Abstract
Innledning
Kjemoterapi -relaterte endothelial skade bidrar til tidlig utvikling av kardiovaskulær morbiditet i pasienter med testikkelkreft. Vi forsøkte å identifisere relevante mekanismer og søke etter kandidat biomarkører for endothelial skade.
Metoder
Menneske mikro-vaskulære endotelceller (HMEC-1) ble utsatt for bleomycin eller cisplatin med ubehandlede prøvene som kontroll. 18k cDNA mikromatriser ble brukt. Genekspresjon forskjeller ble analysert på enkelt gen-nivå og i gensettene gruppert i biologiske stier og validert av QRT-PCR. Protein nivåer av en kandidat biomarkør ble målt i testikkelkreft pasient plasma før, under og etter bleomycin-etoposid-cisplatin kjemoterapi, og relatert til endothelial skade biomarkører (von Willebrand faktor (vWF), høy følsomhet C-reaktivt protein (hsCRP)) .
Resultater
Microarray data identifisert flere gener med svært ulike uttrykk; f.eks Vekst Differensiering Factor 15 (
GDF-15
), aktivere transkripsjonsfaktor 3 (
ATF3
) og amfiregulin (
AREG
). Pathway analyse viste sterke assosiasjoner til «p53» og «Diabetes Mellitus gensettene. Basert på kjent funksjon, vi målte GDF-15 proteinnivåer i 41 testikkel pasienter under klinisk oppfølging. Pre-kjemoterapi GDF-15 nivåer tangert kontroller. Gjennom kjemoterapi GDF-15, økt vWF og hsCRP nivåer, og var korrelert på forskjellige tidspunkter.
Konklusjon
En objektiv tilnærming i en preklinisk modell avslørt gener relatert til kjemoterapi-indusert endothelial skade , som
GDF-15
. Økningen i plasma GDF-15 nivåer i pasienter med testikkelkreft under kjemoterapi og sin tilknytning til vWF og hsCRP foreslår at GDF-15 er et potensielt nyttig biomarkør relatert til endothelial skade
Citation. Altena R, Fehrmann RSN, Boer H, de Vries EGE, Meijer C, Gietema JA (2015) Vekst Differensiering Factor 15 (GDF-15) Plasma nivåene øker under Bleomycin- og Cisplatin basert behandling av pasienter med testikkelkreft og forholder seg til Endothelskaden. PLoS ONE 10 (1): e0115372. doi: 10,1371 /journal.pone.0115372
Academic Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Universitetet i Algarve, Portugal
mottatt: May 27, 2014; Godkjent: 21 november 2014; Publisert: 15 januar 2015
Copyright: © 2015 Altena et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støtte ble gitt av RUG 2009-4365 fra den nederlandske Kreftforeningen. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
innføring av platina-basert kjemoterapi i slutten av syttitallet har resultert i høye kur priser hos pasienter med metastatisk testikkelkreft. Imidlertid fører dette kjemoterapi bivirkninger, noe som resulterer i sykelighet på vellykket behandlet overlevende [1]. Aktuelle problemstillinger er den økte risikoen for andre kreftformer og hjerte- og karsykdommer (CVD) [2-5]. CVD kan oppstå under eller like etter behandling [6, 7], samt år til årtier senere [3-5, 8-11].
En av de som er involvert i utviklingen av denne mekanismer behandlingsrelaterte CVD er direkte endothelial skade. I tillegg til induksjon av endotel celledød [12-14], både bleomycine [14-16] og cisplatin [14, 17-19] indirekte påvirker endotelial cellefunksjon, f.eks gjennom interferens med inflammatorisk og fibrinolytiske faktorer. I siste instans kan dette kjemoterapi-indusert cellulær aktivering videre til endotelial dysfunksjon, akselerert aterosklerose og utilslørt CVD.
Tidlig anerkjennelse og muligens forebygging av disse behandlingsrelaterte komplikasjoner er avgjørende for å opprettholde en optimal helsetilstand av testikkelkreft overlevende. Utviklingen av CVD er en gradvis prosess, og tidlig intervensjon eller intensivert screening kan bremse eller stoppe utviklingen mot utilslørt klinisk sykelighet. Biomarkører for behandlingsrelatert endothelial skader kan identifisere de pasienter med økt risiko for hjerte-og karsykdom.
I denne studien vi tilbake-oversatte den kliniske funn som bleomycin og cisplatin indusere endothelial skade. Vi brukte en objektiv tilnærming ved å analysere cDNA microarray resultater for å identifisere nye gener assosiert med kjemoterapi-relaterte endothelial skade. Genekspresjonsprofiler ble samlet fra den humane mikrovaskulære endotelial cellelinje (HMEC-1) før og etter behandling med bleomycin og cisplatin ved forskjellige tidspunkter og konsentrasjoner. Kvantitativ Real Time PCR (QRT-PCR) ble utført for å bekrefte gener med signifikante uttrykk forskjeller i flere eksperimentelle innstillinger. Deretter basert på kjent funksjon av disse genene i litteraturen, valgte vi en av disse kandidat gener for ytterligere bekreftelse som bevis for prinsippet på proteinnivået i en testikkelkreft pasient kohort. Med denne translasjonell tilnærmingen vi forsøkte å identifisere mekanismer og potensielle biomarkører for kjemoterapi-relaterte endothelial skader.
Materialer og metoder
Cell linje modell
HMEC-en er et udødelig human dermal mikro-vaskulær endotel-cellelinje som beholder sin morfologiske og funksjonelle endotelcelle egenskaper i løpet av flere passasjer [20]. Cellene ble dyrket som et monolag i MCDB-131 medium (Invitrogen, Merelbeke, Belgia) supplert med 10% føtalt kalveserum (Bodinco, Alkmaar, Nederland), 10 mM L-glutamin (Invitrogen, Merelbeke, Belgia), 1 ug /ml hydrokortison (Sigma-Aldrich, Amsterdam, Nederland) og 10 ng /ml human epidermal vekstfaktor (R bleomycin 0,06 ug /ml eller cisplatin 0,52 uM) to ganger i uken; Cellene ble samlet opp for analyse på dag 30 (S1B fig.). Administrasjon av cisplatin måtte holdes tilbake på 7
th administrasjon på grunn av betydelig celledød, men ble fortsatt ved full dose etterpå. Bleomycin kan gis uten avbrudd.
cDNA microarray eksperimenter
Total RNA ble isolert fra HMEC-en av en RNeasy kit (Qiagen, Venlo, Nederland) og samlet for hver gang-punkt og stoffet fra 2 uavhengige forsøk. Etter rensing (Qiaquick PCR rensing kit, Qiagen, Venlo, Nederland), forsterket RNA (Crna) prøver ble forvandlet til cDNA med revers transkriptase, uavhengig merket med Cy3 (grønn) og Cy5 (rød), og tilfeldig hybridisert til Custom- laget 18K cDNA mikromatriser. Fluorescent bilder av microarray lysbilder ble oppnådd med Affymetrix GMS428 scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA) for begge fluoroforer, ble signalintensitet for hver spot kvantifisert ved dedikerte Imagene 5.6 programvare (Biodiscovery, Marina del Rey, CA).
quantile normalisering ble brukt til log2 forvandlet Cy3 og Cy5 intensiteter. Operonet v2.0 (Human Genome Oligo Set V2) probe koder ble konvertert til myndighetenes HUGO genet symboler. Ekspresjons-verdier fra flere sonder som målretter et enkelt gen ble midlet, noe som resulterer i en total av 15.950 unike gener. Deretter uttrykk data innhentet fra flere hybridiseringer (
n
= 4) av de samme HMEC-1 prøven ble i gjennomsnitt.
Dataene har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) og er tilgjengelig gjennom GEO-serien Tiltredelse antall GSE62523 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE62523).
klasse sammenligning
I de «akutte» eksponering innstilling, differensielt uttrykte gener mellom HMEC-1 ubehandlede prøver og prøver som utsettes for de forskjellige medikamentdoser (dvs. IC
50 og IC
90) ble testet med den ikke-parametrisk Cuzick test for lineær trend , noe som resulterer i en
Z
score og en
P
verdi. Denne testen ble gjort for cellene samlet inn etter 6 (
t
= 6), 24 (
t
= 24) og 48 (
t
= 48) timer. For alle tre tidspunkter
Z
skår som følge av Cuzick tester for lineær trend ble summert (dvs.
ΣZ
=
Z
t = 6
+
Z
t = 24
+
Z
t = 48
); derved å velge på gener med den begrensning at endringer i ekspresjon i en retning i samsvar med økende konsentrasjoner over tid. Gener ble rangert etter sin
ΣZ
poengsum.
I «kronisk» eksponeringsinnstilling, ble en T-test utført på genuttrykk nivåer hentet fra prøver eksponert for narkotika (IC
10 cisplatin eller IC
10 bleomycin) versus de ubehandlete kontrollprøver som ble samlet inn etter 30 dager inkubasjon. Resultatene av disse genene ble rangert i henhold til
P-
verdi.
Gene Set Enrichment Analyse
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [23] ble henrettet med GSEA 2.0-programvare pakke (Broad Institute, Cambridge, MA). Ekspresjons-data av alle 15.950 gener ble sammenlignet mot funksjonelt gen sett for å bestemme hvorvidt noen av disse settene ble anriket i HMEC-1 behandlet med bleomycin eller cisplatin i «akutte» og som «kronisk» eksponeringsinnstilling. Sammenligningen ble utført med 169 gensettene fra Kyoto Encyclopedia of gener og genomer database (KEGG; https://www.genome.jp/kegg/). Statistisk signifikant berikelse ble bestemt ved hjelp av en empirisk gen-basert permutasjon test med 1000 permutasjoner. En falsk funnrate (FDR) ble beregnet for hvert funksjonelt gen sett, som representerer den estimerte sannsynligheten for at en gitt berikelse poengsum representerer en falsk positivt funn. Vi rapporterer gensettene med en FDR ≤ 0,10 og
P
≤ 0.025.
Kvantitativ Real Time PCR
Differensial uttrykk av tre gener ble validert ved QRT-PCR. For dette formål, ble RNA prøver inkludert i cDNA mikromatriseanalyse anvendt. I tillegg ble to uavhengige eksperimenter utført hvori HMEC-1 ble utsatt for cisplatin og bleomycin i henhold til de «akutte» -exposure innstilling. RNA-prøvene ble isolert etter 6, 24 og 48 timer eksponering mot de stoffer (S1A fig.). Alle RNA prøvene var DNase behandlet for å eliminere genomisk DNA-forurensning, og deretter, RNA ble revers transkribert til cDNA. QRT-PCR ble utført ved anvendelse av Applied Biosystems TaqMan analyser, i henhold til produsentens protokoll. Master Mix, primere og TaqMan prober ble kjøpt fra Applied Biosystems (Nieuwerkerk a /d IJssel, Nederland). Tre gener, med svært ulike uttrykk i tre av fire eksperimentelle innstillinger, ble ansett som troverdige kandidater for QRT-PCR validering. Genene og deres respektive TAQMAN genuttrykk analyse tallene var veksten Differensiering Factor 15 (
GDF-15;
Hs00171132_m1), aktivere transkripsjonsfaktor 3 (
ATF3;
Hs00231069_m1), amfiregulin (
AREG;
Hs00155832_m1); i tillegg ekspresjon av husholdningsgenet glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
; Hs02758991_g1) ble bestemt. Alle forsøk ble utført in triplo ved bruk av ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System, med følgende veksling: 2 minutter ved 50 ° C, 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Relativ mengde av målgener ble beregnet ved å dividere gjennomsnittlig syklus terskel (CT) for det aktuelle genet ved middelverdien CT-verdi for husholdningsgenet
GAPDH
. Relative uttrykk-forskjeller ble beregnet ved å sammenligne ekspresjon til referansetidspunktet, (t = 6, S1A fig.). Tosidig t-test ble brukt for å sammenligne forskjeller i uttrykk. P-verdier 0,05 ble ansett for å indikere en betydelig forskjell.
GDF-15 proteinnivåer i testikkelkreft pasient plasma under og etter bleomycin- og cisplatin-basert kjemoterapi
Å klinisk validere funnene fra cellelinjen modellen, brukte vi en kohort av 41 pasienter med testikkelkreft som deltok i en prospektiv studie på tidlig kjemoterapi-relaterte kardiovaskulære endringer under bleomycin- og cisplatin-baserte regimer. Pasienter med behov for studien hadde metastatisk testikkelkreft, var 18-50 år gammel, og ble mottatt første linjen cisplatin-basert kjemoterapi ved University Medical Centre Groningen, Nederland. Eksklusjonskriterier var tidligere kjemoterapi eller strålebehandling, tilstedeværelse av CVD, bruk av erytropoietin og glomerulær filtrasjonshastighet 60 ml /min. Den lokale etiske komiteen godkjent studiet, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Avhengig av deres International Germ Cell Cancer Collaborative Group (IGCCCG) prognose gruppe, fikk pasientene enten tre eller fire BEP kurs som varer 3 uker hver (bleomycin-30 USP, dager 2, 8 og 15; etoposid-100 mg /m
2 , dag 1-5) og cisplatin-20 mg /m
2, dag 1-5). I løpet av de første 6 dagene pasienter ble hydrert med 4 L NaCl 0,9% /dag og fikk daglig antiemetisk terapi (deksametason, ondansetron). Blodprøver ble tatt på dag 1, 8 og 15 av den første kjemoterapi kurs, dag 1 og 8 av den andre og tredje kurs, (C1D1 (= grunnlinje), c1d8, c1d15, c2d1, etc.), en måned etter fullføring og ett år etter oppstart av kjemoterapi. EDTA-plasma ble serie samlet inn og lagret i -20 ° C inntil analyse. Referansedata ble hentet fra friske mannlige søsken av voksne barndommen kreft overlevende, som hadde deltatt som forsøkspersoner i en tverrsnittsstudie på slutten av kardiovaskulære følgetilstander av behandling for kreft hos barn [24]. Ut av disse friske mannlige søsken, ble en kontrollgruppe med en sammenlignbar median alder som pasienter med testikkelkreft valgt. Målinger i kontrollene ble utført som beskrevet ovenfor
Plasma GDF-15-proteinnivåer ble bestemt ved sandwich-enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) med et kommersielt tilgjengelig kit (R den Wilcoxons signert rank test ble brukt for parede endringer. Tosidige P-verdier ≤ 0,05 ble ansett å indikere betydning, ble SPSS programvarepakke versjon 22 (SPSS Inc., Chicago, IL) som brukes.
Resultater
cDNA microarray
klasse sammenligning. Topp 50 på de fleste differensielt uttrykte gener i «akutt» og «kronisk» eksponeringsinnstilling for bleomycin og cisplatin er oppsummert i tabell 1. Fig. 1 viser et Venn-diagram av de overlappende gener i de 50 beste er av de fire forskjellige eksponeringsinnstillinger. Fra denne analysen tre gener, f.eks
GDF-15
,
ATF3 Hotell og
AREG
, ble funnet i topp 50 på tre av fire eksponeringsinnstillinger. På grunn av denne overlappingen i de ulike eksponeringsinnstillinger vurderte vi disse tre genene plausible kandidater, og valgte disse for validering av QRT-PCR.
cDNA microarray-GSEA. Pathways beriket med en FDR ≤ 0,10 og
P
≤ 0.025 i GSEA er oppsummert i tabell 2. I «akutt» -exposure innstillingen til bleomycin ble seks baner beriket (alle oppregulert), mens ingen trasé ble beriket i «kronisk» innstilling med de fastsatte kriteriene for FDR. Cisplatin eksponering førte til 12 anrikede baner i «akutte» -exposure innstillingen (oppregulert n = 3, nedregulert n = 9), mens seks banene ble anriket i «kronisk» -exposure innstilling (alle nedregulert). The «p53» og «type I diabetes mellitus «gensettene anriket i tre av fire eksponeringsinnstillinger; gener som inngår i dette genet sett er oppsummert i S1 tabell.
QRT-PCR
For å validere endringer i uttrykket av
GDF-15
,
ATF3 Hotell og
AREG
QRT-PCR ble utført. I «akutt» -exposure innstilling, mRNA-uttrykk av alle tre gener økt i tid etter eksponering for bleomycin og cisplatin, i samsvar med microarray data. Etter 48 timers eksponering for begge legemidler, mRNA-ekspresjon av alle tre gener, var signifikant høyere sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Ingen endring i mRNA uttrykk av disse tre genene skjedde i ubehandlede kontrollceller i tid (fig. 2).
Plasma GDF-15 proteinnivåer i testikkelkreft pasienter behandlet med BEP-kjemoterapi
Basert på data fra litteraturen vi valgte GDF-15 for ytterligere validering på proteinnivået i plasma av testikkelkreft pasienten under og etter behandling, og relaterte GDF-15 nivåer til kjente plasma endothelial skade biomarkører (vWF, hsCRP) [25 , 26]. Baseline karakteristika for pasientene er oppsummert i tabell 3. Selv om kort fra signifikans (p = 0,06), basislinje (dvs. før oppstart av kjemoterapi) GDF-15 proteinnivåer i pasienter med testikkelkreft var ikke forskjellig fra friske alderstilpassede hanner (fig. 3A). Pasienter i IGCCCG god prognose gruppen hadde noe lavere baseline GDF-15 proteinnivåer enn pasienter i middels eller dårlig prognose grupper (god prognose: median 362,9 pg /ml (variasjon 197,6 til 1059,5, n = 33), middels /dårlig prognose: median 689,1 pg /ml (variasjon 186,8 til 1935,0, n = 8);
P
= 0,04). Median baseline GDF-15 nivå var ikke relatert til tumor stadium (stadium 2 sykdom: median 373,0 pg /ml (variasjon 197,6 til 1935,0, n = 30), stadium 3 og 4, sykdom: median 486,4 pg /ml (variasjon 186,8 til 1875,9; n = 11);
P
= 0,40). Pre-kjemoterapi GDF-15 protein nivåer var ikke relatert til alder (r
s = 0,08;
P
= 0,61).
A. Plasma GDF-15 proteinnivået hos pasienter med metastatisk testikkelkreft (n = 41) før start av bleomycin- og cisplatin-basert kjemoterapi, sammenlignet med friske alderstilpassede menn (n = 10); B. Plasma GDF-15 protein nivåer før, under og etter gjennomføring av bleomcyin- og cisplatin-basert kjemoterapi for testikkelkreft. Prøven på C1D1 blir trukket før oppstart av kjemoterapi. (*) P 0,05 sammenlignet med baseline verdi eller angitt tid-punkt.
I løpet av BEP-kjemoterapi, GDF-15 protein nivåer økt sammenlignet med baseline, med betydelig høyere nivåer 1 måneder og ett år etter kjemoterapi ( fig. 3B, tabell 4). Sammenlignet med pre-kjemoterapi, plasmanivåer av vWF og hsCRP endret seg betydelig i løpet av behandlingen (tabell 4). Etter fullføring av kjemoterapi, vWF-nivåer forble vedvarende forhøyet, mens hsCRP tilbake til pre-kjemoterapi verdier. Ved studiestart, ble nivåene av GDF-15 relatert til nivåene av vWF (r
s = 0,35;
P
= 0,03) og hsCRP (r
s = 0,39;
P
= 0,014). Under kjemoterapi, nivåer av GDF-15 korrelert med hsCRP på c1d8 (r
s = 0,44;
P
= 0,01) og med vWF på c3d8 (r
s = 0,40;
P
= 0,017). På oppfølgings besøk en måned etter avsluttet kjemoterapi, ble nivåene av GDF-15 og vWF sterkt korrelert (r
s = 0,56;
P
= 0,001), mens dette forholdet ble ikke funnet GDF-15 og hsCRP (r
s = 0,18;
P
= 0,28). Ett år etter oppstart av kjemoterapi, ingen sammenheng mellom GDF-15 nivåer og vWF eller hsCRP (r
s = 0,28;
P
= 0,12; r
s = 0,10;
P
= 0,57) ble funnet.
Diskusjoner
i denne studien brukte vi en objektiv translasjonsforskning tilnærming med cDNA microarray som et verktøy for å finne nye mekanismer knyttet til og velge kandidat biomarkører involvert i kjemoterapi-indusert endotel-skade. Med dette
in vitro
strategi, fant vi flere enkeltgener med betydelige endringer i uttrykk ved eksponering til bleomycin og cisplatin. Tre gener med sterke uttrykk forskjeller i tre av fire eksperimentelle innstillinger,
GDF-15
,
ATF3 Hotell og
AREG
, ble validert ved QRT-PCR. I tillegg GSEA avslørte klynger av gener som er involvert i flere veier, inkludert «p53» og «Type I diabetes mellitus» gensettene, som ble påvirket på denne modellen. Videre viste vi at BEP-kjemoterapi. (Bleomycin, Etoposide; Cisplatin) gjorde faktisk påvirke plasma GDF-15 proteinnivåer i pasienter med testikkelkreft, og at disse nivåene er relatert til kjente endothelial skade biomarkører som vWF og hsCRP
i enkelt gen analysen flere gener ble signifikant forskjellig uttrykt i de ulike eksperimentelle innstillinger i HMEC-en
in vitro
modell. Genene
GDF-15
,
ATF3 Hotell og
AREG
var i topp 50 er av de fleste differensielt uttrykte gener i tre eller fire eksponeringsinnstillinger.
cytokin GDF-15 (også kjent som Macrophage hemmende cytokin 1 (MIC-1) eller NSAID aktivert genet (NAG-1)) er et medlem av transformerende vekstfaktor β (TGFB) familie. GDF15 er forårsaket av alle slags stimuli inkludert cytokiner, kjemo- og /eller strålebehandling og skader i alle slags forskjellige celler og vev [27-30]. Frigjøring av GDF-15 kan indusere anti-inflammatorisk, anti-apoptotiske og anti-proliferative virkninger, og dermed utøve vasculoprotective mekanismer. Derfor kan en økning i GDF-15 plasmanivåer i vår pasient kohort godt resultat av økt produksjon av endoteliale celler og /eller makrofager, for å kompensere for kjemoterapi-indusert skade. I en studie som evaluerte genuttrykk endringer i prostatakreftprøver før og etter docetaxel /mitoxantrone behandling,
GDF-15
var en av høyeste oppregulert gener etterbehandling [31], som illustrerer at cytostatika kan påvirke
GDF-15
ekspresjon i både maligne og ikke-maligne celler.
Forhøyede nivåer av GDF-15 har blitt assosiert med øket risiko for sykdommer hypoteser å skyldes kronisk inflammasjon [29, 32] og rekke studier viste at GDF-15 er et verdifullt biomarkør for kardiovaskulær sykdom [29, 30, 32-34]. GDF-15 er tenkt å spille en relevant rolle i hjerte-skade svar [35], eventuelt gjennom en pro-angiogen respons som ble demonstrert i en pre-klinisk modell med HUVEC [36]. GDF-15 er også beskrevet som biomarkør /prediktor av albuminuri, som er kjent for å reflektere etablerte mikro vaskulære skader [37]. I tillegg er flere studier implisere GDF-15 i aspekter av metabolske forstyrrelser f.eks insulinresistens og fedme [30, 38, 39]. Nylig, høyere nivåer av sirkulerende MIC-1 /GDF-15 ble også assosiert med økt risiko for tykktarmskreft støtte en rolle av kronisk betennelse i utviklingen av tykktarmskreft [40].
ATF3
er en nedstrøms medlem av MAP-kinase signalveien som koder for en kjernefysisk faktor som stimulerer transkripsjon ved cellulært stress. Fast oppregulering av
ATF3
er en sentral stressrespons i forskjellige endoteliale cellemodeller, indusert ved hjelp av forskjellige skadelige stimuli [41-46]. Interferens med
ATF3
-levels beskyttede celler fra apoptose induksjon, f.eks indusert av TNFa i HUVEC [47], av cisplatin i en human glioblastoma cellelinje [42], eller i forbindelse med doxorubicin i cardiomyocytes [48]. Interessant, immunohistochemically målt
ATF3
ekspresjon økes i aterosklerotiske områdene menneskebekkenarteriene [43]. Få studier adressert
AREG
, et medlem av epidermal vekstfaktor-reseptorer som spiller en viktig rolle i cellulær proliferasjon og overlevelse. Brystkreft celler eksponert for cisplatin utskilt den AREG-protein over lengre tid, dvs. opp til 72 timer etter utredning [49].
Basert på tilgjengelige data vi bestemte oss for å studere plasma protein nivåer av GDF-15 i testiklene kreftpasienter før, under og etter behandling med BEP-kjemoterapi, og relaterer endringer i nivåene av kjente endotelial skade biomarkører [25, 26]. Økningen i GDF-15 gjennom behandling samt post-kjemoterapi kan delvis knyttet til kreft-relaterte mekanismer, som GDF-15 protein nivå wasslightly høyere hos pasienter med mer avansert sykdom stadium målt ved IGCCCG poengsum, som kan relateres til å frigi av GDF-15 fra apoptotiske tumorceller. Imidlertid er dets rolle i endotelial skade som støttes av det faktum at GDF-15 nivåer korrelerte med proteiner som er kjent for å reflektere kjemoterapirelatert endotelial skade i pasienter med testikkelkreft, vWF og hsCRP [25, 26]. Derfor er det tenkelig at den observerte økningen i plasma GDF15 er involvert i kjemoterapi-relatert endotelial skade, men det er sannsynligvis ikke skyldes endotelial skade alene. Når dette proteinet blir mekanistisk relatert til kjemoterapi-relatert endotelial skade kan det være et potensielt følsom biomarkør for deteksjon av disse skadene. Videre utvidet analyse av GDF15 nivåer i kombinasjon med fenotyping av kardiovaskulære risikofaktorer i en større kohort av pasienter er berettiget. Selv om det i denne studien ingen sammenheng ble funnet mellom nivåene før behandling av GDF15 og alder, er det kjent at dette er tilfelle i den vanlige befolkning, og bør tas i betraktning ved analyse av GDF15 nivåer i tid. Dessuten kan det faktum at TGFp-reaksjonsveien er involvert i denne skaden være en ledetråd til inngrep som reduserer mengden av endotelial skade relatert til behandling med bleomycin og cisplatin.
GSEA viste signifikant anriket på flere veier, inkludert «p53» og «type i diabetes mellitus «i» akutt «eksponering for bleomycin og cisplatin, og» kronisk «eksponering for cisplatin. Oppdagelsen av at p53 relaterte gener ble påvirket av bleomycin samt cisplatin viser gyldigheten av vår tilnærming, som både narkotika utøve sin nøkkel terapeutiske effekten av cellulær apoptose induksjon. Den beriket «Type I Diabetes Mellitus «gen sett inneholder flere gener involvert i inflammatoriske prosesser, f.eks Human leukocytt-antigen-molekyler, interleukiner og TNF, hvilket indikerer at bleomycin og cisplatin indusere en inflammatorisk respons i endotel-celler. Dette funnet er helt i tråd med studier i testikkelkreft pasienter behandlet med cisplatin-baserte regimer, som viste høyere forekomst av systemisk betennelse og endothelial dysfunksjon [25, 26, 50]. Som sirkulerer platina fortsatt påvises i opplags år til tiår etter cisplatin behandling [51-52], kan langtids testikkelkreft overlevende vel ha løpende vaskulære skader og kronisk lavgradig endothelial betennelse. Når kroniske betennelsesresponser vise seg å være en viktig sykdomsfremkallende faktor for utvikling av kjemoterapi-indusert endotelial skade, er intervensjon med anti-inflammatorisk narkotika en begrunnelse tilnærming for å lindre disse effektene.
I konklusjonen, vi utnyttet cDNA microarray til oppdage på en saklig måte gener og gangstier i forbindelse med kjemoterapi-relaterte endothelial skade, for å finne biomarkører for og mekanismene som er involvert i denne skaden. I HMEC-en utsettes for bleomycin og cisplatin, ble flere gener sterkt uttrykt forskjellig, f.eks
GDF-15
,
ATF3 Hotell og
AREG
. I GSEA, ble klynger av gener som er involvert i celledød og betennelse påvirket. De observerte endringene i plasma GDF-15 proteinnivåer i pasienter med testikkelkreft indusert av cisplatin- og bleomycin-holdig kjemoterapi indikerer at denne informative pre-klinisk tilnærming kan oversettes til en klinisk setting, og at GDF-15 kan være en potensiell biomarkør for interesse som er mekanistisk involvert i kjemoterapi-relatert sunt vev skader slik som endotelial skade. Videre
in vitro Hotell og
in vivo
leting er garantert. Dette forenkler begrunnelsen mot valg av mål for intervensjon, med tidlig surrogat biomarkører for kjemoterapi-relaterte endothelial skader.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Eksperimentell design.
A. «Akutt» eksponeringsinnstillinger: udødeliggjort HMEC-en ble utsatt for bleomycin (0,3 mikrogram /ml (IC50), 1,5 mg /ml (IC90)) eller cisplatin (2,6 mikrometer (IC50), 12,9 mikrometer (IC90)) for 6, 24 og 48 timer; B. «kronisk» eksponeringsinnstilling: i løpet av 30 dager HMEC-en ble utsatt til 0,06 mg /ml bleomycin (IC10) eller 0,52 mikrometer cisplatin (IC10) to ganger ukentlig). I begge forsøk ubehandlede prøver tjente som kontroller. (*) RNA-isolering og cDNA microarray eksperimenter; (†) RNA isolering og QRT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115372.s001 plakater (TIF)
S1 Table. Gener som inngår i «p53» og «type I diabetes mellitus «gensettene i KEGG database, rangeres i alfabetisk rekkefølge
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115372.s002 plakater (DOC)
takk
Vi takker Kevin Bouma, Gert jan Meersma, Haukeline Volders og Nynke Zwart for deres teknisk assistanse og for innsamling av pasientprøver.
