
50 på 1,0 IE /ml på de tilsvarende cellelinjer [30]. I dette gjelder dette, kan L-asparaginase betraktes som mer potente og effektive våpen i kjemoterapi av tumorer sammenlignet med dagens kommersielle preparater. Også denne L-asparaginase var giftfri mot normal CHO cellelinje og humane erytrocytter. Omtrent 15-20% av pasientene behandlet med
E. coli
avledede asparaginase utvikle overfølsomhet og toksisitet av stoffet [31] derav denne L-asparaginase kan potensielt være en bedre kandidat under fysiologiske forhold.
Konklusjoner
L-asparaginase fra
Bacillus licheniformis
RAM-8 ble renset til tilsynelatende homogenitet og ble funnet å være en homotetramer som har molekylstørrelse på 134,8 kDa. Dette L-asparaginase er aktiv og stabil over lang rekke av temperatur og pH og spesifikk for det sin naturlige underlaget
dvs.
L-asparagin. Biofysisk karakterisering konkluderte med at det skal være robust konstruksjon av α /β blandet protein. Den N-terminale sekvens av dette proteinet ikke samsvarte med den kjente og rapportert L-asparaginase sekvens derav protein er en ny. Dette L-asparaginase viste anticancerous effekt mot Jurkat klon E6-1, K-562 og MCF-7 cellelinjer og ikke-toksisk effekt mot heparinisert blod eller CHO test cellelinje.
Takk
Forfattere takke Dr. TP Singh Institutt for biofysikk, AIIMS for infrastruktur støtte i N-terminal sekvensering. Forfatterne takker Rotary Blood Bank, New Delhi for å forsyne menneskeblod for forskningsformål som gave.
